Summary
हम एक मॉडल herpesvirus, गामा 68 herpesvirus (γHV68) lytic प्रतिकृति में मेजबान संकेतन अणुओं की महत्वपूर्ण भूमिका की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों और γHV68 lytic प्रतिकृति के लिए भ्रूण fibroblasts उपयोग, प्रोटोकॉल दोनों प्ररूपी लक्षण वर्णन और वायरल lytic प्रतिकृति में वायरस मेजबान बातचीत की आणविक पूछताछ परमिट.
Protocol
1. ΓHV68 साथ माउस संक्रमण
- छह से आठ सप्ताह के पुराने, लिंग मिलान littermate चूहों (8 से 12 चूहों / समूह) वायरल संक्रमण के लिए किया जाता है. चूहों पर acclimate लदान के बाद चार पूरे दिन (96 घंटे) की अनुमति दें.
- प्रोटोकॉल कदम वायरस का उपयोग जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) मानक BSL2 सावधानियों का उपयोग कर के एक कैबिनेट में बाहर किया जाना चाहिए.
- वायरल निलंबन तैयार (40 से 1 x 10 5 इकाइयों पट्टिका गठन [pfu]) γHV68 के प्रयोग से पहले सिर्फ माउस प्रति बाँझ पीबीएस के 30 μl में. बर्फ पर वायरल निलंबन रखें.
- माउस बेहोश करने की क्रिया के लिए ketamine / xylazine समाधान (1.5 मिलीग्राम ketamine और 0.15 मिलीग्राम xylazine/20 छ शरीर के वजन, 100 μl / माउस) तैयार करें. सुनिश्चित करें कि चूहों के एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके बेहोश किया गया है.
- 1.5 मिलीग्राम ketamine और 0.15 अंतर peritoneal इंजेक्शन द्वारा 20 मिलीग्राम शरीर के वजन (100 μl / माउस) प्रति मिलीग्राम xylazine के साथ शांत चूहों.
- वायरल निलंबन (30 μl / माउस) intranasally में एक बूंद के लिहाज से, उद्धारबेहोश चूहों के एक नथुने फैशन.
- 5 के लिए एक तरफ चूहों रखना - 10 मिनट के लिए फेफड़ों में वायरस की airway डिलीवरी की सुविधा.
- जगह वापस पिंजरे और निगरानी के चूहों में चूहों, जब तक वे पूरी तरह से बेहोश करने की क्रिया से बरामद किया है.
- विभिन्न संक्रमण के बाद के दिनों में, सीओ 2 asphyxiation और गहरी चेतना की मौत / हानि आश्वस्त करने के बाद फेफड़ों फसल से चूहों बलिदान. बाँझ 1.5 मिलीलीटर पेंच से ढकी 1.0 मिमी / Zirconia सिलिका मोतियों की 500 μl युक्त ट्यूबों में जगह फेफड़ों. बर्फ पर ट्यूब रखें. स्टोर नमूने -80 पर ° C उसी दिन पर अगर कार्यवाही अगले कदम के लिए नहीं है. तिल्ली या जिगर ऊतक वायरल विलंबता के विश्लेषण के प्रयोग के समय सीमा के आधार पर करने के लिए इस समय में एकत्र किया जा सकता है.
- ट्यूब में ठंड सीरम मुक्त DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें और मनका मार 30 सेकंड के द्वारा फेफड़ों homogenize. बर्फ पर कम से कम 1 मिनट के लिए ट्यूब शांत रहो. एक बार इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- अपकेंद्रित्र फेफड़ों 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 आरसीएफ में lysates और supern का उपयोगएक NIH3T3 या BHK21 monolayer (विवरण के लिए धारा 5 देखें) का उपयोग करते हुए एक पट्टिका परख वायरल अनुमापांक निर्धारित atant.
2. निर्धारित γHV68 बहु कदम माउस भ्रूणीय fibroblasts में विकास कैनेटीक्स
- प्रकार के जंगली माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) और उन लोगों की एक मेजबान के उप सहधारा चढ़ाना कोशिकाओं से पहले घनत्व (लगभग 80%) के लिए जीन में कमी के लिए आगे बढ़ें.
