Summary
Antikropp färgning av
Abstract
Den Drosophila PUPP-buken är ett etablerat modellsystem för att studera epiteliala morfogenes och utveckling av sexuellt dimorfa morfologier 1-3. Under pupation, som sträcker sig över cirka 96 timmar (vid 25 ° C), förökar populationer av imaginal celler ersätter larver överhuden för att generera den vuxna buken segment. Dessa imaginal celler, född under fosterutvecklingen, finns som lateral par histoblast bon i varje buken segment av larver. Fyra par histoblast bon ger upphov till den vuxna rygg nagelband (främre och bakre rygg-bon), den ventrala nagelband (ventrala bon) och spiracles i samband med varje segment (spiracle bon) 4. Vid puparation dessa diploida celler (som kan särskiljas efter storlek från de större polyploida larver epidermala celler-LECS) påbörja en stereotyp process av tillväxt, migration och utbyte av LECS. Olika molekylära och genetiska verktyg som kan användas för att undersöka bidrag genetiska vägar inblandad i morfogenes av den vuxna buken. Ultimate vuxna fenotyper är vanligtvis analyseras efter dissektion av vuxna buken nagelband. Kräver dock utredning av de bakomliggande molekylära processer immunhistokemisk analyser av PUPP-epitel, som innebär unika utmaningar. Tidsmässigt dynamisk morfogenes och växelverkan av två olika epiteliala populationer (larver och imaginal) genererar en ömtålig vävnad benägna att alltför cell förlust under dissekering och efterföljande behandling. Vi har utvecklat metoder för dissektion, fixering, montering och avbildning av Drosophila PUPP-abdominem epitel för immunhistokemisk studier som genererar en jämn och hög kvalitet prover lämpar sig för konfokala eller standard fluorescerande mikroskopi.
Protocol
1. Dag 1
Innan du börjar:
En frisk befolkning av flugor bör upprätthållas med hjälp av vanliga odling protokoll: ta bort vuxna från flaskor eller ampuller efter 3-4 dagar av ägg-lay och tillåta utvecklingen kan fortsätta på en konstant temperatur tills vandrande 3: e INSTAR larver initiera pupariation. Den larver / PUPP-övergång markeras av bildandet av prepupae (betraktas 0 timmar efter puparium bildandet-APF). Orörliga puppor skiljer sig från äldre puppor av sin vita färg och från larver som ännu inte har börjat pupariation av sina avlånga och avrundade formen och deformation främre spiracles.
Du behöver:
- En pensel för att samla puppor
- En fuktig kammare för odling puppor: en petriskål fodrad med fuktade hushållspapper och täckt med filtrerpapper märkt för olika tidpunkter för insamling, genotyp eller kön puppor
- 1X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för tvättning puppor
Insamling, odling och iscensättning puppor
- Med hjälp av en fuktad pensel och ta försiktigt bort 0hr APF puppor från kultur flaskor / flaskorna och placera dem i locket till fuktiga kammaren.
- Med hjälp av pensel och 1X PBS försiktigt tvätta puppor för att ta bort skräp från puppan fallet
- Om det behövs sortera puppor efter kön. Den gonad primordia av puppor kan användas för att sortera könen. Den manliga gonad primordia är en lateral par genomskinliga skivor lätt ses genom PUPP-nagelbanden ca 2 / 3 ner längden på kroppen 5. Den kvinnliga gonad primordia är mindre och inte lika lätt att identifiera.
- Placera puppor i korrekt märkta position i fuktig kammare och återgå till konstant temperatur. Kultur till lämplig utveckling tidpunkt.
2. Dag 2: Dissection, fixering och primär antikropp inkubation
Innan du börjar:
Du behöver:
- Dissection stereomikroskop
- Kirurgisk pincett
- Kirurgisk skalpell med nummer 11 blad
- Två nio brunnar glas depression rätter (Corning produkt # 7220-85)
- Fyll brunnarna i ett fat med 1X PBS: Detta är sköljning maträtt för rengöring dissekerat puppor
- Fyll brunnar av den andra skålen med fixering buffert
- Fuktkammare för antikropp inkubation. Vi använder plast förseglingsbar smörgås lådor klädda med fuktade hushållspapper.
- Fixering buffert: 1x PBS, 4% paraformaldehyd, 0,2% desoxicholsyra syra (för permeabilization)
- Dissection plattform: Klart objektglas med en bit dubbelhäftande tejp följs åt sidan
- 1X PBS
- P100 eller P200 pipett
Dissection
- Använd pincett försiktigt bort puppor en i taget och placera dem på dissekering plattform med den främre änden av puppor inför det bredaste tejpens bredd. Om puppor är alltför blöt, först utplåna dem torra med hushållspapper.
- Innan puppor har helt anslutit sig till bandet, använd en pensel för att placera dem.
- Låt puppor lufttorka och ansluta sig till bandet (5-10 minuter)
- Med kirurgisk skalpell dissekera varje puppor bilateralt. Detta sker bäst med en enda snabb skurits ut från den främre till den bakre änden av puppor. Om korrekt gjort, kommer den skära HALVERA både bakifrån och framifrån spiracles par. Dissekera inte mer än 10 puppor på en gång så tvätt och rengöring proverna snabbt är nödvändiga för att förhindra proteolytiska skador på vävnaden.
- Med hjälp av en pensel, överföra en liten mängd 1X PBS till varje dissekeras puppor för att lossa dem från bandet.
