모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

Summary

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

Abstract

바이러스 감염에 대한 응답으로, 호스트는 바이러스 시토 킨 생산 ^1,2로 이어질 타고난 면역 신호 경로를 활성화 등 다양한 방어 반응을 개발하고 있습니다. 호스트를 이식하기 위해서는, 바이러스는 호스트 항 바이러스 반응을 회피하고 신호 경로를 조작 할 고맙게 여기게됩니다. 호스트 바이러스 상호 작용을 이루는 물질은 바이러스 감염에 대한 소설 치료 전략의 개발에 빛을 발산합니다.

손쥐 γHV68은 밀접하게 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus 및 Epsten - 바 바이러스 ^3,4에 관한 것입니다. 실험실 쥐 γHV68 감염은 인간 herpesviruses를 사용할 수 없습니다 생체에서 호스트 응답 및 바이러스 감염의 전체 과정을 검토 할 수있는 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 γHV68 lytic replic에 phenotypic 특성에 대한 방법의 패널 및 호스트 신호 구성 요소의 분자 절개를 제시생체 및 예 생체 내 두 ation. 유전자 변형 마우스 종자의 사용 가능 여부는 생체 내 γHV68 급성 감염시 호스트 신호 경로의 역할의 심문을 할 수 있습니다. 또한 이러한 결함 마우스 종자로부터 격리 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs는) 추가 γHV68 lytic 복제 예를 생체 동안 이러한 분자의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

virological 및 분자 생물학의 assays 사용하여, 우리는 호스트 바이러스 상호 작용의 분자 메커니즘을 정확히하고 바이러스 lytic 복제에 필수적 호스트 및 바이러스 유전자를 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 세균 인공 염색체 (BAC) 시스템은 특별히 호스트 바이러스 상호 작용을 방해 바이러스 요소 (들)에 변이의 도입을 용이하게한다. 이러한 변이를 들고 재조합 γHV68는 구성 요소를 신호 키 호스트의 결함 MEFs의 γHV68 lytic 복제 phenotypes을 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 생체 및 예 생체 내 개입의 여러 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 심문 할 수있는 훌륭한 전략을 제공합니다.

최근, 우리는 γHV68 usurps 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 lytic 복제 ⁵ 증진 것을 발견했습니다. 특히, γHV68 드 노보 감염 면역 키나제 IKKβ를 활성화하고 활성화 IKKβ는 바이러스 전사 활성화를 촉진하기 위해 마스터 바이러스 전사 인자, 복제 및 transactivator (RTA)을 phosphorylates. 그렇게함으로써, γHV68 효율적으로 커플 타고난 면역 활성화를 개최하기위한 전사 활성화함으로써 바이러스 트랜 스크립트 등의 lytic 복제를 촉진. 이 연구는 호스트 바이러스 상호 작용을 조사하기 위해 다른 바이러스에 적용 할 수있는 훌륭한 예를 제공합니다.

