Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Abstract

In Reaktion auf virale Infektion, entwickelt eine Vielzahl verschiedener Abwehrreaktionen, wie die Aktivierung angeborenen Immunsystems Signalwege, die die antivirale Zytokin-Produktion ^1,2 führen. Um den Host besiedeln, sind Viren obligat zu Host Reaktionen antiviralen entziehen und zu manipulieren Signalwege. Die Aufklärung der Wirt-Virus-Interaktion wird Licht auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien gegen virale Infektionen zu vergießen.

Murine γHV68 ist eng mit menschlichen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epsten-Barr-Virus ^3,4 verwandt. γHV68 Infektion in Mäusen eine tractable kleinen Tiermodell, um den gesamten Verlauf der Host Reaktionen und viralen Infektion in vivo, die nicht verfügbar sind für den menschlichen Herpesviren untersuchen. In diesem Protokoll, präsentieren wir ein Panel von Methoden zur phänotypischen Charakterisierung und molekulare Zerlegung des Host-Signalisierungs-Komponenten in γHV68 lytische replication in vivo und ex vivo. Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mausstämmen erlaubt die Abfrage der Rollen von Host Signalwege während γHV68 akute Infektion in vivo. Darüber hinaus können embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) aus diesen defizienten Mäusen isolierten Stämme zur weiteren sezieren Rolle dieser Moleküle während γHV68 lytische Replikation ex vivo werden.

Mit virologische und molekularbiologische Tests, können wir ermitteln den molekularen Mechanismus der Wirt-Virus-Interaktionen und identifizieren Host und viralen Gene essentiell für lytischen Replikation. Schließlich erleichtert ein bakterielles künstliches Chromosom (BAC)-System die Einführung von Mutationen in den viralen Faktor (en), die spezifisch unterbrechen die Wirt-Virus-Interaktion. Rekombinante γHV68 Durchführung dieser Mutationen können die Phänotypen der γHV68 lytische Replikation in MEFs Mangel an wichtigen Host Signalkomponenten rekapitulieren werden.Dieses Protokoll bietet eine exzellente Strategie, um Wirt-Pathogen-Interaktion auf mehreren Ebenen der Intervention in vivo und ex vivo zu verhören.

Kürzlich haben wir entdeckt, dass γHV68 usurpiert eine angeborene Immunsystem Signalweg zur lytischen Replikation ⁵ zu fördern. Insbesondere aktiviert γHV68 de novo Infektion das Immunsystem Kinase IKK und aktiviert IKK phosphoryliert den Master viralen Transkriptionsfaktor, Replikation und Transaktivator (RTA), um virale Transkriptionsaktivierung zu fördern. Dabei γHV68 effizient Paare ihre Transkriptionsaktivierung zu angeborenen Immunaktivierung hosten, wodurch Transkription und viralen lytische Replikationsursprung. Diese Studie liefert ein hervorragendes Beispiel, die andere Viren angewendet werden kann, um Wirt-Virus-Interaktion zu verhören.

