解剖宿主 - 病毒相互作用模型疱疹病毒裂解性复制

Summary

我们描述了一个协议来识别主机的信号分子裂解性复制的模型疱疹病毒，γ疱疹病毒68（γHV68）的关键角色。利用转基因小鼠品系和胚胎成纤维细胞裂解性复制γHV68，该协议允许表型特征和在病毒裂解复制的病毒 - 宿主相互作用的分子审问。

Abstract

在对病毒感染的反应，主机开发各种防御反应，激活先天免疫信号转导途径，导致抗病毒细胞因子的产生^1,2等。为了殖民主机，是专病毒逃避宿主抗病毒反应和处理信号转导通路。揭开宿主 - 病毒相互作用，揭示了对抗病毒感染的新的治疗策略的发展。

小鼠γHV68是密切相关的人类致癌卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒和Epsten的EB病毒^3,4。在实验室老鼠提供了一个听话的小动物模型来研究宿主反应和病毒感染的整个过程，这是不是人类疱疹病毒在体内的 γHV68感染。在这个协议中，我们提出了一个面板的表型特征的方法和分子剖析主机的信号传输元件的在γHV68裂解replic通报BULLETIN无论是在体内和体外 。在γHV68急性感染体内的转基因小鼠品系的可用性允许在审讯主机信号转导通路中的作用。此外，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中），可以使用从这些缺陷的小鼠品系中分离进一步解剖这些分子的作用，在γHV68裂解复制体外 。

使用病毒学和分子生物学分析，我们可以找出宿主 - 病毒相互作用的分子机制，并确定必要病毒裂解复制的宿主和病毒基因。最后，细菌人工染色体（BAC）的系统有利于突变引入到病毒因子（s），专门中断的宿主 - 病毒相互作用。携带这些突变基因重组γHV68可以用来概括MEFs细胞的表型的γHV68裂解性复制缺陷的在关键主机信号组件。此协议提供了一个很好的策略，询问宿主-病原体相互作用， 在体内和体外的多层次的干预。

最近，我们发现，γHV68侵占先天免疫信号转导通路促进病毒裂解性复制。具体而言，γHV68原发感染激酶IKKβ激活免疫激活IKKβ磷酸化的主病毒的转录因子，复制和反式激活（RTA），促进病毒的转录激活。在这样做时，γHV68有效地夫妇的转录激活机体天然免疫激活，从而促进病毒的转录和裂解性复制。该研究提供了一个很好的例子，可以应用到其他病毒询问宿主 - 病毒相互作用。

Protocol

1。滑鼠感染γHV68功能

1. 六到八周，性别相匹配的旧窝小鼠（8〜12只/组），用于病毒性感染。让小鼠适应环境装船后四天（96小时）。
2. 使用病毒协议的步骤应进行在一个内阁生物安全2级（BSL2）的标准BSL2注意事项。
3. 准备病毒悬浮液（40〜1×10 ^5个噬斑形成单位[PFU]）在30μl的无菌PBS中每只小鼠的γHV68刚刚之前的实验。保持病毒悬挂在冰上。
4. 准备氯胺酮/甲苯​​噻嗪溶液（1.5毫克氯胺酮和0.15mg xylazine/20的g体重，100微升/鼠标）鼠标镇静。确保通过执行脚趾夹，老鼠被注射镇静剂。
5. 1.5毫克的氯胺酮和0.15毫克每20毫克体重（100微升/小鼠）腹膜内注射甲苯噻嗪稳重的小鼠。
6. 提供病毒悬浮液（30μL/鼠标）滴鼻，在逐滴时尚，镇静小鼠的一个鼻孔。
7. 莱小鼠一侧为5 - 10分钟，以方便进入肺部的气道传送的病毒。
8. 地点小鼠背部在笼子和显示器小鼠，直到他们完全恢复镇静。
9. 在感染后不同天数，牺牲小鼠CO ₂窒息和收获后肺保证死亡/亏损的深层意识。将肺部进入无菌1.5毫升含500微升1.0毫米氧化锆/二氧化硅珠旋盖管。保持管在冰上。店内样品在-80°C，如果不是在同一天进行下一步。脾或肝组织可以被收集在这个时候，根据实验的时间帧的分析病毒潜伏期。
10. 到管中加入1毫升的冷的无血清DMEM，通过珠跳动30秒的肺部均匀。冷藏至少1 min，管在冰上。一旦重复此过程。
11. 裂解液在4℃下以16,000相对离心力离心机肺，持续1分钟，并使用supernatant，以确定病毒滴度的空斑法，使用NIH3T3或BHK21单层（有关详细信息，参见第5章）。

