Summary
Colorazione degli anticorpi della
Abstract
L'addome Drosophila pupa è un sistema modello stabilito per lo studio della morfogenesi epiteliale e lo sviluppo di dimorfismo sessuale morfologie 1-3. Durante impupamento, che si estende su circa 96 ore (a 25 ° C), le popolazioni di cellule proliferanti immaginale sostituire l'epidermide larvale per generare i segmenti addominali adulto. Queste cellule immaginale, nato durante l'embriogenesi, esistono come coppie di laterali di nidi histoblast in ogni segmento addominale delle larve. Quattro paia di nidi histoblast dar luogo alla cuticola adulti dorsale (nidi dorsale anteriore e posteriore), la cuticola ventrale (nidi ventrale) e gli spiracoli associati a ciascun segmento (nidi spiraglio) 4. Su puparation, queste cellule diploidi (distinguibili in base alle dimensioni dal più grande poliploidi larvale cellule epidermiche-LEC) avviare un processo stereotipata di proliferazione, migrazione e sostituzione del LEC. Vari strumenti molecolari e genetici possono essere utilizzati per indagare i contributi di percorsi genetici coinvolti nella morfogenesi del ventre adulto. Fenotipi adulti finale sono tipicamente analizzati i seguenti dissezione degli adulti cuticole addominale. Tuttavia, dall'indagine dei processi molecolari alla base richiede analisi immunoistochimica dell'epitelio pupa, che presentano sfide particolari. Temporalmente morfogenesi dinamica e le interazioni di due popolazioni distinte epiteliali (larvale e immaginale) generano un tessuto fragile, soggetta a perdita di cellule eccessiva durante la dissezione e l'elaborazione successiva. Abbiamo sviluppato metodi di dissezione, fissazione, montaggio e imaging del abdominem epitelio Drosophila pupa per gli studi immunoistochimici che generano coerente campioni di alta qualità adatto per un microscopio confocale o fluorescenti.
Protocol
1. Giorno 1
Prima di iniziare:
Una popolazione sana di mosche devono essere mantenuti utilizzando protocolli standard di coltura: rimuovere gli adulti da bottiglie o flaconi dopo 3-4 giorni di uova laici e consentire lo sviluppo di procedere ad una temperatura costante fino a vagare 3 ° larve instar avviare pupariation. La transizione larva / pupa è caratterizzato dalla formazione del prepupae (considerato 0 ore dopo puparium formazione-APF). Pupe immobile si distinguono dai vecchi pupe per la loro colorazione bianca e dalle larve che non hanno ancora iniziato pupariation dai loro allungata, la forma arrotondata e protrusione della spiracoli anteriori.
Avrete bisogno di:
- Un pennello per la raccolta delle pupe
- Una camera umida per pupe coltura: una piastra di Petri foderato con un tovagliolo di carta bagnata e ricoperta con carta da filtro marcato per i vari momenti della raccolta, genotipo o il sesso delle pupe
- 1X tampone fosfato salino (PBS) per il lavaggio delle pupe
La raccolta, la coltura e messa in scena pupe
- Utilizzando un pennello bagnato rimuovere delicatamente 0hr APF pupe da bottiglie cultura / fiale e metterli nel coperchio della camera umida.
- Utilizzando il pennello e PBS 1X lavare delicatamente le pupe per rimuovere i detriti dal caso pupa
- Se necessario, specie le pupe per sesso. I primordi della gonade pupe può essere utilizzato per ordinare i sessi. I primordi gonade maschile sono una coppia di dischi laterali traslucidi facilmente visibile attraverso la cuticola pupale circa 2 / 3 per tutta la lunghezza del corpo 5. I primordi gonade femminile sono più piccole e non facilmente identificabili.
- Mettere le pupe in posizione adeguatamente etichettati nella camera umida e tornare a temperatura costante. Cultura al punto di orario appropriato sviluppo.
2. 2 ° giorno: dissezione, la fissazione e l'incubazione dell'anticorpo primario
Prima di iniziare:
Avrete bisogno di:
- Dissezione stereomicroscopio
- Pinze chirurgiche
- Bisturi chirurgico con numero 11 lame
- Due nove e vetro piatti depressione (prodotto Corning # 7220-85)
- Riempire i pozzi di un piatto con PBS 1X: Questo è il piatto risciacquo per la pulizia pupe sezionato
- Riempire i pozzi di secondo piatto con il tampone di fissaggio
- Camera umida per l'incubazione degli anticorpi. Utilizziamo scatole di plastica richiudibile panino foderato con carta da cucina bagnato.
- Fissazione buffer: 1x PBS, paraformaldeide 4%, 0,2% di acido desossicolico (per la permeabilizzazione)
- Dissezione piattaforma: vetrino da microscopio trasparente con un pezzo di nastro biadesivo aderito a un lato
- PBS 1X
- P100 o P200 pipettatore
Dissezione
- Utilizzando pinze delicatamente rimuovere una pupa alla volta e metterli sulla piattaforma dissezione con la fine anteriore delle pupe di fronte alla più ampia larghezza del nastro. Se pupe sono eccessivamente umidi, prima macchia asciugare con un tovagliolo di carta.
- Prima che le pupe hanno completamente aderito al nastro, utilizzare un pennello per posizionarli.
- Lasciare le pupe di aria secca e aderire al nastro (5-10 minuti)
- Con il bisturi sezionare ogni pupe bilateralmente. Questo è meglio realizzato con un unico taglio rapido da anteriore a posteriore la fine delle pupe. Se fatto correttamente, il taglio sarà diviso in parti uguali sia anteriore che posteriore coppie spiracoli. Sezionare non più di 10 pupe in un momento come il lavaggio e la pulizia dei campioni è rapidamente necessaria per evitare danni al tessuto proteolitici.
