モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

Summary

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス - 宿主相互作用の分子尋問の両方を可能にします。

Abstract

ウイルス感染に応答して、ホストがそのような抗ウイルスサイトカイン産生の^1,2につながる自然免疫シグナル伝達経路を活性化するなど、様々な防御的な応答を、開発しています。ホストを植民地化するためには、ウイルスは、宿主の抗ウイルス応答を回避し、シグナル伝達経路を操作することが嫌気されています。宿主ウイルス相互作用を解明することはウイルス感染に対する新たな治療戦略の開発に光を当てることになります。

ネズミγHV68は密接に人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスとEpsten-Barrウイルス^3,4に関連しています。実験用マウスでγHV68感染はヒトヘルペスウイルスでは利用できませんin vivoにおける宿主応答とウイルス感染、の全過程を調べるために扱いやすい小動物モデルを提供します。このプロトコルでは、表現型の特徴とγHV68溶菌replicでホストシグナル伝達成分の分子解剖のための方法のパネルを提示vivoおよび ex vivoの両方において ation。遺伝的に改変されたマウス系統の有用性は 、in vivo で γHV68急性感染時に宿主シグナル伝達経路の役割の尋問を許可します。さらに、これらの欠損マウス系統から単離されたマウス胚線維芽細胞（MEF）を、さらにγHV68溶菌複製を ex vivoでの間にこれらの分子の役割を分析するために使用できます。

ウイルス学的および分子生物学的アッセイを用いて、我々はホストウイルスの相互作用の分子機構を特定し、ウイルス溶解複製に必須のホストおよびウイルス遺伝子を特定することができます。最後に、細菌人工染色体（BAC）システムは、具体的にホストウイルス作用を中断ウイルス因子（複数可）への変異の導入を容易にします。これらの変異を有する組換えγHV68は主要なホストシグナル伝達成分が欠損したMEFにおけるγHV68溶菌複製の表現型を再現するために使用できます。このプロトコルは 、in vivo および ex vivo における介入の複数のレベルで宿主-病原体相互作用を調べるための優れた戦略を提供しています。

最近、我々はγHV68奪う自然免疫シグナル伝達経路は、ウイルス溶解複製^5を促進することを発見した。具体的には、γHV68de novoの感染症は、免疫キナーゼIKKβを活性化し、活性化IKKβは、ウイルスの転写活性化を促進するために、マスターウイルスの転写因子、複製およびトランス（RTA）をリン酸化する。そうすることで、効率的にγHV68カップルの自然免疫活性化をホストするために、その転写活性化は、それによってウイルス転写および溶解複製を容易にする。この研究では、ホスト·ウイルスとの相互作用を調べるために他のウイルスに適用できる優れた例を提供しています。

Protocol

1。 γHV68によるマウス感染

1. 6〜8週齢、性別をマッチさせた同腹マウス（8〜12匹/群）ウイルス感染のために使用されます。マウスは出荷後4日間フル（96時間）の上に順応することができます。
2. ウイルスを使用してプロトコルの手順は標準BSL2予防措置を用いてバイオセーフティレベル2（BSL2）のキャビネットで行うべきである。
3. ただの実験の前に、マウスあたりの滅菌PBS30μlのγHV68のウイルス懸濁液（40〜1×10 ⁵プラーク形成単位[PFU]）を準備します。氷の上でウイルス懸濁液を保管してください。
4. マウスの鎮静をケタミン/キシラジン溶液（1.5 mgのケタミンおよび0.15 mg xylazine/20 g体重、100μL/マウス）を準備します。マウスはつま先のピンチを行うことにより、鎮静されていることを確認します。
5. 1.5mgのケタミンおよび腹腔内注射で20 mgの体重当たり0.15ミリグラムのキシラジン（100μL/マウス）と落ち着いたマウス。
6. 滴下には、鼻腔内にウイルス懸濁液（30μL/マウス）を提供鎮静マウスの一方の鼻孔にファッション、。
7. 5用に片側にマウスを置き - 10分肺にウイルスの気道送達を容易にする。
8. 背面ケージとモニター、マウスで場所マウス、彼らが完全に鎮静状態から回復したまで。
9. 各種日間感染後に、肺の深い意識の死/損失を確保した後にCO ₂窒息や収穫によってマウスを生け贄に捧げる。 1.0mmのジルコニア/シリカビーズを500μlを含む滅菌1.5ミリリットルスクリューキャップチューブに場所が肺。氷の上にチューブを保管してください。ストアサンプル-80°Cでの同じ日に、次のステップに進んでいない場合。脾臓または肝臓組織は、実験の時間枠に応じてウイルスの待ち時間の分析のために、この時点で収集することができます。
10. チューブに冷たい無血清DMEM 1 mlを加え、ビーズ鼓動を30秒で肺をホモジナイズする。少なくとも1分間氷上でチューブを冷やす。一度、このプロセスを繰り返します。
11. 遠心分離肺は1分間、4℃で16000 rcfでライセートとsupernを使用NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定するatant。

