Summary
وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.
Abstract
في استجابة للعدوى الفيروسية، مجموعة تطوير استجابات دفاعية مختلفة، مثل تفعيل المناعة الفطرية مسارات الإشارات التي تؤدي إلى 1،2 المضادة للفيروسات خلوى الإنتاج. من أجل استعمار المضيف والفيروسات هي تلزم للتهرب من الردود المضادة للفيروسات المضيف والتلاعب مسارات الإشارات. وكشف التفاعل المضيفة للفيروسات تسليط الضوء على وضع استراتيجيات علاجية جديدة ضد العدوى الفيروسية.
الفئران γHV68 يرتبط ارتباطا وثيقا هربس ساركومة المرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وEpsten بار فيروس 3،4. γHV68 العدوى في الفئران المعملية يوفر لين العريكة نموذج حيواني صغير لفحص كامل للاستجابات المضيف والعدوى الفيروسية في الجسم الحي، والتي هي غير متاحة للالهربس الإنسان. في هذا البروتوكول، نقدم لجنة من الأساليب لتوصيف المظهري والجزيئي للمكونات تشريح المضيفة في إشارة γHV68 replic التحلليأوجه كل من في الجسم الحي وفيفو السابقين. توافر سلالات الفئران المعدلة وراثيا يسمح استجواب أدوار مسارات الإشارات المضيف خلال العدوى الحادة γHV68 في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) المعزولة من هذه السلالات الماوس ناقصة لتشريح مزيد من أدوار هذه الجزيئات خلال تكرار التحللي γHV68 فيفو السابقين.
باستخدام فحوصات الفيروسية البيولوجيا الجزيئية و، يمكننا تحديد الآلية الجزيئية للفيروسات من المضيف التفاعلات وتحديد المضيف والجينات الفيروسية الأساسية للنسخ المتماثل التحللي الفيروسية. وأخيرا، كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) نظام يسهل إدخال طفرات في عامل فيروسي (ق) التي يقطع على وجه التحديد التفاعل المضيفة للفيروسات. ويمكن استخدام المؤتلف γHV68 تحمل هذه الطفرات لاستعادة أحد الظواهر من تكرار التحللي γHV68 في MEFs نقص في إشارة المضيف مفتاح المكونات.هذا البروتوكول يوفر استراتيجية ممتازة لاستجواب المضيف الممرض التفاعل على مستويات متعددة للتدخل في الجسم الحي وفيفو السابقين.
مؤخرا، اكتشفنا أن يغتصب γHV68 على مسار الإشارات الفطرية في مأمن من تشجيع تكرار التحللي الفيروسية 5. على وجه التحديد، γHV68 العدوى نوفو دي ينشط المناعة، وكيناز IKKβ IKKβ تنشيط العامل الرئيسي phosphorylates النسخ الفيروسية، والنسخ وtransactivator (RTA)، لتعزيز تفعيل النسخي الفيروسية. في القيام بذلك، γHV68 الأزواج بكفاءة تفعيله النسخي لاستضافة تنشيط جهاز المناعة الفطرية، وبالتالي تيسير النسخ الفيروسية وتكرار التحللي. هذه الدراسة مثالا ممتازا التي يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى لاستجواب المضيفة للفيروسات التفاعل.
Protocol
1. عدوى الفأر مع γHV68
- وتستخدم الفئران littermate ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر، والجنس المطابقة (8 إلى 12 الفئران / المجموعة) لعدوى فيروسية. تسمح الفئران ليتأقلم على مدى أربعة أيام كاملة (96 ساعة) بعد الشحن.
- وينبغي إجراء الخطوات باستخدام بروتوكول الفيروس في تشكيل حكومة من مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) باستخدام معيار BSL2 الاحتياطات.
- إعداد التعليق الفيروسية (40 إلى 1 × 10 5 البلاك تشكيل وحدات [PFU]) من γHV68 في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة في الماوس فقط قبل التجربة. إبقاء التعليق على الجليد الفيروسية.
- إعداد الحل الكيتامين / زيلازين (1.5 ملغ الكيتامين و 0.15 ملغ الجسم الوزن ز xylazine/20، 100 ميكرولتر / الماوس) لتخدير الماوس. تأكد من أنه تم مخدرا الفئران عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميه.
- رزين الفئران مع الكيتامين ملغ 1.5 و 0.15 ملغ 20 ملغ لكل زيلازين وزن الجسم (100 ميكرولتر / الماوس) من داخل البريتوني الحقن.