Protocol

Ein. Maus Infektion mit γHV68

1. Sechs bis acht Wochen alte, Geschlecht abgestimmt Wurfgeschwister Mäusen (8 bis 12 Mäuse / Gruppe) sind für die virale Infektion verwendet. Lassen Mäusen zu akklimatisieren über vier volle Tage (96 Stunden) nach der Auslieferung.
2. Protocol Schritte mit Virus sollte in einem Schrank der Sicherheitsstufe 2 (BSL2) unter Verwendung von Standard BSL2 Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden.
3. Planen Virussuspension (40 bis 1 x 10 ⁵ Plaque-bildenden Einheiten [PFU]) des γHV68 in 30 ul sterilem PBS pro Maus kurz vor dem Experiment. Halten Virussuspension auf Eis.
4. Bereiten Ketamin / Xylazin-Lösung (1,5 mg Ketamin und 0,15 mg xylazine/20 g Körpergewicht, 100 ul / Maus) für Maus Sedierung. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse, indem Sie einen Zeh Prise wurden sediert.
5. Sedate Mäuse mit 1,5 mg Ketamin und 0,15 mg Xylazin pro 20 mg Körpergewicht (100 ul / Maus) durch intraperitoneale Injektion.
6. Deliver Virussuspension (30 ul / Maus) intranasal in einer tropfenweiseMode, um ein Nasenloch der sedierten Mäusen.
7. Lay Mäusen auf einer Seite für 5 - 10 min, um die Atemwege Lieferung des Virus in die Lunge zu erleichtern.
8. Ort Mäusen zurück in den Käfig und Monitor Mäusen, bis sie vollständig von Sedierung erholt haben.
9. An verschiedenen Tagen nach der Infektion, opfern Mäuse durch CO ₂ Ersticken und Ernte der Lunge nachdem sie sich vergewissert Tod / Verlust der tiefen Bewusstsein. Ort Lunge in sterile 1,5 ml mit Schraubverschluss Röhrchen mit 500 ul von 1,0 mm Zirkonia / Silica Kügelchen. Halten Röhrchen auf Eis. Proben bei -80 ° C, wenn nicht fortfahren mit dem nächsten Schritt am selben Tag. Die Milz oder Lebergewebe könnte zu diesem Zeitpunkt für die Analyse viraler Latenz abhängig Zeitrahmen von Experiment gesammelt werden.
10. 1 ml kaltem serumfreiem DMEM in das Rohr und Homogenisierung der Lungen durch wulstförmige Schlagen 30 Sekunden. Chill Röhrchen auf Eis für mindestens 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
11. Zentrifuge Lunge Lysaten bei 16.000 xg bei 4 ° C für 1 min und verwenden supernatant auf virale Titer durch einen Plaque-Assay mit einem NIH3T3 oder BHK21 Monoschicht (siehe Abschnitt 5 für weitere Details) zu bestimmen.

2. Bestimmen γHV68 mehrstufigen Wachstumskinetik in embryonale Maus-Fibroblasten

1. Wachsen wild-type embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) und diese mangelhaft in einem Host Gen sub-konfluenten (ca. 80%) Dichte vor dem Plattieren Zellen.
2. Split MEFs in 24-Well-Platte bei 10.000 Zellen / Vertiefung für einen niedrigen multipilicity-of-Infektion (MOI) am Tag vor der Infektion. Experimente werden normalerweise in Triplikaten und bei einer MOI von 0,001 durchgeführt - 0,05 wird üblicherweise verwendet.
3. Planen γHV68 enthaltende Suspension gewünschte Menge an Virus (0,5 ml pro Vertiefung).
4. Entfernen mittleren und decken MEFs mit 0,5 ml γHV68 Suspension pro gut.
5. Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator, rock alle 30 min, und ermöglichen Inkubation für 2 h fort.
6. Entfernen Virussuspension und decken Zellen mit 0,5 ml frische complete DMEM Medium mit 8% fötalem Rinderserum.
7. An verschiedenen Tagen nach der Infektion, ernten das Medium und Zellen in sterile 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Unmittelbar einzufrieren Röhrchen bei -80 ° C.
8. Release γHV68 von MEFs durch Einfrieren bei -80 ° C, Auftauen in 37 ° C Wasserbad und Vortexen. Drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen wird üblicherweise auf die Proben aufgebracht.
9. Bestimmen Virustiter durch einen Plaque-Assay mit einem NIH3T3 oder BHK21 Monoschicht (siehe Kapitel 5 für Details).
10. Lesen virale Titer und Grundstück γHV68 mehrstufigen Wachstumskurve auf MEFs.