2。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68多段階増殖速度を決定

1. 野生型マウス胚線維芽細胞（MEF）とめっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）密度に対する宿主遺伝子を欠損したものを栽培しています。
2. 感染前日に低multipilicityオブ感染度（MOI）のためのよく10,000細胞/ 24ウェルプレートにMEFを分割します。実験は、通常、0.001の間に三重にし、MOIで行われている - 0.05は、通常使用されています。
3. ウイルスの所望量（ウェル当たり0.5ミリリットル）を含むγHV68懸濁液を調製。
4. 培地を除去し、ウェルあたりγHV68懸濁液0.5mlでMEFをカバーしています。
5. 組織培養インキュベーター、岩30分ごとにプレートをインキュベートし、インキュベーションは2時間進行させる。
6. ウイルス懸濁液を取り出して、0.5ミリリットル新鮮cを使用してセルをカバーomplete DMEM培地は8％ウシ胎児血清を含む。
7. 各種日間感染後に、滅菌1.5 mlの遠心チューブに培地と細胞を採取。直ちに-80℃でチューブを凍結℃に
8. -80℃で凍結させたMEFからリリースγHV68℃、37で解凍℃の水浴とボルテックス。凍結融解の3サイクルは通常のサンプルに適用されます。
9. NIH3T3またはBHK21単層（詳細については第5節を参照）を使用してプラークアッセイによりウイルス力価を決定します。
10. ウイルス力価を読み、MEFの上γHV68多段階成長曲線をプロットします。

3。マウス胚性線維芽細胞におけるγHV68溶菌複製の分子解剖

1. セクション2の2.6〜ステップ2.1で説明したようにウイルス感染を行います。
2. 各種日間感染後に、上清を捨てる。冷PBSおよびトリプシン処理細胞と細胞を洗浄します。 1分間、室温で1,000 rcfで遠心分離により細胞をペレット化。上清を捨て、-80℃で保存細胞℃、
3. 以前に公開された方法^5,6に従って全DNA（ホストおよびウイルスゲノム）、全RNAを抽出します。
4. 全DNAなどのRTA（ORF50）、ORF57とORF60としてウイルス溶解転写産物に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。ホストハウスキーピング遺伝子（例えば、β-アクチン）を参考にし、細胞内γHV68ゲノムの相対量を決定します。
5. ゲノムDNAのコンタミを除去するには、RNaseフリーのDNaseを用いた治療は、トータルRNAおよびオリゴ_{（dT）11-19}プライマーとcDNA調製のために重要である。 RNaseフリーDNaseおよびRT-PCR法を用いた治療を含む、RNA抽出の詳細については5を参照してください。ホストハウスキーピング遺伝子のそれを参考にウイルス転写物の相対量を決定するために、上記のように、cDNAおよびプライマーを用いたリアルタイムPCRを実行します。