- 24 अच्छी तरह से थाली में 10,000 कोशिकाओं को MEFs भाजित / अच्छी तरह से एक multipilicity के संक्रमण संक्रमण से पहले दिन कम (MOI). प्रयोगों triplicates और एक MOI में सामान्य रूप से कर रहे हैं .001 के बीच किया जाता है - 0.05 आम तौर पर प्रयोग किया जाता है.
- वायरस के वांछित राशि (0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह से प्रति) युक्त γHV68 निलंबन तैयार.
- मध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रति γHV68 निलंबन के 0.5 मिलीलीटर के साथ MEFs को कवर.
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर, रॉक हर 30 मिनट में थाली सेते हैं, और ऊष्मायन 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
- वायरल निलंबन निकालें, और 0.5 मिलीलीटर ताजा ग के साथ कोशिकाओं को कवरomplete DMEM मध्यम 8% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त.
- विभिन्न संक्रमण के बाद के दिनों में, बाँझ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मध्यम और कोशिकाओं फसल. तुरंत -80 में ट्यूबों फ्रीज डिग्री सेल्सियस
- -80 में ठंड से MEFs से γHV68 ° रिलीज सी, 37 में विगलन ° C जल स्नान और vortexing. ठंड और विगलन के तीन चक्र आमतौर पर. नमूने के लिए लागू किया जाता है.
- एक NIH3T3 या BHK21 monolayer (विवरण के लिए धारा 5 देखें) का उपयोग करते हुए एक पट्टिका परख वायरल titer का निर्धारण करते हैं.
- वायरल titer और साजिश γHV68 बहु कदम MEFs वृद्धि वक्र पढ़ें.
3. माउस भ्रूणीय fibroblasts में γHV68 lytic प्रतिकृति की आण्विक विच्छेदन
- वायरल संक्रमण के प्रदर्शन के रूप में 2.1 चरणों में 2.6 धारा 2 के लिए वर्णित है.
- विभिन्न संक्रमण के बाद के दिनों में, सतह पर तैरनेवाला त्यागें. ठंड पीबीएस और trypsinize कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं कुल्ला. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कोशिकाओं. तैरनेवाला त्यागें और-80 पर दुकान कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
- पहले प्रकाशित 5,6 तरीकों के लिए अनुसार कुल (मेजबान और वायरल जीनोम) डीएनए और कुल शाही सेना निकालें.
- वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन कुल डीएनए और (ORF50) आरटीए, ORF57 और ORF60 जैसे वायरल lytic टेप, के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर. एक मेजबान गृह व्यवस्था जीन (जैसे, β-actin) संदर्भ में intracellular γHV68 जीनोम के रिश्तेदार मात्रा का निर्धारण करते हैं.
- जीनोमिक डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए, RNase मुक्त DNase के साथ इलाज के कुल शाही सेना और oligo (डीटी) 11-19 प्राइमर के साथ सीडीएनए तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. RNase मुक्त DNase और RT-पीसीआर के साथ उपचार सहित शाही सेना निष्कर्षण के बारे में अधिक जानकारी के लिए 5 संदर्भ देखें. इसके बाद के संस्करण के रूप में वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन सीडीएनए और प्राइमरों का उपयोग करने के लिए गृह व्यवस्था जीन मेजबान की है कि करने के लिए संदर्भ में वायरल टेप के रिश्तेदार मात्रा निर्धारित.
4. सृजन रीकॉम्बीनैंट γHV68 का उपयोग जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र
methoघ यहाँ वर्णित मेजबान वायरस बातचीत में शामिल है एक γHV68 जीन में परिवर्तन लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- जंगली प्रकार के अनुक्रम या पीसीआर द्वारा केंद्रीय क्षेत्र में वांछित म्यूटेशनों ले जाने अनुक्रम के डीएनए टुकड़ा (के बारे में 1.5 केबी) तैयार करें.
- जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) है कि उत्परिवर्तन साइट है, जो विशेष रूप से ब्याज की जीन midi पैमाने शुद्धि (OriGene) द्वारा, जीन inactivates के आसपास एक transposon प्रविष्टि 7 शामिल हैं तैयार. 4 में स्टोर बीएसी डीएनए ° C (/ बीएसी डीएनए की विगलन ठंड से बचने के लिए).
