Summary
Coloração do anticorpo
Abstract
A Drosophila abdômen pupal é um sistema modelo estabelecido para o estudo da morfogênese epitelial e desenvolvimento de morfologias sexualmente dimórfico 1-3. Durante a pupação, que se estende por aproximadamente 96 horas (a 25 ° C), as populações de proliferação das células da epiderme imaginal substituir larval para gerar os segmentos adulto abdominal. Estas células imaginal, nascido durante a embriogênese, existem como pares laterais de ninhos histoblast em cada segmento abdominal das larvas. Quatro pares de ninhos histoblast dar lugar à cutícula do adulto dorsal (anterior e posterior ninhos dorsal), a cutícula ventral (ninhos ventral) e os espiráculos associados a cada segmento (ninhos espiráculo) 4. Após puparation, essas células diplóides (distinguíveis pelo tamanho da maior poliplóide larval células epidérmicas-LECs) iniciar um processo estereotipada da migração, proliferação e substituição da LECs. Várias ferramentas moleculares e genéticos podem ser empregados para investigar as contribuições dos caminhos genéticos envolvidos na morfogênese do abdômen adulto. Fenótipos adultos final são tipicamente analisados dissecção seguintes adulto cutículas abdominal. No entanto, a investigação dos processos moleculares subjacentes requer análises imuno-histoquímico do epitélio pupal, que apresentam desafios únicos. Temporalmente morfogênese dinâmica e as interações de duas populações distintas epiteliais (larval e imaginal) geram um tecido frágil propensos à perda excessiva de células durante a dissecção e processamento subseqüente. Nós desenvolvemos métodos de dissecação, fixação, montagem e criação de imagens do epitélio pupal abdominem Drosophila para estudos de imuno-histoquímica que geram amostras consistentes de alta qualidade adequado para confocal ou padrão de microscopia fluorescente.
Protocol
1. 1 dia
Antes de começar:
Uma população saudável de moscas devem ser mantidas utilizando protocolos padrão de cultura: remove adultos a partir de garrafas ou frascos após 3-4 dias de ovo a postura e permitir o desenvolvimento de proceder a uma temperatura constante até vagando 3 de larvas iniciam pupariation. A transição de larva / pupa é marcado pela formação da pré-pupa (considerado 0 horas após a formação do pupário APF). Pupas imóvel se distinguem dos mais velhos pupas por sua coloração branca e de larvas que ainda não começaram pupariation por seus oblongo, forma arredondada e protrusão do espiráculos anterior.
Você vai precisar de:
- Um pincel para a recolha de pupas
- A câmara úmida por pupas de cultura: A placa de Petri forrada com papel toalha umedecido e coberto com papel de filtro marcado para os pontos de tempo diferentes do genótipo coleção, ou o sexo das pupas
- Fosfato 1X solução salina tamponada (PBS) para lavar pupas
Pupas cultura de coleta, e estadiamento
- Usando um pincel molhado remover suavemente 0hr APF pupas de garrafas de cultura / frascos e coloque-os na tampa da câmara úmida.
- Usando o pincel e 1X PBS lavar cuidadosamente as pupas para remover detritos do caso pupa
- Se necessário, o tipo pupas por sexo. Os primórdios das gônadas de pupas pode ser usado para classificar os sexos. Os primórdios das gônadas masculinas são um par de discos laterais translúcidas facilmente visto através da cutícula pupal aproximadamente 2 / 3 abaixo do comprimento do corpo 5. Os primórdios das gônadas femininas são menores e não tão facilmente identificados.
- Coloque as pupas na posição devidamente rotulados na câmara úmida e voltar à temperatura constante. Cultura ao ponto momento apropriado de desenvolvimento.
2. Dia 2: Dissecção de fixação, e incubação do anticorpo primário
Antes de começar:
Você vai precisar de:
- Estereomicroscópio dissecção
- Pinça cirúrgica
- Bisturi cirúrgico com o número 11 lâminas
- Dois de nove pratos de vidro bem depressão (Corning produto # 7220-85)
- Preencha poços de um prato com 1X PBS: Este é o prato de lavagem para a limpeza de pupas dissecadas
- Preencha poços de segundo prato com tampão de fixação
- Câmara úmida para incubação de anticorpos. Nós usamos caixas de plástico selável sanduíche forrada com papel-toalha umedecido.
- Buffer de fixação: 1x PBS, paraformaldeído 4%, 0,2% de ácido deoxicólico (para permeabilização)
- Plataforma de dissecção: lâmina de microscópio Limpar com um pedaço de fita dupla face adere a um dos lados
- 1X PBS
- p100 ou p200 pipetador
Dissecação
- Utilizando uma pinça remova cuidadosamente uma pupa de cada vez e coloque-os sobre a plataforma de dissecção com a extremidade anterior do pupas de frente para a maior largura da fita. Se pupas são excessivamente molhada, primeiro blot-os secar com uma toalha de papel.
- Antes de as pupas foram completamente aderida à fita, use um pincel para posicioná-los.
- Permitir que as pupas secar ao ar e aderem à fita (5-10 minutos)
- Com o bisturi cirúrgico dissecar cada pupas bilateralmente. Este é o melhor feito com um único corte rápido da anterior para a extremidade posterior da pupa. Se feito corretamente, o corte será bisect pares anterior e posterior espiráculos. Dissecar não mais de 10 pupas de cada vez como lavagem e limpeza das amostras rapidamente é necessário para evitar danos proteolíticas para o tecido.
- Usando um pincel, transferir uma pequena quantidade de 1X PBS a cada pupas dissecadas para soltá-las a partir da fita.