Protocol

1. γHV68와 마우스 감염

1. 로 6 년 8 주 오래된, 성별 일치 littermate 마우스 (8-12 마우스 / 그룹)은 바이러스 감염에 사용됩니다. 쥐가 선적 후 사 전체 일 (96 시간) 이상 순응 할 수 있습니다.
2. 바이러스를 사용하여 프로토콜 단계는 표준 BSL2주의를 사용하여 바이오 안전성 수준 2 (BSL2)의 캐비닛에서 수행해야합니다.
3. 단지 실험하기 전에 마우스를 당 멸균 PBS의 30 μl에 γHV68의 (40 1 개 10 ⁵ 상패 - 성형 장치 [PFU는]) 바이러스 정지를 준비합니다. 얼음 바이러스 정지세요.
4. 마우스 진정 작용을 위해 케타민 / xylazine 솔루션을 (1.5 MG의 케타민과 0.15 MG xylazine/20 g의 체중, 100 μl / 마우스) 준비합니다. 쥐가 발가락 핀치를 수행하여 회복 될했는지 확인합니다.
5. 1.5 MG의 케타민 및 내부 - 복막 주입 20 MG의 체중 (100 μl / 마우스) 당 0.15 밀리그램의 xylazine으로 마취 마우스.
6. 드롭 현명한에 intranasally 바이러스 정지 (30 μl / 마우스)를 제공진정제를 마우스 중 하나가 콧 구멍에 패션.
7. 5 한쪽에 마우스를 놓는다 - 10 분 폐에 바이러스의기도 전달을 촉진 할 수 있습니다.
8. 다시 케이지와 모니터 마우스에서 개최 마우스가 완전히 진정 작용에서 복구 할 때까지.
9. 다양한 일 후 감염에서 CO ₂ 질식과 사망 / 깊은 의식의 손실을 보장 후 수확 폐를하여 마우스를 희생. 장소 폐 1.0 mm의 지르코니아 / 실리카 구슬 500 μl를 포함하는 멸균 1.5 ML 나사 덮힌 튜브에. 얼음에 튜브세요. 스토어 샘플 -80 ° C에서 같은 날에 다음 단계로 진행하지 않을 경우. 비장 또는 간 조직은 실험 기간에 따라 바이러스 대기 시간의 분석을 위해이 시간에 수집 될 수 있습니다.
10. 관에 추위 혈청이없는 DMEM의 1 ML을 추가하고 구슬 - 심장이 두근 두근 30초하여 폐를 균질화. 최소 1 분 동안 얼음에 튜브를 죽일거야. 한 번이 과정을 반복합니다.
11. 원심 분리기의 폐는 1 분에 대해 4 ° C에서 16,000 rcf에 lysates과 supern를 사용하여NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 확인할 수 atant.

2. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 여러 단계 성장 속도론을 결정

1. 야생 타입 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs) 및 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도 호스트 유전자의 결함 사람들을 성장.
2. 10000 세포에서 24 잘 판에 MEFs 분할 / 잘 감염 전날에 (나 역시) multipilicity 수준의 감염 낮은하십시오. 실험은 보통 0.001 사이에 triplicates과 - 나에서 수행됩니다 - 0.05은 일반적으로 사용됩니다.
3. 바이러스의 원하는 금액 (0.5 ML 당 잘)를 포함 γHV68 정지를 준비합니다.
4. 미디어를 제거하고 잘 당 γHV68 정지의 0.5 ML로 MEFs을 다룹니다.
5. 조직 문화 인큐베이터, 바위마다 30 분에 금속판을 배양하고, 배양은 2시에 진행 할 수 있습니다.
6. 바이러스 정지를 제거하고, 0.5 ML 신선한 C와 세포를 포함omplete DMEM 매체은 8 % 태아 소 혈청을 포함.
7. 다양한 일 후 감염에서 멸균 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 매체와 세포를 수확. 즉시 -80에서 튜브를 고정 ° C.
8. -80에서 냉동 MEFs에서 출시 γHV68 ° C, 37 ° C에서 해동 물 욕조, vortexing. 동결 융해의 세 가지 사이클은 보통 샘플에 적용됩니다.
9. NIH3T3 또는 BHK21 monolayer를 (자세한 내용은 섹션 5를 참조)를 사용하여 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정합니다.
10. 바이러스 titer 및 MEFs에 플롯 γHV68 여러 단계 성장 곡선을 참조하십시오.