- تقديم التعليق الفيروسية (30 ميكرولتر / الماوس) الأنف، في الإفلات من الحكمةأزياء، المنخر إلى واحد من الفئران مخدرا.
- وضع الفئران على جانب واحد لمدة 5 - 10 دقيقة لتسهيل إيصال مجرى الهواء للفيروس في الرئة.
- الفئران في قفص المكان مرة أخرى ورصد الفئران حتى أنهم تعافى تماما من التخدير.
- في أيام مختلفة بعد العدوى، والتضحية الفئران خنقا 2 CO والحصاد الرئتين بعد أن تؤكد وفاة / فقدان الوعي العميق. الرئتين في مكان معقم 1،5 أنابيب المسمار وتوج مل تحتوي على 500 ميكرولتر من 1.0 الخرز الزركونيا / السيليكا مم. إبقاء الأنابيب على الجليد. عينات المحل في -80 درجة مئوية إن لم يكن الانتقال إلى الخطوة التالية في نفس اليوم. يمكن جمع الطحال أو أنسجة الكبد في هذا الوقت لتحليل الكمون الفيروسي اعتمادا على الإطار الزمني للتجربة.
- إضافة 1 مل من DMEM المصل خالية الباردة في أنبوب والتجانس الرئتين من 30 ثانية حبة الضرب. البرد أنابيب على الجليد لمدة لا تقل 1 دقيقة. كرر هذه العملية مرة واحدة.
- أجهزة الطرد المركزي في الرئة لست] 16000 في إطار التعاون الإقليمي C ° 4 ل 1 دقيقة واستخدام supernatant لتحديد عيار الفيروسية قبل الفحص باستخدام لوحة أحادي الطبقة أو NIH3T3 BHK21 (انظر القسم 5 لمزيد من التفاصيل).
2. تحديد حركية النمو γHV68 متعددة الخلايا الليفية الماوس في خطوة الجنينية
- تنمو الخلايا الليفية الماوس الجنينية البرية من نوع (MEFs)، ونقص في تلك الجينات المضيف لكثافة (حوالي 80٪) شبه متموجة قبل خلايا الطلاء.
- تقسيم MEFs في 24 لوحة جيدا في 10،000 خلية / جيدا لأدنى مستوى من بين multipilicity العدوى (وزارة الداخلية) في اليوم قبل الإصابة. وتجرى عادة في التجارب وثلاث مكرارت في وزارة الداخلية بين 0.001 - هو الذي يستخدم عادة 0.05.
- إعداد γHV68 التعليق تحتوي على المبلغ المطلوب من فيروس (0.5 مل لكل بئر).
- إزالة المتوسطة وتغطية MEFs مع 0.5 مل من التعليق γHV68 لكل بئر.
- احتضان لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة، الصخرة كل 30 دقيقة، والسماح للمضي قدما الحضانة لمدة 2 ساعة.
- إزالة التعليق الفيروسية، وتغطية الخلايا مع 0.5 مل ج جديدةomplete DMEM المتوسطة التي تحتوي على 8٪ مصل بقري جنيني.
- في أيام مختلفة بعد العدوى، وحصاد الخلايا في المتوسط ومعقمة 1،5 مل أنابيب الطرد المركزي. تجميد أنابيب الفور في -80 ° C.
- الإفراج γHV68 من خلال تجميد MEFs في -80 ° C، ذوبان في 37 ° C حمام مائي وvortexing. عادة يتم تطبيق ثلاث دورات التجميد والذوبان في العينات.
- تحديد عيار الفيروسية قبل الفحص باستخدام لوحة أحادي الطبقة أو NIH3T3 BHK21 (انظر القسم 5 لمزيد من التفاصيل).
- قراءة عيار الفيروسية ومؤامرة γHV68 منحنى النمو متعددة الخطوات على MEFs.
3. الجزيئية تشريح γHV68 تكرار التحللي في الخلايا الليفية الماوس الجنينية
- أداء عدوى فيروسية كما هو موضح في الخطوات 2،1 حتي 2،6 من الباب 2.
- في أيام مختلفة بعد العدوى، وتجاهل طاف. شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة ويعرض للتريبسين الخلايا. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي في 1000 درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف والخلايا المحل في -80 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي الإجمالي (المضيف والجينوم الفيروسي) والحمض النووي الريبي مجموع وفقا للأساليب المنشورة سابقا 5،6.