- Transfect बीएसी डीएनए और पीसीआर उत्पाद (जैसे, NIH3T3 या BHK21 सेल), जो अत्यधिक γHV68 lytic प्रतिकृति अनुमोदक 2000 Lipofectamine (Invitrogen) के साथ कर रहे हैं, के हित के जीन की वांछित परिवर्तन युक्त.
- बंटवारे कोशिकाओं रखें जब तक कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (CPE) monolayer में दिखाता है. वायरस युक्त तैरनेवाला ले लीजिए और यदि आवश्यक हो, NIH3T3 या BHK21 कोशिकाओं में वायरस बढ़ाना.
- साथ NIH3T3 कोशिकाओं संक्रमितrpm १,८०० पर centrifugation द्वारा पुनः संयोजक वायरस, 30 ° 30 मिनट के लिए सी.
- हार्वेस्ट γHV68 संक्रमित NIH3T3 कोशिकाओं और वायरल circularized Hirt 8,9 प्रोटोकॉल का उपयोग कर जीनोम तैयार.
- Electroporation और स्क्रीन के द्वारा कालोनियों के है कि chloramphenicol प्रतिरोध (सेमी), लेकिन (कान) केनामाइसिन (सेमी प्रतिरोधी जीन बीएसी रीढ़ में है, जबकि कान प्रतिरोधी जीन transposon में प्रति संवेदनशील हैं के लिए बदलना इलेक्ट्रो मैक्स DH10B सक्षम कोशिकाओं (Invitrogen) ) प्रविष्टि.
- Cm आर एस कान मध्यम युक्त chlorophenicol में कालोनियों को विकसित और या छोटा midi पैमाने शुद्धि (OriGene) के साथ बीएसी डीएनए तैयार.
- पीसीआर द्वारा वांछित लक्ष्य जीन में उत्परिवर्तन सत्यापित करें, उत्परिवर्तन साइट के क्षेत्रों flanking, और अनुक्रमण के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके.
- बीएसी में कोई चयनित प्रतिबंध एंजाइमों और नाड़ी क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ पाचन से गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था की पुष्टि.
- NIH 3T3 या BHK21 कोशिकाओं में Lipofectamine साथ पुनः संयोजक बीएसी transfect2000 (Invitrogen) रीकॉम्बीनैंट γHV68 तैयार करने के लिए.
- कोशिकाओं passaging रखें जब तक CPE monolayer में दिखाता है. वायरस युक्त तैरनेवाला ले लीजिए और कोशिकाओं NIH3T3 या BHK21 में γHV68 रीकॉम्बीनैंट बढ़ाना.
- पुनः संयोजक वायरस के अनुमापांक निर्धारण और वायरल विकास गुण पूर्व और vivo में vivo के रूप में 1 और 2 वर्गों में वर्णित विशेषताएँ.
5. एक पट्टिका परख द्वारा वायरल अनुमापांक निर्धारित
- उप सहधारा घनत्व (लगभग 80%) चढ़ाना कोशिकाओं पहले NIH3T3 कोशिकाओं आगे बढ़ें.
- 24 अच्छी तरह से थाली में / 20,000 कोशिकाओं को संक्रमण से पहले दिन पर अच्छी तरह से NIH3T3 भाजित.
- DMEM मध्यम 8% नवजात बछड़ा सीरम (NCS) युक्त 10 गुना serially पतला वायरस supernatants तैयार.
- मध्यम निकालें और γHV68 निलंबन के 0.5 मिलीलीटर के साथ NIH3T3 कोशिकाओं को कवर.
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं, हर 30 मिनट रॉक और ऊष्मायन आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं2 घंटे के लिए.
- 0.5 मिलीलीटर DMEM 2% NCS युक्त मध्यम और 0.75% (सिग्मा) methylcellulose के साथ वायरल निलंबन और कवर कोशिकाओं निकालें.
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं. 6 दिन के बाद से संक्रमण में सजीले टुकड़े गिनो. Monolayer, क्रिस्टल वायलेट के साथ उदा के धुंधला हो जाना पट्टिका गिनती सुविधा हो सकती है.