3. 마우스 배아 섬유 아세포에서 γHV68 lytic 복제 분자 해부

1. 제 2의 2.6 단계 2.1에 설명 된대로 바이러스 감염을 수행합니다.
2. 다양한 일 후 감염에서, 표면에 뜨는 폐기하십시오. 차가운 PBS와 trypsinize 세포와 세포를 씻어. 1 분 동안 실온에서 1000 rcf에서 원심 분리기에 의한 펠릿 세포. 표면에 뜨는을 취소하고-80에서 매장 세포 ° C.
3. 이전에 다음 ID로 출판 방법 ^5,6에 따라 총 DNA (호스트 및 바이러스 게놈)과 총 RNA를 추출합니다.
4. 총 DNA와 같은 RTA (ORF50), ORF57 및 ORF60 등의 바이러스 lytic 성적에 대한 특정 프리 머를 사용하여 실시간 PCR을 수행합니다. 호스트 하우스 키핑 유전자 (예 : β-고를)에 대한 언급 세포 γHV68 게놈의 상대적인 양을 결정합니다.
5. 게놈 DNA 오염을 제거하려면 RNase 무료 DNase 치료는 총 RNA와 oligo (DT) _{11-19 프라이머로} cDNA 준비 중요합니다. RNase 무료 DNase 및 RT-PCR 치료를 포함하여 RNA 추출에 대한 자세한 내용은 5 참조를 참조하십시오. 호스트 하우스 키핑 유전자의에 대한 언급 바이러스 성적의 상대적 양을 결정하기 위해 위와 같이 cDNA와 프리 머를 사용 실시간 PCR을 수행합니다.

4. 재조합 γHV68 사용 박테리아 인공 염색체를 생성

method는 호스트 바이러스 상호 작용에 관여하는 유전자에 변이 γHV68을 소개하는 데 사용됩니다 여기에 설명.

1. 야생 형 시퀀스 또는 PCR에 의한 중앙 지역에 원하는 돌연변이를 들고 시퀀스의 DNA 조각을 (1.5 KB) 준비합니다.
2. 특히 MIDI 규모의 정화 (OriGene)에 의한 관심의 유전자 유전자를 inactivates 돌연변이 사이트 주위에 transposon 삽입 ^7이 포함되어 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 준비합니다. 4 번 스토어 BAC DNA ° C (BAC DNA의 해동 / 냉동하지 않도록해야합니다.)
3. Transfect BAC DNA와 PCR 제품은 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)로, γHV68 lytic 복제에 매우 허용 아르 세포 (예를 들어, NIH3T3 또는 BHK21)로 관심있는 유전자의 변이를 포함하는 원하는.
4. cytopathic 효과 (CPE)은 monolayer에 표시 될 때까지 분할 세포세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고, 필요한 경우, NIH3T3 또는 BHK21 세포에 바이러스를 증폭.
5. 와 NIH3T3 세포를 감염1800 rpm으로 원심 분리하여 재조합 바이러스, 30 분 30 ° C.
6. 수확 γHV68에 감염된 NIH3T3 세포와 Hirt의 프로토콜 ^8,9을 사용하여 circularized 바이러스 게놈을 준비합니다.
7. chloramphenicol에 대한 저항 (CM)하지만, kanamycin (관) (칸 방지 유전자가 transposon에있는 동안 CM 방지 유전자가, BAC 백본에에 민감 식민지에 대한 electroporation과 화면에 전기 MAX DH10B 관할 세포 (Invitrogen)을 변환 삽입).
8. 중간 포함 chlorophenicol에 CM ^R 관 ^S 식민지를 성장 및 미니 또는 MIDI 규모의 정화 (OriGene)와 BAC DNA를 준비합니다.
9. 돌연변이 사이트의 지역 측면을 노릴하고, 순서에 맞는 프리 머를 사용하여 PCR하여 대상 유전자에서 원하는 돌연변이를 확인합니다.
10. 선택한 제한 효소 및 펄스 - 필드 겔 전기 영동과 소화의 BAC에 염색체 다시 정리하기를 확인하지 않습니다.
11. Lipofectamine와 NIH 3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 BAC를 Transfect2000 (Invitrogen)은 재조합 γHV68를 준비합니다.
12. CPE는 monolayer에 표시 될 때까지 전지를 passaging하세요. 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하고 NIH3T3 또는 BHK21 세포에 재조합 γHV68을 증폭.
13. 재조합 바이러스의 titer를 결정하고 같은 섹션 1과 2에 설명 된 바이러스의 성장 특성 예를 생체 및 생체 내을 특성화한다.