- أداء في الوقت الحقيقي PCR باستخدام DNA الكلي والاشعال محددة لمحاضر التحللي الفيروسية، مثل هيئة الطرق والمواصلات (ORF50)، وORF57 ORF60. تحديد الكميات النسبية للجينوم γHV68 داخل الخلايا في إشارة إلى مجموعة الجينات التدبير المنزلي (مثل β-أكتين).
- لإزالة التلوث الجيني DNA، العلاج مع ريبونوكلياز خالية الدناز هو أمر حاسم لإعداد [كدنا] مع الحمض النووي الريبي مجموع وبنسبة ضئيلة التمهيدي 11-19 (DT). الرجوع إلى مرجع (5) لمزيد من التفاصيل على استخراج الحمض النووي الريبي بما في ذلك العلاج مع ريبونوكلياز خالية الدناز وRT PCR. أداء في الوقت الحقيقي PCR باستخدام بادئات [كدنا] وعلى النحو الوارد أعلاه لتحديد الكمية النسبية من النصوص الفيروسية في إشارة إلى أن من الجينات التدبير المنزلي المضيف.
4. توليد المؤتلف γHV68 باستخدام كروموسوم اصطناعي البكتيرية
وmethoووصف د هنا يستخدم لإدخال طفرات الجينات في γHV68 التي تشارك في استضافة الفيروسات التفاعل.
- إعداد جزء DNA (حوالي 1.5 كيلو بايت) من البرية من نوع تسلسل أو تسلسل تحمل الطفرات المطلوبة في منطقة الوسط بنسبة PCR.
- إعداد الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) الذي يحتوي على حوالي 7 ينقول الإدراج في الموقع الطفرة التي يثبط نشاط الجينات الجين على وجه التحديد من الفائدة، وذلك على نطاق وتنقية ميدي (أوريجنس). BAC متجر DNA عند 4 ° C (تجنب تجميد / الذوبان من DNA BAC).
- BAC بالنقل DNA والطفرات التي تحتوي على المنتج PCR المطلوب من الجينات إلى خلايا ذات الاهتمام (على سبيل المثال، أو NIH3T3 BHK21)، والتي هي متساهلة للغاية لتكرار التحللي γHV68، مع Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن).
- إبقاء خلايا تقسيم حتى الأثر الاستسلامي (CPE) يظهر في أحادي الطبقة. جمع الفيروسات التي تحتوي على طاف وإذا لزم الأمر، تضخيم الفيروس في NIH3T3 أو BHK21 الخلايا.
- تصيب الخلايا مع NIH3T3المؤتلف الفيروس عن طريق الطرد المركزي عند 1،800 دورة في الدقيقة، 30 ° C لمدة 30 دقيقة.
- الحصاد γHV68 الخلايا المصابة NIH3T3 وإعداد circularized الجينوم الفيروسي باستخدام بروتوكول هيرت ل8،9.
- تحويل الخلايا الكهربائية-MAX DH10B المختصة (إينفيتروجن) بواسطة الصعق الكهربائي وكشف عن المستعمرات التي هي مقاومة الكلورامفينيكول (سم)، ولكن حساسية للالكاناميسين (اساسه) (سم مقاومة للالجين هو العمود الفقري في BAC، في حين اساسه مقاومة الجينات في ينقول الإدراج).
- تنمو المستعمرات سم R S اساسه في chlorophenicol المتوسطة التي تحتوي على الحمض النووي وإعداد BAC مع تنقية مصغرة أو ميدي النطاق (أوريجنس).
- تحقق من طفرة في الجين المطلوب من الهدف PCR، وذلك باستخدام بادئات محددة لمناطق المحيطة موقع الطفرة، والتسلسل.
- لا تأكيد إعادة ترتيب الكروموسومات في BAC بواسطة الهضم مع الانزيمات قيود المحددة ونبض الميدان الكهربائي للهلام.
- المؤتلف BAC بالنقل إلى خلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة أو BHK21 مع Lipofectamine2000 (إينفيتروجن) لإعداد المؤتلف γHV68.
- الحفاظ على الركض الخلايا حتى CPE يظهر في أحادي الطبقة. جمع الفيروسات التي تحتوي على تضخيم وطاف في المؤتلف γHV68 NIH3T3 أو BHK21 الخلايا.
- تحديد عيار المؤتلف للفيروس وتميز النمو الفيروسي فيفو السابقين وخصائص في الجسم الحي كما هو موضح في المقاطع 1 و 2.
5. تحديد عيار الفيروسية قبل الاختبار الصفائحي
- تنمو الخلايا لNIH3T3 الكثافة (حوالي 80٪) شبه متموجة قبل خلايا الطلاء.