3. Molekulare Dissektion γHV68 lytische Replikation in embryonale Maus-Fibroblasten

1. Führen Virusinfektion wie in den Schritten von 2,1 bis 2,6 des § 2 beschrieben.
2. An verschiedenen Tagen nach der Infektion, den Überstand verwerfen. Spülen Zellen mit kaltem PBS und trypsinieren Zellen. Pellet Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 xg bei Raumtemperatur für 1 min. Überstand verwerfen undShop Zellen bei -80 ° C.
3. Auszug Gesamt-DNA (Host und virale Genom) und Gesamt-RNA nach zuvor publizierten Methoden ^5,6.
4. Eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von Gesamt-DNA und Primer, die spezifisch für Transkripte lytischen wie RTA (ORF 50), ORF 57 und ORF60. Bestimmung der relativen Menge an intrazellulären γHV68 Genom in Bezug auf ein Host-Haushaltsgen (zB β-Actin).
5. Um genomische DNA-Kontaminationen zu entfernen, ist die Behandlung mit RNase-freier DNase kritisch für cDNA-Präparation mit Gesamt-RNA und Oligo (dT) _11-19 Primer. Siehe 5 für weitere Einzelheiten über die RNA-Extraktion einschließlich der Behandlung mit RNase-freier DNase und RT-PCR verweisen. Eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von cDNA und Primer, wie oben, um die relative Menge der viralen Transkripte in Bezug auf die der Host-Haushaltsgen zu bestimmen.

4. Erzeugung von rekombinanten γHV68 mit bacterial artificial chromosome

Das Method hier beschriebenen wird verwendet, um Mutationen in einem γHV68 Gen, das in Wirt-Virus-Interaktion beteiligt ist einzuführen.

1. Planen ein DNA-Fragment (etwa 1,5 kb) des Wildtyp-Sequenz oder eine Sequenz trägt gewünschten Mutationen in der zentralen Region durch PCR.
2. Planen bakterielles künstliches Chromosom (BAC), die ein Transposon-Insertion ⁷ enthält auf der ganzen Mutationsstelle, der spezifisch das Gen inaktiviert Gen von Interesse durch MIDI-Aufreinigung (OriGene). Shop BAC DNA bei 4 ° C (vermeiden Einfrieren / Auftauen von BAC DNA).
3. Transfizieren BAC-DNA und PCR-Produkt enthaltenden gewünschten Mutationen des Gens von Interesse in die Zellen (zB NIH3T3 oder BHK21), die hoch permissiv γHV68 lytischen Replikation sind, mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Halten Aufspaltung Zellen bis cytopathischen Effekt (CPE) zeigt sich in der Monoschicht. Collect virushaltigen Überstand und, falls notwendig, zu amplifizieren Virus in NIH3T3 oder BHK21 Zellen.
5. Infect NIH3T3-Zellen mitrekombinantes Virus durch Zentrifugation bei 1800 UpM, 30 ° C für 30 min.
6. Ernte γHV68-infizierten NIH3T3-Zellen und bereiten zirkularisierten viralen Genoms mit Hirt-Protokoll ^8,9.
7. Transformieren Electro-MAX DH10B kompetente Zellen (Invitrogen) durch Elektroporation und Bildschirm für Kolonien, die Resistenz gegen Chloramphenicol (Cm), aber empfindlich gegenüber Kanamycin (Kan) (Cm-resistenten Gen ist in BAC Rückgrat, während Kan-resistentes Gen ist Transposon sind Insertion).
8. Wachsen Cm ^R Kan ^S Kolonien in Medium mit chlorophenicol und bereiten BAC DNA mit Mini-oder Midi-scale Reinigung (OriGene).
9. Überprüfen der gewünschten Mutation in der Ziel-Gen durch PCR unter Verwendung von Primern die spezifisch für flankierenden Regionen der Mutationsstelle und Sequenzierung.
10. Bestätigen keine Chromosom Umlagerung in BAC durch Verdau mit ausgewählten Restriktionsenzymen und Puls-Feld-Gelelektrophorese.
11. Transfizieren rekombinanten BAC in NIH 3T3 oder BHK21 Zellen mit Lipofectamin2000 (Invitrogen) zur Herstellung von rekombinantem γHV68.
12. Halten Passagierung Zellen bis CPE zeigt sich in der Monoschicht. Collect virushaltigen Überstands und verstärken rekombinantes γHV68 in NIH3T3 oder BHK21 Zellen.
13. Bestimmen Titer des rekombinanten Virus und charakterisieren das virale Wachstum Eigenschaften ex vivo und in vivo wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben.