5. 상패 분석​​하여 바이러스 titer를 결정

1. 도금 세포하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도로 NIH3T3 세포를 성장.
2. 20000 세포에서 / 잘 감염 전날에 24 잘 판에 NIH3T3을 분할.
3. DMEM 매체는 8 %의 신생아 송아지 혈청 (NCS)를 포함에 10 배 순차적으로 희석 된 바이러스 supernatants를 준비합니다.
4. 미디어를 제거하고 γHV68 정지의 0.5 ML로 NIH3T3 세포를 다룹니다.
5. , 조직 문화 인큐베이터에서 판을 길러 매 30 분 락, 그리고 부화 진행 할 수 있습니다2시에.
6. 0.5 ML DMEM의 2% NCS를 포함하는 매체 및 0.75 %의 methylcellulose (시그마)과 바이러스 성 중지 및 표지 세포를 제거합니다.
7. 조직 문화 인큐베이터에서 판을 품다. 6 일 후 감염에 액자를 계산합니다. 크리스탈 바이올렛과 ​​함께 예를 들어 monolayer,의 얼룩은 플라크 계산을 용이하게 할 수 있습니다.
8. undiluted 조직 lysates에서 바이러스 titer를 계산하는 데, 또는 셀에 다음 수식 사용 lysates : Titer (PFU / ML) = D X N X 1000 μl / ML ÷ V를 μl합니다. N, 적절한 희석에서 상패 번호의 평균, D, 희석 V (μl) (예 : 5, 10 등, 100 .....) 배, 직렬 - 희석 표면​​에 뜨는의 볼륨은 당 잘 추가되었습니다.

6. 대표 결과 :

^{/ - -} 마우스 ^10, 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)에서 γHV68 lytic 복제 phenotypes, 그리고 recombin 세 대표 수치는 야생 유형과 Mavs의 폐에 γHV68 lytic 복제를 포함하여 여기에 표시됩니다개미 γHV68는 MAVS에 의존 IKKβ에 의해​​ 조절되는 인산화 사이트 내에서 변이를 들고. 이 세 corroborating 실험 생체 및 예 생체 내 γHV68 lytic 복제에 타고난 면역 구성 요소의 역할을 정의 할 수있는 체계를 구성합니다.

그림 1 Mavs ^{+ / +와} Mavs의 폐의 γHV68로드 ^{-. / -} 마우스. A) 두 가지 타고난 신호는 MAVS의 하류 경로. 결과적으로, 염증성 크린 시토 킨과 interferons의 유전자 발현을 조절 NFκB - 인터페론 규제 요인 (IRFs)를 활성화하기 위해 cytosolic 장비-I와 같은 수용체의 신호 MAVS 어댑터 분자 릴레이. B) Mavs ^{+ / +와} Mavs ^{- / -} 마우스가 억제 된 지정된 시간 지점에서 40 PFU intranasally γHV68과 폐의 바이러스 부하에 감염되었습니다 NIH3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 채굴. 각 기호는 마우스를 나타냅니다.

그림 2. 마우스 배아 섬유 아세포의 (MEFs)에 γHV68 lytic 복제 속도론. Mavs에 γHV68의 lytic 복제가 ^{+ / +와} Mavs ^{- / -} MEFs은 여러 단계 성장 곡선 (A) 및 정량 실시간 PCR (B)에 의해 평가되었다. 두 실험 γHV68의 동등한 MEFs의 번호와 금액은 0.01의 다중성 수준의 감염 (나 역시)에서 바이러스 감염에 사용되었다. (A) 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확 및 바이러스 titers을 결정하는 상패 분석​​의 대상이되었다. (B) 총 RNA는 γHV68에 감염된 MEFs에서 추출되어 선택된 lytic 성적 (RTA, ORF57 및 ORF60)에 대한 특정 프리 머와 정량 실시간 PCR에 의해 분석되었다.