- تقسيم NIH3T3 في 24 لوحة جيدا في 20000 خلية / جيدا في اليوم قبل الإصابة.
- إعداد 10-أضعاف supernatants الفيروس متسلسل-المخفف مع DMEM المتوسطة التي تحتوي على 8٪ مصل العجل الوليد (NCS).
- إزالة المتوسطة وتغطية الخلايا NIH3T3 مع 0.5 مل من γHV68 التعليق.
- احتضان لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة، صخرة كل 30 دقيقة، والسماح للمضي قدما الحضانةلمدة 2 ساعة.
- إزالة التعليق الفيروسية والخلايا الغطاء مع 0.5 مل المتوسطة DMEM تحتوي على 2٪ NCS وميثيل 0.75٪ (سيغما).
- احتضان لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة. عد لويحات في يوم 6 بعد العدوى. قد تلطيخ للأحادي الطبقة، على سبيل المثال البنفسجي مع الكريستال، وتسهيل فرز البلاك.
- حساب عيار الفيروسية في الأنسجة غير مخفف أو لست] الخلية لست] باستخدام الصيغة التالية: العيار الحجمي (PFU / مل) = D X N × 1000 ميكرولتر / مل ميكرولتر V ÷. وأضاف D، تخفيف أضعاف (مثل 10، 5، 100 .....) V (ميكرولتر)، حجم طاف متسلسل-المخففة أيضا؛ N، ومتوسط عدد وحة في التخفيف من مناسبة.
6. ممثل النتائج:
وتظهر ثلاث شخصيات ممثلة هنا، بما في ذلك تكرار التحللي γHV68 في الرئة من مافريكس والبرية من نوع - / - الماوس 10، γHV68 الظواهر تكرار التحللي في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF)، وrecombinالنمل يحمل γHV68 الطفرات في المواقع الفسفرة التي هي عن طريق التضمين والتي تعتمد على IKKβ مافريكس. هذه التجارب الثلاث تشكل مساندة خطة لتحديد دور كل من مكونات المناعة الفطرية في γHV68 تكرار التحللي في الجسم الحي وفيفو السابقين.
الشكل 1 γHV68 الأحمال في الرئتين من مافريكس + / + ومافريكس - / - الفئران. A) اثنان إشارات الفطرية المسارات الرئيسية المصب مافريكس. الجزيء محول مافريكس التبديلات إشارة من مستقبلات RIG-I-عصاري خلوي لتفعيل مثل NFκB والعوامل التنظيمية للفيروسات (IRFs) وهذا بدوره، يصل تنظيم التعبير الجيني من السيتوكينات proinflammatory وإنترفيرون. B) مافريكس + / + ومافريكس - أصيب الفئران مع 40 PFU γHV68 الأنف والأحمال الفيروسية في الرئة عند نقاط الوقت المشار إليه وردع - / الملغومة من قبل الفحص باستخدام لوحة NIH3T3 أحادي الطبقة. كل رمز يمثل الماوس.
الشكل 2. γHV68 حركية تكرار التحللي في الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs). تكرار التحللي من γHV68 على مافريكس + / + ومافريكس - / - تم تقييم MEFs من منحنيات النمو متعددة الخطوات (A) والكمية في الوقت الحقيقي PCR (B). لكل من التجارب، واستخدمت عدد متساو من MEFs وكمية γHV68 لعدوى فيروسية في تعدد العدوى، من (وزارة الداخلية) من 0.01. (A) الخلايا تم حصادها وsupernatants في نقاط الوقت المشار إليه وتخضع لفحص اللوحة لتحديد التتر الفيروسية. (B) تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من γHV68 المصابين وتحليلها بواسطة MEFs PCR الكمي في الوقت الحقيقي مع الاشعال محددة لمحاضر التحللي المحددة (RTA، ORF57، وORF60).