Fixação de limpeza, e incubação do anticorpo primário
- Com um par de pinças cirúrgicas agarrar um meia pupa individuais anteriormente e imediatamente mergulhe em um poço de lavar o prato. A plataforma de dissecção deve ser substituído por o prato de lavagem no palco microscópio. O caso pupas devem ser deixados sobre a amostra até que o processamento está completo e as amostras estão prontas para montagem.
- Enquanto ainda segurando a meia pupa use uma pipeta suavemente para lavar o tecido interno do abdômen. Muita pressão durante a lavagem pode levar à perda de células epiteliais.
- Transferir imediatamente a metade pupa limpa para o buffer de fixação à temperatura ambiente e processo as metades restantes pupa da mesma forma. Com dissecção prática, e de lavagem de 20 metades pupa deve levar menos de 5 minutos.
- Permitir pupas para incubar em tampão de fixação em temperatura ambiente por 1 (uma) hora.
- Enxágüe fixos pupas 3x cinco minutos em PBS 1X
- As amostras podem ser imediatamente processadas para imunohistoquímica ou podem ser armazenados em etanol a 100% a -20 ° C por até 3 meses sem perda de células ou reatividade epítopo.
- Para armazenar amostras, equilibrar as amostras através de uma diluiçãosérie de PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) à temperatura ambiente por 20 minutos em cada diluição antes de transferir até 100% EtOH.
- As amostras devem ser re-equilibrados em PBS através da série de reverter antes do processamento de imuno-histoquímica.
- Bloco de amostras em 1x PBS (suplementado com 2% de albumina bovina sérica) para 1 (uma) hora antes da adição do anticorpo primário.
- Incubar com anticorpo primário diluído a concentração adequada em 1X PBS durante a noite a 4 ° C sem balançar.
3. Dia 3: a incubação do anticorpo secundário, a montagem ea imagem
Antes de começar:
Você vai precisar de:
- Duas pinças cirúrgicas
- Meios de montagem (glicerol, Vectashield [Vector Labs], ou Slowfade Ouro [Invitrogen])
- Slides depressão bem microscópio (0,8 mm)
- Lamelas (24 x 40 mm)
Incubação do anticorpo secundário e montagem:
- Lavar as amostras de 10 minutos cada um com 3x 1x PBS
- Bloco de amostras em 1x PBS (suplementado com 2% de albumina bovina sérica) para 1 (uma) hora antes da adição do anticorpo secundário.
- Incubar com anticorpo secundário diluído a concentração adequada em 1X PBS a temperatura ambiente no escuro sem balançar por 3 (três) horas.
- Lavar as amostras de 10 minutos cada um com 3x 1x PBS
- Se for o caso, para contraste pupas (Exemplo nós mancha núcleos com DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] diluído em PBS durante 10 minutos).
- Equilibrar as amostras (mínimo de 30 minutos) em mídia apropriada antes da montagem.
- Prepare uma lâmina de amostra. A morfologia das pupas impede de montagem plana. Amostras são montados no poço de uma lâmina de depressão (slide drop) para geração de imagens. Lugar de 75 100ul de meios de montagem na depressão também. Várias amostras podem ser montados em um único slide.
- O caso pupa deve ser removido das amostras antes da montagem. Segure um caso pupa individuais anteriormente tendo a certeza de não compreender a membrana interna pupal.
- Com um segundo par de fórceps gentilmente compreender a membrana interna pupal pela cabeça e removê-lo do caso pupal.
- Transferir imediatamente a amostra para a depressão bem e continuar o processamento de amostras adicionais.
- Usando uma posição da sonda ou pinça as amostras uniformemente na depressão bem com a superfície lateral voltada para cima. Bolhas de ar ocasionais podem ser removidos com uma sonda.
- Abaixe suavemente a lamínula sobre as amostras tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar
4. Resultados representativos:
Amostras preparadas usando este protocolo reter a morfologia bruta do abdômen adulto. Pilhas de imagens podem ser projetadas para gerar uma imagem bidimensional ou 3-D de renderização pode ser aplicado para investigar topologia abdômen.
Figura 1. Produtos segmentação gene em Drosophila pupas de proteínas e expressão Wingless Engrailed (En-gal4: uas-GFP). Foram visualizados em 26 horas após a formação pupário (APF) com o mouse anti-Wg (4D4: Iowa Hibridoma Bank) e anti-GFP. Ampliação de 10x, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. Núcleos com DAPI foram contra.
Pilhas de cerca de 50 imagens (ΔZ entre fatias é 2.5μm) foram projetados.
Discussion
As técnicas apresentadas neste vídeo pode ser usado para preparar Drosophila pupas de uma variedade de pontos de tempo de desenvolvimento. Pupas processadas durante o período de 24 horas a 32 horas APF APF são mais propensas a perda de células do epitélio. O uso de detergentes (como Triton X-100 e Tween-20) durante as etapas de incubação prolongado aumenta a probabilidade de perda de células e não é recomendada. Pelo contrário, ácido deoxicólico é usado como um detergente durante a etapa de fixação inicial. Todas as etapas subseqüentes são realizados em 1X PBS sem detergente. Além disso, balançando amostras durante as etapas de incubação prolongado aumenta a perda de células e devem ser evitados.
As amostras podem ser fotografada usando técnicas de microscopia confocal. No entanto, Drosophila pupas processado como descrito também pode ser fotografada usando um sistema de microscopia de iluminação estruturada produzindo qualidade de imagem comparável às técnicas confocal.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