2。确定γHV68多步生长动力学，在小鼠胚胎成纤维细胞

1. 生长的野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）和在宿主基因子汇合电镀前细胞（约80％）密度的缺陷。
2. 斯普利特的MEF到24孔板上以10,000细胞/孔的低multipilicity感染复数（MOI）感染的前一天。实验通常进行重复三次，以MOI之间0.001 - 0.05通常使用。
3. 准备γHV68悬浮液所需的病毒量（0.5毫升每口井）。
4. 取出介质并覆盖的MEF用0.5毫升的悬浮液，每孔γHV68。
5. 在组织培养的孵化器，岩石，每30分钟孵育板，并允许潜伏期为2小时进行。
6. 删除病毒悬浮液，并覆盖细胞用0.5毫升新鲜的Çomplete含有8％胎牛血清的DMEM培养基中。
7. 在不同的感染后，收获的介质和细胞进入无菌1.5毫升的离心管中。立即冻结管在-80°C。
8. 发布γHV68由MEF在-80°C冷冻，解冻，在37℃水浴和涡旋。冷冻和解冻的三个周期通常是施加到样品。
9. 确定病毒滴度的空斑法，使用NIH3T3或BHK21单层（有关详细信息，参见第5章）。
10. 病毒滴度和情节γHV68多步生长曲线的MEF中。

3。 γHV68在小鼠胚胎成纤维细胞的裂解性复制的分子剖析

1. 执行病毒感染中描述的步骤2.1到2.6的第2条。
2. 在不同的感染后，弃去上清液。冲洗，与冷PBS和trypsinize的细胞的细胞。离心机在1000相对离心力在室温1分钟沉淀细胞。弃去上清并存储细胞在-80℃下
3. 总DNA的提取（主机和病毒基因组），和总RNA，按照原样的方法^5,6。
4. 执行实时PCR使用的总DNA和病毒裂解转录，如RTA（ORF50），ORF57和ORF60的特异性引物。确定细胞内γHV68基因组的参考到主机看家基因（例如，β-肌动蛋白）的相对数量。
5. 若要去除基因组DNA污染，用无RNA酶的DNA酶处理的总RNA和寡聚_{（dT）11-19}引物的cDNA制备的关键。无RNA酶的DNA酶和RT-PCR的RNA提取，包括处理有关详细信息，请参阅参考文献5。执行实时PCR用cDNA和引物与上述确定参照主机管家基因的病毒转录物的相对数量。

4。 ，产生重组γHV68使用细菌人工染色体

该methoð这里描述的是用来引入突变成γHV68涉及的基因，该基因在宿主 - 病毒相互作用。

1. 准备的野生型序列或序列中的中央区域通过PCR携带所需突变的DNA片段（约1.5 kb）。
2. 准备的细菌人工染色体（BAC），其中包含一个转座子插入⁷周围的突变位点，其中特别感兴趣的基因的失活的基因，通过的MIDI规模纯化（OriGene）。商店BAC DNA在4°C（避免冻结/解冻的BAC DNA）。
3. BAC DNA转染和PCR产物的细胞（例如，NIH3T3或BHK21），它是高度宽容到γHV68裂解性复制，与Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）的感兴趣的基因的含有所需的突变。
4. 查看分裂细胞直到细胞病变效应（CPE）显示在单层。收集含病毒上清液，如果有必要，在NIH3T3或BHK21细胞扩增病毒。
5. 感染NIH3T3细胞与重组病毒通过离心转速为1,800 rpm，30℃30分钟。
6. 收获γHV68感染的NIH3T3细胞和准备使用希尔特的协议^8,9内，病毒基因组。
7. 变换电MAX DH10B感受态细胞（Invitrogen公司），通过电穿孔和屏幕为是抗氯霉素（Cm），但对卡那霉素（Kan）的（Cm的抗性基因是在BAC骨干，而侃抗性基因是在转座子敏感的菌落插入）。
8. 成长厘米^ŕ简^小号的殖民地的培养基中chlorophenicol，准备BAC DNA与小或MIDI规模的净化（OriGene）。
9. 通过PCR验证所需的靶基因中的突变，使用特异性引物侧翼区的突变位点，和测序。
10. 在BAC与选定的限制性内切酶消化和脉冲场凝胶电泳确认没有染色体重排。
11. 用脂质体转染到NIH 3T3 BHK21细胞重组BAC2000（Invitrogen公司）准备重组γHV68的。
12. 继续传代的细胞，直到CPE在单层。收集含有病毒的上清和扩增重组γHV68在NIH3T3或者BHK21细胞。
13. 确定重组病毒的滴度和表征病毒的生长特性体外和体内部分1和2中所描述。

5。确定病毒滴度的空斑法

1. 子汇合（约80％）密度电镀前细胞NIH3T3细胞成长。
2. 斯普利特NIH3T3到24孔板上，以20,000细胞/孔感染的前一天。
3. 准备10倍系列稀释的病毒上清液的DMEM培养基中含有8％新生小牛血清（NCS）。
4. 取出介质并覆盖NIH3T3细胞用0.5毫升γHV68悬浮。
5. 组织培养箱中孵育板，岩石，每30分钟，让孵化进行2小时。
6. 删除病毒悬浮液和盖细胞，用0.5毫升的DMEM培养基中含有2％NCS和0.75％的甲基纤维素（Sigma公司）。
7. 在组织培养箱孵育板。在感染后第6天，计算斑块。染色的单层，例如用结晶紫，促进斑块计数。
8. 计算在未稀释的组织裂解液中的病毒滴度或细胞裂解物使用下面的公式：效价（PFU /毫升）= D×N个×1000微升/毫升÷V微升。 N，斑数目的平均值，在适当的稀释，D，稀释倍（如5，10，100 .....）V（微升），串联稀释的上清液的体积每孔添加。