- Undiluted ऊतक lysates में वायरल titer की गणना या निम्न सूत्र का उपयोग सेल lysates: अनुमापांक (pfu / मिलीलीटर) = डी एक्स एन x 1000 / μl मिलीलीटर ÷ वी μl. N, एक उपयुक्त कमजोर पड़ने पर पट्टिका संख्या का मतलब, विकास, कमजोर पड़ने (जैसे के रूप में 5, 10, 100 .....) गुना वी (μl), serially पतला तैरनेवाला की मात्रा प्रति अच्छी तरह से जोड़ा.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
यहाँ तीन प्रतिनिधि आंकड़े दिखाए जाते हैं जंगली प्रकार और Mavs के फेफड़ों में γHV68 lytic प्रतिकृति सहित / 10 माउस, माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEF) में γHV68 lytic प्रतिकृति phenotypes, और recombinMAVs पर निर्भर IKKβ द्वारा modulated phosphorylation साइटों है कि के भीतर चींटी γHV68 म्यूटेशनों ले. ये तीन corroborating प्रयोगों vivo और पूर्व vivo में γHV68 lytic प्रतिकृति में सहज प्रतिरक्षा घटक की भूमिका को परिभाषित करने के लिए एक योजना का गठन.
चित्रा 1 + + / Mavs और Mavs के फेफड़ों में γHV68 भार चूहों /. ए) दो मुख्य जन्मजात संकेतन Mavs के बहाव के रास्ते में. Mavs अनुकूलक अणु साइटोसोलिक RIG-I की तरह रिसेप्टर्स से संकेत NFκB और इंटरफेरॉन विनियामक कारकों (IRFs) कि, बारी में, proinflammatory साइटोकिन्स और इंटरफेरॉन के जीन की अभिव्यक्ति अप विनियमित सक्रिय रिले. बी) Mavs + + / Mavs / - चूहों 40 γHV68 intranasally pfu और फेफड़ों में वायरल लोड के साथ संकेत समय बिंदुओं पर संक्रमित थे रोकते एक पट्टिका NIH3T3 monolayer का उपयोग परख द्वारा खनन. प्रत्येक प्रतीक एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2 माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) में γHV68 lytic प्रतिकृति कैनेटीक्स. lytic प्रतिकृति Mavs पर γHV68 की + / + और Mavs - / - MEFs बहु कदम विकास (A) घटता है और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (बी) के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. दोनों प्रयोगों के लिए, MEFs की बराबर संख्या और γHV68 की राशि वायरल संक्रमण के लिए 0.01 की बहुलता के संक्रमण (MOI) में इस्तेमाल किया गया. (ए) कोशिकाओं और supernatants संकेत समय बिंदुओं पर काटा गया और एक पट्टिका वायरल titers निर्धारित परख के अधीन. (बी) कुल शाही सेना γHV68 संक्रमित MEFs से निकाला गया था और मात्रात्मक वास्तविक समय चयनित lytic टेप (आरटीए, ORF57, और ORF60) के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया.
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चित्रा 3. RTA transactivation डोमेन के भीतर ले जाने रीकॉम्बीनैंट γHV68 परिवर्तन कि IKKγ द्वारा phosphorylation समूल समाप्त करने का lytic प्रतिकृति कैनेटीक्स. (ए) बहु कदम पुनः संयोजक वायरस जंगली प्रकार के विकास घटता (γHV68.wt) और उत्परिवर्ती वायरस में Mavs (γHV68.mut) + / + और Mavs / - MEFs कोशिकाओं (MOI = 0.01). MEFs γHV68 साथ 0.01 की MOI में संक्रमित थे. कोशिकाओं और supernatants संकेत समय बिंदुओं पर काटा गया और वायरल titers एक पट्टिका NIH 3T3 monolayer का उपयोग परख द्वारा निर्धारित किया गया है. (बी) γHV68 संक्रमित NIH3T3 कोशिकाओं में γHV68 RTA mRNA स्तर (MOI = 0.01). कम 30 घंटे के बाद संक्रमण, कुल शाही सेना γHV68 संक्रमित NIH 3T3 कोशिकाओं से निकाला गया था और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण.