5. Bestimmen Virustiter durch einen Plaque-Assay

1. Wachsen NIH3T3 Zellen sub-konfluenten (ca. 80%) Dichte vor dem Plattieren Zellen.
2. NIH3T3 aufgeteilt in 24-Well-Platte mit 20.000 Zellen / Vertiefung am Tag vor der Infektion.
3. Planen 10-fach seriell verdünnten Virus-Überstände mit DMEM-Medium mit 8% Neugeborenen-Kalbsserum (NCS).
4. Entfernen mittleren und decken NIH3T3-Zellen mit 0,5 ml γHV68 Suspension.
5. Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator, rocken alle 30 min, und ermöglichen Inkubationszeit, um fortzufahrenfür 2 Stunden.
6. Entfernen Virussuspension und Deckel Zellen mit 0,5 ml DMEM-Medium mit 2% NCS und 0,75% Methylcellulose (Sigma).
7. Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator. Graf Plaques am Tag 6 nach der Infektion. Die Färbung der Monoschicht, mit Kristallviolett zB fördern kann Plaque Zählen.
8. Berechnen den Virustiter in den unverdünnten Gewebelysaten oder Zelllysaten unter Verwendung der folgenden Formel: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N die mittlere Anzahl von Plaque an einer geeigneten Verdünnung; D, Verdünnung fach (zB 5, 10, 100 .....) V (pl), Volumen von seriell verdünnten Überstand gegeben pro Napf.

6. Repräsentative Ergebnisse:

^{- / -} Maus ^10, γHV68 lytische Replikation Phänotypen in embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) und recombin Drei repräsentative Zahlen sind hier, einschließlich γHV68 lytische Replikation in der Lunge von Wildtyp-und Mavs angezeigtant γHV68 mit Mutationen in den Phosphorylierungsstellen, moduliert durch die MAVS-abhängige IKK sind. Diese drei übereinstimmende Experimenten ein System dar, um die Rollen des angeborenen Immunsystems Komponenten in γHV68 lytische Replikation in vivo und ex vivo zu definieren.

Abbildung 1 γHV68 Lasten in den Lungen von Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{-. / -} Mäusen. A) Zwei wesentliche angeborenen Signalwege hinter MAVS. Die MAVS Adaptormolekül Relais Signalisierung von cytosolischen RIG-I-ähnliche Rezeptoren an NFkB und Interferon regulatorischer Faktoren (IRF), die ihrerseits bis zu regulieren die Genexpression von entzündungsfördernden Zytokinen und Interferonen aktivieren. B) Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} Mäuse wurden mit 40 PFU γHV68 intranasal und Viruslast in der Lunge zum angegebenen Zeitpunkten infiziert wurden abzuschrecken abgebaut durch einen Plaque-Assay mit NIH3T3 Monoschicht. Jedes Symbol stellt eine Maus.

Abbildung 2. ΓHV68 lytische Replikationskinetik in embryonale Maus-Fibroblasten (MEF). Die lytische Replikation γHV68 auf Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} MEFs wurde durch mehrstufige Wachstumskurven (A) und quantitative real-time PCR (B) beurteilt. Bei beiden Versuchen wurden gleiche Anzahl von MEF und Menge γHV68 für Virusinfektion bei einer Multiplizität-of-Infektion (MOI) von 0,01 verwendet. (A) Zellen und Überstände wurden bei angegebenen Zeitpunkten geerntet und unterliegen einem Plaque-Assay auf virale Titer zu bestimmen. (B) Gesamt-RNA aus γHV68-infizierten MEFs extrahiert und analysiert mittels quantitativer real-time PCR mit spezifischen Primern für ausgewählte lytische Transkripte (RTA, ORF 57, und ORF60).

ig3.jpg "/>
Abbildung 3. Die lytische Replikationskinetik von rekombinanten γHV68 mit Mutationen innerhalb der RTA Transaktivierungsdomäne, die Phosphorylierung durch IKKγ abzuschaffen. (A) Mehrstufengetriebe Wachstumskurven von rekombinanten Wildtyp-Virus (γHV68.wt) und mutierte Virus (γHV68.mut) in Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} MEF-Zellen (MOI = 0,01). MEFs wurden mit γHV68 bei einer MOI von 0,01 infiziert. Zellen und Überstände wurden bei angegebenen Zeitpunkten geerntet und virale Titer wurden durch einen Plaque-Assay mit NIH 3T3 Monoschicht bestimmt. (B) γHV68 RTA mRNA-Ebene in γHV68-infizierten NIH3T3-Zellen (MOI = 0,01). Bei 30 h nach Infektion wurde Gesamt-RNA aus γHV68-infizierten NIH 3T3-Zellen extrahiert und analysiert mittels quantitativer real-time PCR.