4。細菌人工染色体を用いて組換えγHV68を生成

変性アルコール常飲者ここで説明するdは宿主ウイルス相互作用に関与しているγHV68遺伝子に変異を導入するために使用されます。

1. PCRにより中央領域に所望の変異を運ぶ野生型配列または配列のDNA断片（約1.5kb）を準備します。
2. 特にMIDIスケールの精製（OriGene）により、目的の遺伝子の遺伝子を不活性化する変異部位の周りトランスポゾン挿入^7を含む細菌人工染色体（BAC）を準備します。 4で保存してBAC DNA℃（BAC DNAの融解/凍結を避ける）。
3. トランスフェクトしたBAC DNA、PCR産物は、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いて、γHV68溶菌複製に対して非常に寛容である細胞（例えば、NIH3T3またはBHK21）に興味のある遺伝子の所望の突然変異を含む。
4. 細胞変性効果（CPE）が単層で表示されるまで、セルの分割をしてください。ウイルスを含む上清を回収し、必要に応じて、NIH3T3またはBHK21細胞にウイルスを増幅する。
5. とNIH3T3細胞に感染1800 rpmで遠心分離した組換えウイルスは、30℃で30分間。
6. 収穫γHV68感染NIH3T3細胞とヒルトのプロトコル^を使用^して8,9環状ウイルスゲノムを準備します。
7. 菅耐性遺伝子がトランスポゾンのときにクロラムフェニコール（Cm）への抵抗であるコロニーのためのエレクトロポレーションと画面によって電気MAX DH10Bコンピテント細胞（Invitrogen）を変換しますが、カナマイシンに対する感受性（菅）（Cm耐性遺伝子は、BACのバックボーンになっている挿入）。
8. chlorophenicolを含む培地での^CM、R、S菅コロニーを成長させ、ミニまたはMIDIスケールの精製（OriGene）でのBAC DNAを調製する。
9. 変異部位の隣接領域、および配列に特異的なプライマーを用い、PCR法により標的遺伝子中の所望の変異を確認します。
10. 選択された制限酵素およびパルスフィールド·ゲル電気泳動を用いた消化によって、BACには染色体再配列を確認していません。
11. リポフェクタミンとNIH 3T3またはBHK21細胞への組換えBACをトランスフェクション組換えγHV68を準備するために2000（Invitrogen）を。
12. CPEは単層で表示されるまで細胞を継代してください。ウイルスを含む上清を収集し、NIH3T3またはBHK21細胞で組換えγHV68を増幅する。
13. 組換えウイルスの力価を測定し、セクション1および2に記載されたウイルスの増殖特性をex vivoおよび in vivo での特徴となっています 。

5。プラークアッセイによりウイルス力価を決定

1. めっきセルの前にサブコンフルエント（約80％）の密度にNIH3T3細胞を成長させる。
2. 感染前日によく20,000細胞/ 24ウェルプレートに分割したNIH3T3。
3. 8パーセント新生仔ウシ血清（NCS）を含むDMEM培地で10倍に直列に希釈ウイルス上清を準備します。
4. 培地を除去し、γHV68懸濁液0.5mlをNIH3T3細胞をカバーしています。
5. 組織培養インキュベーター、岩の板ごとに30分間インキュベートし、インキュベーションを続行できるよう2時間。
6. ウイルス懸濁液を取り出して、2パーセントNCSおよび0.75％メチルセルロース（Sigma）を含む0.5mlのDMEM培地で細胞をカバーしています。
7. 組織培養インキュベーター中で静置します。 6日目、感染後にプラークをカウントします。単層の染色、クリスタルバイオレットを持つ例えば、プラークの計数を容易にすることができる。
8. 価（PFU / mlで）= D×N個×1000μL/ミリリットル÷Vの添加：次の式を使用して希釈していない組織溶解物または細胞溶解物中のウイルス力価を計算します。 N、適切な希釈でプラーク数の平均値であり、Dは、希釈倍（5など、10、100 .....）、V（μL）、連続的に希釈した上清の体積は当たりも追加。

6。代表的な結果：

^{- / -}マウス^10、マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製表現型とrecombin 3つの代表的な数値は、野生型およびMAVSの肺におけるγHV68溶菌複製を含め、ここに示されていますMAVS依存IKKβによって変調されるリン酸化部位内の変異を運ぶアリγHV68。これら三つの裏付けとなる実験は 、in vivo および ex vivo で γHV68溶菌レプリケーションに先天性免疫コンポーネントの役割を定義するためのスキームを構成している。

図1 MAVS ^{+ / +}およびMAVSの肺のγHV68負荷^{- / -}マウス。 ）二つの主要な先天性のシグナリングはMAVSの下流経路。順番に、炎症性サイトカインやインターフェロンの遺伝子発現をアップレギュレートするNFκBおよびインターフェロン調節因子（IRFS）を活性化するために細胞質RIG-I様受容体からのシグナルMAVSアダプター分子リレー。 B）はMAVS ^{+ / +}およびMAVS ^{- / -}マウスは阻止された指定された時点で40 PFUの鼻腔γHV68および肺におけるウイルス量で感染させた NIH3T3単分子膜を用いたプラークアッセイによって決定されます。各シンボルは、マウスを表しています。