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그림 3. IKKγ에 의해 인산화를 폐지 RTA의 transactivation 도메인 내에서 재조합 γHV68 들고 변이의 lytic 복제 속도론. (A) Mavs의 다중 단계 성장 재조합 야생 형 바이러스의 커브 (γHV68.wt)와 돌연변이 바이러스 (γHV68.mut) ^{+ / +와} Mavs ^{- / -} MEFs 세포 (- 나 = 0.01). MEFs는 나 역시 0.01의에서 γHV68에 감염되었습니다. 세포와 supernatants는 지정된 시간 지점에서 수확되었고 바이러스 titers는 NIH 3T3 monolayer를 사용하여 상패 분석​​에 의해 결정됩니다. γHV68에 감염된 NIH3T3 세포 (B) γHV68 RTA의 mRNA 수준 (- 나 = 0.01). 30에서 H는 후 감염, 총 RNA는 γHV68에 감염된 NIH 3T3 세포에서 추출 된 및 정량 실시간 PCR에 의해 분석했다.

Discussion

바이러스 감염에 대응 MAVS에 의존 타고난 면역 신호 경로는 바이러스 염증성 크린 시토 킨 ^10-14의 생산을 촉진하기 활성화됩니다. 인간의 종양 발생 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus과 엡스타인 - 바 바이러스 ^3,4의 모델 바이러스로 손쥐 γHV68를 사용하여, 우리는 γHV68 usurps MAVS - IKKβ 경로는 전사 활성화 ^5를 통해 바이러스 lytic 복제를 홍보 할 것을 발견했습니다. 유전자 변형 MEFs와 분자 바이러스학의 기술을 도입,이 프로토콜은 γHV68 lytic 복제에 대한 중요한 특정 경로의 구성 요소를 신호의 효율적인 식별 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 생체 감염, 예 생체 lytic 복제 및 본래 면역 신호 경로의 해부에 수반. 재조합 헤르페스를 생성하는 세균 인공 염색체를 포함하여 분자 메커니즘을 추가 절차를 윤곽을 그리다하려면바이러스 및 분자 생물학 실험이 필요합니다. 또한, 녹아웃 마우스 종자 및 섬유 아세포이 실험에 대한 열쇠입니다. 사용 가능한 녹아웃 마우스 변종의 큰 번호를,이 프로토콜은 호스트가 그 경로와 바이러스 개입을 신호의 분자 절개를 수있게 될 것입니다. 녹아웃 마우스와 MEFs (예, lethality으로 인해) 사용할 수 없습니다되는 경우, RNAi / shRNA로 인한 최저를 모색 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 추가 제한은 다음과 같습니다 후보자 바이러스 성 요인, 3의 기능을 중복 신호 경로 사이의 1) 누화, 2)) 돌연변이에 의해 γHV68 복제에 대한 잠재적 인 치명적인 영향을. 이 프로토콜은 특히 γHV68 lytic 복제에 타고난 면역 구성 요소의 역할을 확인하기 위해 직접 적용되었지만, 유사한 전략은 생체 및 예 생체 내 바이러스 감염시 경로를 신호 다른 호스트에서 선택한 구성 요소의 중요한 역할을 정의하는 데 사용할 수 있습니다.

그것은이다transfected 세포에서의 재조합 방식은 유전자 수준의 관심에 변이의 효율적인 도입을 허용, E.coli의 재조합 BAC을 식별하는 데 필요한 노동 강렬한 단계를 무시 점에 유의하는 것이 중요합니다. 특히, BAC 및 설계 변이를 포함하는 PCR 제품 사이의 상동 재조합은, 차례로, 재조합 γHV68을 야기 할 수 전염성 BAC의 클론을 생산하고 있습니다. 그러나,이 프로토콜은 필수 유전자와 완전히 바이러스를 비활성화해야하지 않는 변이에 의존하고 있습니다. 변이가 완전히 γHV68을 비활성화하면 transfections는 재조합 바이러스를 생성 할 것으로 예상되지 않습니다. 우리는 손쥐 γHV68에서 배운 정보 인간 KSHV와 EBV에 동일하게 적용되지 않을 수도 있습니다 알고 있습니다. 그러나, 바이러스 면역 회피와 착취의 메커니즘을 해부 할 수있는 전략은 배양 세포를 사용하여 이러한 인간의 병원체에 적용 할 수 있습니다. γHV68와 마우스 감염에서 파생 된 우리의 연구 결과는 따라서 D 우리를 지시합니다인간 KSHV와 EBV를 공부하는 것이 더 실험을 esigning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006