ig3.jpg "/>
الشكل 3. وحركية تكرار التحللي من الطفرات المؤتلف γHV68 تحمل ضمن المجال transactivation هيئة الطرق والمواصلات أن إلغاء الفسفرة من IKKγ. (A) منحنيات النمو متعددة الخطوات من الفيروسات البرية من نوع المؤتلف (γHV68.wt) والفيروس متحولة (γHV68.mut) في دالاس + / + ومافريكس - / - الخلايا MEFs (MOI = 0.01). أصيب MEFs مع وزارة الداخلية لفي γHV68 من 0.01. الخلايا تم حصادها وsupernatants في نقاط زمنية المشار إليها وكانوا مصممين التتر الفيروسية قبل الفحص باستخدام لوحة NIH أحادي الطبقة 3T3. (B) مرنا RTA γHV68 مستوى في الخلايا المصابة NIH3T3 γHV68 (MOI = 0.01). في 30 ساعة بعد الإصابة، تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المصابة NIH γHV68 3T3 وتحليلها بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في استجابة للعدوى الفيروسية، يتم تنشيط مافريكس التي تعتمد على المناعة الفطرية مسارات الإشارات لتعزيز إنتاج السيتوكينات الالتهابية المضادة للفيروسات 10-14. باستخدام γHV68 الفئران ك فيروس هربس ساركومة نموذجا للالمرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وفيروس ابشتاين بار 3،4، اكتشفنا أن γHV68 يغتصب مسار مافريكس-IKKβ لتشجيع تكرار التحللي الفيروسية عن طريق تفعيل النسخي 5. توظيف MEFs المعدلة وراثيا والتقنيات في علم الفيروسات الجزيئية، ويسمح تحديد كفاءة يشير مكونات مسار خاص التي تعتبر بالغة الأهمية لتكرار التحللي γHV68. على هذا النحو، وهذا ينطوي على بروتوكول العدوى في الجسم الحي، خارج الجسم تكرار التحللي، وتشريح الطريق مما يشير الى المناعة الفطرية. لتحديد آلية الجزيئية، بما في ذلك إجراءات إضافية في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري لتوليد المؤتلف الهربستجارب علم الأحياء الجزيئية والفيروسات ضرورية. بالإضافة إلى ذلك، سلالات الفئران خروج المغلوب والخلايا الليفية هي المفتاح لهذه التجارب. مع عدد كبير من سلالات الفئران خروج المغلوب المتاحة، وتمكين هذا البروتوكول تشريح الجزيئي للإشارة المضيف مسارات والتدخل الفيروسية منها. في حالة الفئران خروج المغلوب وMEFs غير متوفرة (على سبيل المثال، بسبب الفتك)، قد سعى رني / shRNA بوساطة ضربة قاضية. قيود إضافية من هذا البروتوكول ما يلي: 1) الحديث المتبادل بين مسارات الإشارات، 2) وظائف متداخلة من العوامل الفيروسية مرشح، 3) التأثير المميت المحتمل على γHV68 التكرار من قبل الطفرات. على الرغم من أن تطبيق هذا البروتوكول مباشرة لتحديد أدوار مكونات المناعة الفطرية في γHV68 تكرار التحللي على وجه الخصوص، يمكن استخدام استراتيجيات مماثلة لتحديد الأدوار الهامة للمكون المحدد في مسارات إشارات المضيفة الأخرى خلال العدوى الفيروسية في الجسم الحي وفيفو السابقين.
فمنالمهم أن نلاحظ أن نهجنا في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إعادة التركيب يتجاوز الخطوات العمالة المكثفة اللازمة لتحديد BAC المؤتلف في القولونية، والسماح بإدخال كفاءة الطفرات في الجينات الفائدة من. على وجه التحديد، إعادة التركيب مثلي بين BAC والمنتجات التي تحتوي على PCR الطفرات تنتج مصممة المعدية استنساخ BAC ذلك، بدوره، أن تتسبب في المؤتلف γHV68. ومع ذلك، هذا البروتوكول يعتمد على الجينات الأساسية والطفرات التي لا يفترض أن تعطيل الفيروس تماما. إذا الطفرات تعطيل تماما γHV68، وليس من المتوقع transfections لتوليد فيروس المؤتلف. ونحن ندرك أن المعلومات المستخلصة من الفئران γHV68 قد لا تنطبق بشكل مماثل لKSHV الإنسان وEBV. ومع ذلك، قد يتم تطبيق استراتيجيات لتشريح التهرب المناعة الفيروسية وآليات الاستغلال لهذه الكائنات الممرضة للإنسان باستخدام الخلايا المستزرعة. النتائج التي توصلنا إليها المستمدة من العدوى الفأر مع γHV68 سوف توعز بالتالي لنا من دesigning أفضل التجارب لدراسة الإنسان وKSHV EBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جيمس (تشى جيان) تشن (UT جنوبي غربي، البيولوجيا الجزيئية) لتوفير الكواشف الضرورية، بما في ذلك مافريكس - / - الفئران، والدكتور رينيه الشمس (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والصيدلة الطب الجزيئي ) لتوفير كروموسوم البكتيريا الصناعي من γHV68 لهذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 | |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M. , John Wiley & Sons, Inc. 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , Humana Press Inc. 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