図2：マウス胚線維芽細胞（MEF）でγHV68溶菌複製動態。 MAVS上γHV68の溶菌複製は^{+ / +}およびMAVS ^{- / -} MEFには多段階の成長曲線（A）と、定量的リアルタイムPCR（B）によって評価した。両方の実験では、γHV68の等しいMEFの数と量は0.01-多数の感染度（MOI）でウイルス感染のために使用された。 （a）細胞と上清を示した時点で収穫し、ウイルス力価を決定するために、プラークアッセイの対象とされた。 （B）の総RNAをγHV68感染したMEFから抽出され、選択された溶菌転写産物（RTA、ORF57、およびORF60）に特異的なプライマーを用いて、定量的リアルタイムPCRによって分析した。

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図3IKKγによるリン酸化を廃止RTAのトランス活性化ドメイン内の組換えγHV68運ぶ突然変異の溶菌複製動態。 （A）はMAVSにおける多段階成長換え野生型ウイルスの曲線（γHV68.wt）と変異ウイルス^{（γHV68.mut）+ / +}およびMAVS ^{- / -} MEFの細胞（MOI = 0.01）。 MEFのをMOI 0.01でγHV68を感染させた。細胞と上清を指示された時点で収穫し、ウイルス力価はNIH 3T3単分子膜を用いたプラークアッセイにより決定した。 γHV68感染NIH3T3細胞（B）中のγHV68RTAのmRNAレベル（MOI = 0.01）。時間感染後30日時点で、全RNAをγHV68感染NIH 3T3細胞から抽出し、定量的リアルタイムPCRによって分析した。

Discussion

ウイルス感染に応答して、MAVS依存自然免疫シグナル伝達経路は^{、10月14日}抗炎症性サイトカインの産生を促進するために活性化されています。人間の発癌性カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス^3,4のモデルウイルスとしてマウスγHV68を使用して、我々はγHV68横取りMAVS-IKKβ経路は転写活性化^5を介してウイルス溶解複製を促進することを発見した。分子ウイルス学における遺伝的に修飾されたMEFと技術を用いた、このプロトコルはγHV68溶菌複製にとって重要な特定の経路のシグナル伝達成分を効率的に識別することができます。このように、このプロトコルは 、in vivo感染、ex vivoで溶菌複製、自然免疫シグナル伝達経路の解剖に必然的に伴う。組換えヘルペスを生成する細菌人工染色体を含む分子機構、追加の手順を記述するためにウイルスと分子生物学的実験が必要である。さらに、ノックアウトマウス系統と線維芽細胞は、これらの実験のための鍵となります。利用可能なノックアウトマウス系統の数が多​​いと、このプロトコルは、ホストのシグナル伝達経路とウイルス介入それらの分子解剖を有効にします。ノックアウトマウスとMEFの（例えば、致死性のために）利用できないというイベントでは、RNAi / shRNAを媒介ノックダウンが求められることがあります。このプロトコルの追加の制限事項があります：1）シグナル伝達経路間のクロストーク、2）候補ウイルス因子の機能、3を重複している）突然変異によってγHV68複製に対する潜在的な致死効果を。このプロトコルは特にγHV68溶菌レプリケーションに先天性免疫コンポーネントの役割を識別するために直接適用されたが、同様の戦略は 、in vivo および ex vivo でのウイルス感染時のシグナル伝達経路の他のホストで選択したコンポーネントの重要な役割を定義するために使用できます。

それはトランスフェクトされた細胞における私たちの組換えアプローチは目的遺伝子に変異の効率的な導入を可能にして、 大腸菌での組換えBACを識別するために必要な労働集約型のステップをバイパスしていることに注意することが重要です。具体的には、設計された変異を含むBACおよびPCR産物間の相同組換えは、順番に、組換えγHV68を引き起こす感染性BACクローンを生成します。しかし、このプロトコルは、完全にウイルスを不活化するために想定されていない必須遺伝子と変異に依存しています。変異が完全にγHV68を不活性化した場合、トランスフェクションは、組換えウイルスを生成するために期待されていません。我々はマウスγHV68から学んだその情報は人間KSHVとEBVと同様に適用されない場合があり実現しています。しかし、ウイルスの免疫回避と搾​​取のメカニズムを解剖するための戦略は、培養細胞を使用して、これらのヒト病原体にも適用することができる。 γHV68とマウスの感染に由来し、我々の調査結果はこのようにdの私達に指示します人間KSHVとEBVを勉強する良い実験をesigning。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006