Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

Summary

Nós descrevemos um protocolo para identificar papéis fundamentais de moléculas de sinalização de acolhimento na replicação lítica de um herpesvírus modelo, gama herpesvírus 68 (γHV68). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos embrionárias para γHV68 replicação lítica, o protocolo permite tanto caracterização fenotípica e molecular de interrogatório vírus-hospedeiro interações em replicação lítica viral.

Abstract

Em resposta a uma infecção viral, um hospedeiro desenvolve várias respostas de defesa, tais como a activação imune inata vias de sinalização que conduzem à produção de citocina ^1,2 antiviral. A fim de colonizar o hospedeiro, os vírus são obrigatório para evadir respostas do hospedeiro anti-virais e manipular as vias de sinalização. Desvendando a interação hospedeiro-vírus vai lançar luz sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra a infecção viral.

Murino γHV68 está intimamente relacionado com o herpesvírus humano oncogênico sarcoma de Kaposi associado e Epsten-Barr ^3,4. γHV68 infecção em ratos de laboratório fornece um modelo animal tratável pequeno para examinar todo o curso da resposta do hospedeiro e infecção viral in vivo, que não estão disponíveis para o herpesvírus humanos. Neste protocolo, apresentamos um painel de métodos para caracterização fenotípica e dissecção molecular de componentes do hospedeiro sinalização em γHV68 replic líticoation in vivo e ex vivo. A disponibilidade das estirpes de rato geneticamente modificados permite a interrogação dos papéis das vias de sinalização do hospedeiro durante a infecção aguda γHV68 in vivo. Além disso, os fibroblastos de rato embrionários (MEFs) isoladas a partir destas estirpes de murganhos deficientes podem ser usados ​​para dissecar ainda mais as funções destas moléculas durante γHV68 vivo lítica de replicação ex.

Usando ensaios de biologia molecular e virológicos, podemos identificar o mecanismo molecular de hospedeiro-vírus e identificar interacções hospedeiro e genes virais essenciais para a replicação virai lítica. Finalmente, um cromossoma artificial bacteriano sistema (BAC), facilita a introdução de mutações no factor de viral (s) que, especificamente, interromper a interacção hospedeiro-vírus. Recombinante γHV68 realização destas mutações podem ser usadas para recapitular os fenótipos de γHV68 replicação lítica em MEFs deficientes em hospedeiro chave sinalização componentes.Este protocolo oferece uma excelente estratégia para interrogar interação patógeno-hospedeiro em vários níveis de intervenção in vivo e ex vivo.

Recentemente, descobrimos que γHV68 usurpa uma via de sinalização imune inata a promover a replicação viral lítica ^5. Especificamente, γHV68 de infecção ativa o novo IKKβ quinase imunológico e IKKβ ativada fosforila o mestre fator de transcrição viral, replicação e transativador (RTA), para promover a ativação da transcrição viral. Ao fazê-lo, de forma eficiente γHV68 casais sua ativação transcricional para sediar ativação imune inata, facilitando assim a transcrição e replicação lítico. Este estudo fornece um excelente exemplo que pode ser aplicado a outros vírus de interrogar hospedeiro-vírus interacção.

Protocol

1. Infecção mouse com γHV68

1. Ratinhos ninhada de seis a oito semanas de idade, género, combinados, (8-12 ratos / grupo) foram utilizados para a infecção viral. Permitir ratos para se aclimatar ao longo de quatro dias inteiros (96 horas) após a expedição.
2. Passos de protocolo utilizando vírus deve ser realizado numa câmara de segurança biológica de nível 2 (BSL2) usando o padrão de BSL2 precauções.
3. Prepare suspensão viral (40 a 1 x 10 ⁵ unidades formadoras de placas [PFU]) de γHV68 em 30 ul de PBS estéril, por ratinho imediatamente antes da experiência. Manter a suspensão viral em gelo.
4. Preparar a solução de cetamina / xilazina (1,5 mg de cetamina e 0,15 mg xylazine/20 g de peso corporal, com 100 ul / ratinho) para sedação mouse. Certifique-se de que os ratos foram sedados através da realização de um aperto do dedo do pé.
5. Sedar ratos com 1,5 mg de cetamina e xilazina 0,15 mg por 20 mg de peso corporal (100 ul / ratinho) por injecção intra-peritoneal.
6. Entregar suspensão viral (30 ^ l / ratinho) por via intranasal, em uma, gota a gotaforma, para uma das narinas dos ratos sedados.
7. Lay ratos, por um lado, durante 5 - 10 min para facilitar a entrega nas vias aéreas do vírus no pulmão.
8. Camundongos lugar de volta em camundongos gaiola e monitor até que tenham recuperado totalmente de sedação.
9. Em vários dias pós-infecção, sacrificar animais por asfixia CO ₂ e colheita, os pulmões depois de garantir a morte / perda de consciência profunda. Pulmões colocar em estéreis de 1,5 ml com tampa de rosca tubos contendo 500 ul de 1,0 milímetros de zircônia / sílica contas. Manter os tubos em gelo. Armazenar as amostras a -80 ° C se não for de prosseguir para o próximo passo no mesmo dia. O baço ou de tecido do fígado pode ser recolhido no momento para a análise de latência viral, dependendo do período experimental.
10. Adicionar 1 ml de frio DMEM isento de soro para dentro do tubo e homogeneizar os pulmões por pérola em parada 30 segundos. Relaxar tubos em gelo durante pelo menos 1 min. Repita este processo uma vez.
11. Centrifugar os lisados ​​de pulmão a 16.000 rcf a 4 ° C durante 1 min e usar supernatant para determinar título viral por um teste de placas usando uma monocamada NIH3T3 ou BHK21 (ver secção 5 para mais detalhes).