- Utilizzando un pennello, trasferire una piccola quantità di PBS 1X ad ogni pupe sezionato in modo da separarli dal nastro.
La pulizia, la fissazione e l'incubazione dell'anticorpo primario
- Con un paio di pinze chirurgiche afferrare un mezzo individuale pupa anteriormente e subito immergere in un pozzo del piatto risciacquo. La piattaforma dissezione dovrebbe essere sostituito con il piatto risciacquo sul palco microscopio. Il caso pupe dovrebbero essere lasciati sul campione fino a quando l'elaborazione è completa e campioni sono pronti per il montaggio.
- Mentre ancora afferrare la metà pupa utilizzare una pipetta per lavare via delicatamente il tessuto interno dell'addome. Troppa pressione durante il lavaggio può portare alla perdita di cellule epiteliali.
- Trasferire immediatamente la parte pulita pupa al buffer fissazione a temperatura ambiente e di processo le due metà rimanente pupa in modo simile. Con la pratica, la dissezione e il lavaggio di 20 parti pupa dovrebbe richiedere meno di 5 minuti.
- Lasciare pupe ad incubare nel buffer fissazione a temperatura ambiente per 1 (una) ora.
- Sciacquare fisso pupe 3x cinque minuti in PBS 1X
- I campioni possono immediatamente essere trattati per immunoistochimica o possono essere conservati in 100% etanolo a -20 ° C per un massimo di 3 mesi senza perdita di cellule o di reattività epitopo.
- Per conservare i campioni, campioni equilibrare attraverso una diluizioneserie di PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) a temperatura ambiente per 20 minuti in ciascuna diluizione prima di trasferire il 100% EtOH.
- I campioni devono essere riequilibrati in PBS attraverso la serie inverso prima della lavorazione per immunoistochimica.
- Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo primario.
- Incubare con anticorpo primario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X per tutta la notte a 4 ° C senza dondolo.
3. 3 ° giorno: l'incubazione degli anticorpi secondari, di montaggio e di imaging
Prima di iniziare:
Avrete bisogno di:
- Due pinze chirurgiche
- Mezzi di montaggio (glicerolo, Vectashield [Labs Vettoriale], o Slowfade Oro [Invitrogen])
- Depressione vetrini da microscopio bene (0,8 mm)
- Coprioggetti (24 x 40 mm)
Anticorpi incubazione secondaria e di montaggio:
- Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x
- Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo secondario.
- Incubare con anticorpo secondario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X a temperatura ambiente al buio senza dondolo per 3 (tre) ore.
- Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x
- Se del caso, di contrasto pupe (Esempio abbiamo macchia nuclei con DAPI [4 ',6-diamidino-2-fenilindolo] diluito in PBS per 10 minuti).
- Equilibrare campioni (minimo di 30 minuti) nelle matrici appropriate prima del montaggio.
- Preparare una diapositiva campione. La morfologia delle pupe impedisce di montaggio piatto. I campioni sono montati nel pozzo di una diapositiva depressione (scivolo goccia) per l'imaging. Posto 75-100ul di mezzi di montaggio nella depressione bene. Diversi campioni può essere montato su una singola diapositiva.
- Il caso pupa deve essere rimosso dai campioni prima del montaggio. Afferrare un singolo caso pupa anteriormente essere sicuri di non cogliere la membrana interna pupa.
- Con un secondo paio di pinze afferrare delicatamente la membrana interna pupa per la testa e rimuoverla dalla custodia pupa.
- Trasferire immediatamente il campione alla depressione bene e continuare a trattare campioni aggiuntivi.
- Usando una posizione della sonda o pinze i campioni in modo uniforme alla depressione e con la superficie laterale verso l'alto. Bolle d'aria occasionali possono essere rimossi con una sonda.
- Abbassare delicatamente il vetrino sulla campioni facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria
4. Rappresentante dei risultati:
Campioni preparati utilizzando questo protocollo conservano la morfologia lordo dell'addome adulto. Pile immagine può essere proiettata per generare una immagine bidimensionale o 3-D di rendering può essere applicato per studiare topologia addome.
Figura 1. Prodotti segmentazione genica in Drosophila pupe proteine senza ali e di espressione Engrailed (En-GAL4: UAS-GFP). Sono stati visualizzati a 26 ore dopo la formazione puparium (APF) con il mouse anti-Wg (4D4: Iowa Ibridoma Bank) e anti-GFP. Ingrandimento 10x, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Nuclei sono stati di contrasto con DAPI.
Pile di circa 50 immagini (ΔZ tra le sezioni è 2.5μm) sono stati proiettati.
Discussion
Le tecniche presentate in questo video può essere utilizzato per preparare Drosophila pupe da una varietà di punti di tempo dello sviluppo. Pupe lavorato durante il periodo di 24 ore a 32 ore APF APF sono più inclini alla perdita delle cellule dell'epitelio. L'uso di detergenti (come il Triton X-100 e Tween-20) durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la probabilità di perdita di cellule e non è pertanto raccomandato. Piuttosto, l'acido desossicolico è usato come detergente durante la fase iniziale di fissazione. Tutti i passaggi successivi sono eseguiti in PBS 1X senza detersivo. Inoltre, a dondolo campioni durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la perdita di cellule e deve essere evitato.
I campioni possono essere esposte utilizzando tecniche di microscopia confocale. Tuttavia, Drosophila pupe trattati come descritto può essere ripreso con un articolato sistema di microscopia illuminazione cedendo qualità d'immagine paragonabile a tecniche confocale.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