Rengöring, fixering och primär antikropp inkubation
- Med ett par kirurgisk tång greppa en enskild puppa halv anteriorly och omedelbart doppa den i en brunn på skölja skålen. Den dissektion Plattformen ska ersättas med skölja skålen på mikroskop scenen. Den puppor fall bör lämnas på provet tills behandlingen är klar och prover är klara för montering.
- Medan fortfarande ta tag i puppan halv använd en pipett för att försiktigt tvätta bort den interna vävnaden i buken. För mycket tryck under tvättning kan leda till förlust av epitelceller.
- Överför omedelbart den rena puppan hälften till fixering buffert vid rumstemperatur och bearbeta resterande puppan halvorna på liknande sätt. Med övning, dissektion och tvätt av 20 puppa halvor bör ta mindre än 5 minuter.
- Låt puppor att inkubera i fixering buffert vid rumstemperatur i 1 (en) timme.
- Skölj fast puppor 3x fem minuter i 1X PBS
- Prover kan omedelbart behandlas för immunohistokemi eller kan lagras i 100% etanol vid -20 ° C i upp till 3 månader utan förlust av celler eller epitop reaktivitet.
- För att lagra prover, balansera prov genom en utspädningserie av PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) i rumstemperatur i 20 minuter i varje spädning före överföring till 100% EtOH.
- Proverna skall åter jämvikt i PBS igenom den omvända serien innan bearbetning för immunohistokemi.
- Blockera prover i 1x PBS (kompletterad med 2% bovint serumalbumin) för 1 (en) timme före tillägg av primär antikropp.
- Inkubera med primär antikropp spädas till lämplig koncentration i 1X PBS över natten vid 4 ° C utan att gunga.
3. Dag 3: sekundär antikropp inkubation, montering och bildhantering
Innan du börjar:
Du behöver:
- Två kirurgisk tång
- Montering media (glycerol, Vectashield [Vector Labs] eller Slowfade Guld [Invitrogen])
- Depression och objektglas (0,8 mm)
- Täckglas (24 × 40 mm)
Sekundär antikropp inkubation och montering:
- Tvätta prover 3x 10 minuter vardera med 1x PBS
- Blockera prover i 1x PBS (kompletterad med 2% bovint serumalbumin) för 1 (en) timme före tillägg av sekundär antikropp.
- Inkubera med sekundär antikropp spädas till lämplig koncentration i 1X PBS vid rumstemperatur i mörker utan att gunga för 3 (tre) timmar.
- Tvätta prover 3x 10 minuter vardera med 1x PBS
- Om det är lämpligt motfärg puppor (Exempel vi fläcken kärnor med DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] spätts i PBS i 10 minuter).
- Jämvikta prov (minst 30 minuter) i lämpliga media innan montering.
- Bered ett prov bild. Morfologi av puppor förhindrar platt montering. Prover monteras i brunnen av en depression bild (drop bild) för avbildning. Placera 75-100ul att montera media i depressionen väl. Flera prover kan monteras på en enda bild.
- Den puppa fall måste tas bort från proverna innan montering. Fatta ett enskilt puppa fall anteriorly vara säker på att inte förstå de interna PUPP-membranet.
- Med en andra pincett försiktigt tag i den interna PUPP-membranet av chefen och ta bort den från PUPP-fallet.
- Omedelbart överföra provet till depressionen väl och fortsätta att bearbeta ytterligare prover.
- Med hjälp av en sond eller pincett placera prover jämnt i depressionen väl med den laterala ytan uppåt. Enstaka luftbubblor kan tas bort med en sond.
- Lägg försiktigt ner täckglas på proverna noga med att inte införa luftbubblor
4. Representativa resultat:
Prover som prepareras med detta protokoll bibehålla de grova morfologi av den vuxna buken. Bild stackar kan förväntas generera en tvådimensionell bild eller 3D-rendering kan tillämpas för att undersöka buken topologi.
Figur 1. Segmentering genprodukter i Drosophila puppor vinglösa protein och Engrailed uttryck (En-gal4: UAS-GFP). Var visualiseras på 26 timme efter puparium bildning (APF) med mus-anti-WG (4D4: Iowa Hybridoma banken) och anti-GFP. 10x förstoring, är främre vänster och rygg är upp. Nucleii var counterstained med DAPI.
Högar av cirka 50 bilder (ΔZ mellan skivor är 2.5μm) var beräknat.
Discussion
De tekniker som presenteras i denna video kan användas för att förbereda Drosophila puppor från en mängd av utvecklingsstörningar tidpunkter. Puppor behandlas under 24 timmar APF till 32 timmar är APF mest utsatta för cell förlust från epitelet. Användningen av rengöringsmedel (t.ex. Triton X-100 och Tween-20) under längre inkubering steg ökar sannolikheten för att cellen förlust och rekommenderas därför inte. Snarare är desoxicholsyra syra används som rengöringsmedel under den inledande fixering steg. Alla efterföljande stegen utförs i 1X PBS utan rengöringsmedel. Dessutom gunga prover under längre inkubationstid steg ökar cell-förlust och bör undvikas.
Prover kan avbildas med konfokalmikroskopi tekniker. Men Drosophila puppor behandlas som beskrivs kan också avbildas med ett strukturerat system belysning mikroskopi ger bildkvalitet jämförbar med konfokala tekniker.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