2. Determinar γHV68 cinética de várias etapas de crescimento de fibroblastos embrionários de ratinho

1. Crescer fibroblastos do tipo selvagem embrionárias de rato (MEFs) e os deficientes em um gene hospedeiro para sub-confluentes de densidade (aproximadamente 80%), antes de células em placas.
2. Dividir MEFs em placa de 24 poços a 10.000 células / poço para um baixo multipilicity de infecção (MOI) no dia anterior à infecção. As experiências são normalmente realizados em triplicata e a uma MOI entre 0,001 - 0,05 é normalmente utilizado.
3. Prepare γHV68 suspensão contendo a quantidade desejada de virus (0,5 ml por cavidade).
4. Remover médio e cobrir MEFs com 0,5 ml de suspensão por cavidade γHV68.
5. Incubar a placa de cultura de tecidos incubadora, rocha a cada 30 min, e permitir a incubação prosseguir durante 2 h.
6. Remova a suspensão viral, e cobrir as células com 0,5 ml c frescoomplete meio DMEM contendo 8% de soro fetal bovino.
7. Em vários dias após a infecção, a colheita do meio e as células em tubos de centrífuga estéreis, 1,5 ml. Congelar imediatamente os tubos a -80 ° C.
8. Libertação de γHV68 MEFs por congelamento a -80 ° C, descongelação a 37 ° C Banho de água e centrifugação. Três ciclos de congelação e descongelação é geralmente aplicado às amostras.
9. Determine título viral por um teste de placas usando uma monocamada NIH3T3 ou BHK21 (ver secção 5 para mais detalhes).
10. Leia título viral e enredo γHV68 curva de crescimento multi-passo em MEFs.

3. Dissecção molecular de γHV68 replicação lítica em fibroblastos de rato embrionárias

1. Realize infecção viral como descrito nos passos 2.1 a 2.6 do capítulo 2.
2. Em vários dias após a infecção, desprezar o sobrenadante. Enxaguar as células com PBS frio e células Tripsinizar. Pellet células por centrifugação a 1000 rcf em temperatura ambiente por 1 min. Descartar o sobrenadante ecélulas armazenar a -80 ° C.
3. Extrair DNA total (hospedeiro e do genoma viral) e o ARN total de acordo com métodos previamente publicados ^5,6.
4. Realizar PCR em tempo real utilizando o ADN total e iniciadores específicos para transcrições virais líticas, tais como RTA (ORF50), ORF57 e ORF60. Determinar a quantidade relativa de genoma γHV68 intracelular em referência a um gene housekeeping hospedeiro (por exemplo, β-actina).
5. Para remover a contaminação de ADN genómico, o tratamento com RNase-free DNase é crítica para a preparação de cDNA de RNA total e de (dT) iniciador oligo _11-19. Consulte a referência 5 para obter mais detalhes sobre a extração de RNA incluindo o tratamento com RNase DNase e RT-PCR. Realizar PCR em tempo real utilizando iniciadores de ADNc e como acima descrito para determinar a quantidade relativa de transcritos virais em referência a esse gene housekeeping de acolhimento.

4. Gerando recombinante usando γHV68 cromossomo bacteriano artificial

O metodod descrito aqui é utilizada para introduzir mutações num gene γHV68 que está envolvido na interacção hospedeiro-vírus.