Discussion

In Reaktion auf virale Infektion werden die MAVS-abhängigen Signalwege angeborene Immunsystem aktiviert, um die Herstellung von antiviralen inflammatorischen Zytokinen ^10-14 fördern. Mit murine γHV68 als Modell Virus für Menschen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epstein-Barr-Virus ^3,4 entdeckten wir, dass γHV68 usurpiert die Mavs-IKK Weg zur lytischen Replikation über Transkriptionsaktivierung ⁵ zu fördern. Verwendung genetisch veränderter MEFs und Techniken in der molekularen Virologie, ermöglicht dieses Protokoll effiziente Identifizierung von Signalkomponenten eines bestimmten Weges, die kritisch für γHV68 lytischen Replikation sind. Als solche beinhaltet dieses Protokoll die in-vivo-Infektion, ex vivo lytische Replikation und Dissektion des angeborenen Immunsystems Signalweg. Um die molekularen Mechanismen, zusätzliche Verfahren einschließlich der bacterial artificial chromosome abzugrenzen, um rekombinante Herpes erzeugenVirus und Molekularbiologie Versuche notwendig. Zusätzlich sind Knockout-Maus-Stämme und Fibroblasten Schlüssel für diese Experimente. Mit einer großen Anzahl von Knockout-Maus-Stämme zur Verfügung, wird dies Netzwerkprotokolle unterstützt die molekulare Zerlegung Host Signalwege und viralen Eingriff davon. Im Falle, dass Knockout-Mäusen und MEFs nicht verfügbar sind (z. B. durch Letalität) kann RNAi / shRNA-vermittelte Knockdown gesucht werden. Zusätzliche Einschränkungen dieses Protokolls umfassen: 1) ein Übersprechen zwischen Signalwege, 2) überlappende Funktionen von Kandidaten-viralen Faktoren, 3) Potential letale Wirkung auf γHV68 Replikation von Mutationen. Obwohl dieses Protokoll wurde direkt auf Rollen von angeborenen Immunsystems Komponenten in γHV68 lytische Replikationsursprung insbesondere ausweisen aufgebracht, können ähnliche Strategien verwendet werden, um die wichtigen Rollen von einer ausgewählten Komponente in anderen Host Signalwegen in der viralen Infektion in vivo und ex vivo zu definieren.

Es istwichtig zu beachten, dass unsere Rekombination Ansatz in transfizierten Zellen der aufwändige Schritte zur Identifizierung BAC rekombinanten in E.coli erforderlich umgeht, ermöglicht die effiziente Einführung von Mutationen in dem Gen-of-interest. Insbesondere erzeugt homologe Rekombination zwischen BAC und PCR-Produkte enthält, ausgelegt Mutationen infektiösen BAC-Klone, die wiederum geben an rekombinantes γHV68 ansteigen. Allerdings beruht dieses Protokoll auf das Wesentliche Gens und Mutationen, die nicht sollen eine vollständige Inaktivierung der Viren. Wenn Mutationen vollständig zu inaktivieren γHV68 werden Transfektionen nicht erwartet rekombinantes Virus zu erzeugen. Wir wissen, dass Informationen aus murinen γHV68 gelernt werden möglicherweise nicht identisch gelten für die menschliche KSHV und EBV. Jedoch können die Strategien zur viralen Immunevasion und Ausbeutung zu diesen Mechanismen sezieren Humanpathogenen Verwendung von kultivierten Zellen angewendet werden. Unsere Erkenntnisse aus der Maus Infektion mit γHV68 abgeleitet damit wird uns d anweisen,esigning bessere Experimente menschlichen KSHV und EBV zu studieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006