6。代表性的成果：

三个有代表性的数字显示在这里，包括裂解γHV68复制在肺中的野生型和小牛^{- / -}小鼠^10，γHV68裂解复制在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的表型，和尿激酶原蚂蚁γHV68内是调制的的MAVS依赖的IKKβ的磷酸化位点，携带突变。这三个确凿的实验构成了一项计划，定义角色的先天免疫成分的γHV68 在体内和体外的裂解性复制。

图1， 小牛^{+ / +}和小牛^{- / -}小鼠的肺中。γHV68负载。 A）的两个主要与生俱来的信号通路下游的MAVS。 MAVS的的接头分子继电器信号从胞质RIG-I样受体激活NFκB和干扰素调节的因素（IRFS）的，反过来，上调控基因表达的炎性细胞因子和干扰素。 B） 小牛^{+ / +}和小牛^{- / -}小鼠40 PFUγHV68鼻内和病毒载量在肺感染在指定的时间点被阻止的斑块检测NIH3T3单层开采。每个符号代表一个鼠标。

图2。γHV68裂解性复制动力学在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）。对小牛队的裂解性复制的^{γHV68+ / +}和小牛^{- / -} MEFs细胞多步生长曲线（A）和实时定量PCR（B）进行了评估。对于这两个实验中，MEFs和相等数量的量γHV68用于病毒感染的多重感染（MOI）为0.01。 （A）在指定的时间点收获细胞和上清液的牌匾试验，以确定病毒滴度。 （B）从γHV68感染的MEF中提取总RNA，实时定量PCR为选定的裂解成绩单（RTA，ORF57和ORF60）的特异性引物，进行分析。

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图3。裂解性复制动力学重组γHV68RTA的转录域的突变，取消磷酸化IKKγ。 （A）多步生长曲线的重组野生型病毒（γHV68.wt）和突变型病毒（γHV68.mut）在小牛队^{+ / +}和小牛^{- / -}的MEF细胞（MOI = 0.01）。的MEF感染γHV68MOI为0.01。收集细胞和上清液，在指定的时间点，和由使用NIH 3T3细胞单层中的噬斑分析测定病毒滴度。 （B）γHV68RTA mRNA水平在的NIH3T3细胞γHV68感染（MOI = 0.01）。在感染后30小时，总RNA，从γHV68感染的NIH 3T3细胞中提取，并通过实时定量PCR分析。

Discussion

在对病毒感染的反应，MAVS依赖先天免疫信号通路的激活，促进了生产的抗病毒炎性细胞因子^10-14。作为模型病毒对人类的致癌性卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒，EB病毒^3,4使用鼠γHV68的，我们发现，γHV68侵占MAVS-IKKβ的途径，通过促 ​​进病毒裂解性复制转录激活^5。采用转基因MEFs和技术在分子病毒学，该协议可以有效识别的信令组件的一个特定的途径是至关重要的γHV68裂解性复制。因此，该协议必须在体内的感染， 体外裂解性复制和解剖的先天免疫信号转导通路。划定的分子机制，额外的程序，包括细菌人工染色体重组疱疹病毒及分子生物学实验的是必要的。此外，基因敲除小鼠品系和成纤维细胞，这些实验的关键。随着大量基因敲除小鼠品系，该协议将使主机的信号转导途径和病毒干预的分子解剖。在基因敲除小鼠和MEFs是不可用（例如，由于杀伤力），介导的RNA干扰/短发夹击倒的意见。本协议的其他限制包括：1）信号转导通路间的串扰，2）职能重叠的候选病毒因子，3）潜在的致命的影响γHV68复制的基因突变。虽然此协议直接应用于识别角色先天免疫元件在γHV68尤其裂解复制，可以使用类似的策略定义的重要作用， 在体内和体外的病毒感染过程中的其他主机的信号通路中的选定组件。

这是重要的是要注意，我们的重组转染细胞中绕过识别BAC重组在大肠杆菌中的劳动密集的必要步骤，方法，允许高效率的引入突变基因的利益。具体而言，BAC和设计突变的PCR产品之间的同源重组产生感染性BAC克隆，进而上升到重组γHV68。但是，此协议依赖于不应该完全灭活病毒的必需基因和突变。如果的突变完全失活γHV68，转染预期不会产生重组的病毒。我们认识到，从小鼠γHV68了解到的信息可能并不适用相同的人KSHV和EBV。然而，战略，解剖病毒的免疫逃避和开发机制，可以应用到这些人类病原体利用培养的细胞。因此，我们的研究结果来自小鼠感染γHV68将指导我们的d工厂具有较强的设计更好的实验，以研究人类KSHV和EBV。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006