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Discussion
वायरल संक्रमण के जवाब में, Mavs निर्भर सहज प्रतिरक्षा संकेत रास्ते को antiviral भड़काऊ 10-14 साइटोकिन्स के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए सक्रिय हैं. Murine γHV68 मानव oncogenic Kaposi है sarcoma-जुड़े herpesvirus और Epstein-बर्र वायरस 3,4 के लिए एक मॉडल के वायरस के रूप में उपयोग करना, हम पता चला कि γHV68 usurps मार्ग MAVs IKKβ transcriptional 5 सक्रियण के माध्यम से वायरल lytic प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए है. आनुवंशिक रूप से संशोधित MEFs और आणविक विषाणु विज्ञान में तकनीक को रोजगार, इस प्रोटोकॉल एक विशेष मार्ग के घटकों कि γHV68 lytic प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण हैं संकेत के कुशल पहचान की अनुमति देता है. जैसे, इस प्रोटोकॉल vivo संक्रमण, पूर्व vivo lytic प्रतिकृति, और सहज प्रतिरक्षा संकेतन मार्ग के विच्छेदन में जरूरत पर जोर देता है. आणविक तंत्र, जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र सहित अतिरिक्त प्रक्रियाओं को चित्रित पुनः संयोजक दाद उत्पन्नवायरस और आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं. इसके अतिरिक्त, पीटकर माउस उपभेदों और fibroblasts इन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं. पीटकर माउस उपभेदों उपलब्ध की एक बड़ी संख्या के साथ, इस प्रोटोकॉल मेजबान रास्ते और वायरल हस्तक्षेप क्या संकेत के आणविक विच्छेदन सक्षम हो जाएगा. घटना में है कि पीटा चूहों और MEFs उपलब्ध नहीं हैं (जैसे, मारक करने के लिए कारण), / आरएनएआई shRNA की मध्यस्थता पछाड़ना मांगी जा सकती है. इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त सीमाओं संकेत दे रास्ते के बीच crosstalk) 1, 2) उम्मीदवार वायरल कारकों, 3 के कार्यों अतिव्यापी) म्यूटेशनों द्वारा संभावित γHV68 प्रतिकृति पर घातक प्रभाव: शामिल हैं. हालांकि इस प्रोटोकॉल सीधे लिए γHV68 विशेष रूप में lytic प्रतिकृति के में सहज प्रतिरक्षा घटक की भूमिका की पहचान के लिए लागू किया गया था, इसी तरह की रणनीति अन्य vivo और पूर्व vivo में वायरल संक्रमण के दौरान रास्ते संकेतन मेजबान में चयनित घटक की महत्वपूर्ण भूमिका को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यह हैकृपया ध्यान दें कि हमारे ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में पुनर्संयोजन दृष्टिकोण श्रम गहन ई. कोलाई में रीकॉम्बीनैंट बीएसी की पहचान करने के लिए आवश्यक कदम नजरअंदाज, जीन के ब्याज में म्यूटेशनों के कुशल परिचय की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, बीएसी और पीसीआर करने के लिए डिज़ाइन म्यूटेशनों युक्त उत्पादों के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन संक्रामक बीएसी क्लोन है कि, बारी में, γHV68 रीकॉम्बीनैंट को जन्म दे पैदा करता है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल आवश्यक जीन और परिवर्तन है कि पूरी तरह से वायरस को निष्क्रिय नहीं कर रहे हैं पर निर्भर करता है. यदि म्यूटेशनों पूरी तरह से निष्क्रिय γHV68, transfections पुनः संयोजक वायरस उत्पन्न करने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं. हम महसूस करते हैं कि γHV68 murine से सीखा जानकारी हूबहू मानव KSHV और EBV लागू नहीं हो सकता है. हालांकि, रणनीतियों वायरल प्रतिरक्षा चोरी और शोषण तंत्र काटना इन मानव संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग कर रोगजनकों के लिए लागू किया जा सकता है. हमारे γHV68 साथ माउस संक्रमण से प्राप्त निष्कर्ष इस प्रकार हमें हिदायत जाएगाबेहतर प्रयोगों esigning मानव KSHV और EBV अध्ययन.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए डॉ. जेम्स (Zhijian) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं Mavs सहित आवश्यक अभिकर्मकों, प्रदान करने के लिए चेन (UT दक्षिण, आण्विक जीवविज्ञान) - / - चूहों, और डॉ. Ren रवि (कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स के विश्वविद्यालय, औषध और आण्विक चिकित्सा ) γHV68 के इस अध्ययन के लिए जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र प्रदान करने के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 | |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
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