1. Preparar um fragmento de DNA (cerca de 1,5 kb) de sequência de tipo selvagem ou uma sequência de transporte mutações desejadas na região central por PCR.
2. Prepare cromossoma artificial bacteriano (BAC), que contém uma inserção de transposão ⁷ em torno do local da mutação, que inactiva o gene especificamente gene de interesse, por midi escala de purificação (OriGene). Loja BAC DNA a 4 ° C (para evitar o congelamento / descongelamento de BAC de ADN).
3. Transfectar ADN BAC e produto de PCR contendo as mutações desejadas do gene de interesse em células (por exemplo, células NIH3T3 ou BHK21), que são altamente permissivo para a replicação γHV68 lítica, com Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Manter divisão de células até que o efeito citopático (CPE), mostra-se na monocamada. Recolher-vírus contendo o sobrenadante e, se necessário, amplificar o vírus em células NIH3T3 ou BHK21.
5. Infectar células NIH3T3 comrecombinante do vírus por centrifugação a 1800 rpm, 30 ° C durante 30 min.
6. Colheita γHV68 infectadas células NIH3T3 e preparar circularizado genoma viral utilizando o protocolo de Hirt de ^8,9.
7. Transformar células de Electro-MAX DH10B competentes (Invitrogen) por electroporao e tela de colónias que são a resistência ao cloranfenicol (Cm), mas sensível à canamicina (Kan) (Cm-resistente gene está no backbone BAC, enquanto Kan-resistente gene está no transposon inserção).
8. O crescimento de colônias Cm ^R Kan ^S em meio contendo chlorophenicol e preparar BAC DNA com a purificação ou mini-midi-escala (OriGene).
9. Verificar a mutação desejada no gene alvo por PCR, utilizando iniciadores específicos para as regiões de flanco do local de mutação e a sequenciação.
10. Confirmar nenhum rearranjo cromossómico em BAC por digestão com enzimas de restrição seleccionadas e pulso campo de eletroforese em gel.
11. Transfectar BAC recombinante em células NIH 3T3 ou BHK21 com Lipofectamine2000 (Invitrogen) para preparar γHV68 recombinante.
12. Mantenha passagens em células até CPE mostra-se na monocamada. Recolher-vírus contendo o sobrenadante e amplificar γHV68 recombinante em células de NIH3T3 ou BHK21.
13. Determinar titulação do vírus recombinante viral e caracterizar as propriedades de crescimento ex vivo e in vivo, tal como descrito nas secções 1 e 2.

5. Determinar título virai por um ensaio de placas fágicas

1. Crescer células NIH3T3 para sub-confluentes de densidade (aproximadamente 80%), antes de células em placas.
2. Dividir NIH3T3 em placas de 24 poços a 20.000 células / poço, no dia antes da infecção.
3. Preparar 10 vezes em série os sobrenadantes virais diluídas com meio DMEM contendo 8% de soro de vitelo recém-nascido (NCS).
4. Remover médio e cobrir células NIH3T3 com 0,5 ml de suspensão γHV68.
5. Incubar a placa de cultura de tecidos incubadora, agitar a cada 30 min, e permitir a incubação prosseguirdurante 2 h.
6. Remova a suspensão viral e células de cobertura com 0,5 ml meio DMEM contendo 2% de NCS e metilcelulose a 0,75% (Sigma).
7. Incubar a placa de cultura de tecidos incubadora. Contar as placas no dia 6 pós-infecção. A coloração da monocamada, por exemplo, com violeta de cristal, pode facilitar a contagem de placa.
8. Calcula-se o título viral nos lisados ​​de tecido não diluídas ou lisados ​​celulares utilizando a seguinte fórmula: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N, a média do número de placas a uma diluição adequada, D, diluições (por exemplo, 5, 10, 100 .....) V (pi), volume de sobrenadante diluído em série por poço.

6. Resultados representativos:

Três figuras representativas são mostrados aqui, incluindo γHV68 replicação lítica no pulmão do tipo selvagem e Mavs ^{- / - 10} rato, γHV68 fenótipos replicação líticas em fibroblastos de rato embrionárias (MEF), e recombinformiga γHV68 realização mutações nos sítios de fosforilação que são modulados pela IKKβ MAV-dependente. Estes três experimentos comprobatórios constituem um esquema para definir as funções dos componentes inatos imunes em γHV68 replicação lítica in vivo e ex vivo.

Figura 1 γHV68 cargas nos pulmões dos Mavs ^{+ / +} e ^- Mavs. ^{/ -} Ratos. A) duas vias de sinalização principal inata jusante do Mavs. Os relés de adaptador Mavs molécula de sinalização citosólicas de RIG-I-like receptors para activar NFkB e factores de interferão reguladoras (IRFs) que, por sua vez, se-regular a expressão de genes de citoquinas pró-inflamatórias e interferões. B) Mavs ^{+ / +} e ^{- / -} Mavs ratinhos foram infectados com 40 PFU intranasalmente γHV68 e cargas virais no pulmão em pontos de tempo indicados foram deter minada por um ensaio de placas utilizando células NIH3T3 monocamada. Cada símbolo representa um rato.

Figura 2. ΓHV68 cinética de replicação lítica em fibroblastos de rato embrionários (MEFs). A replicação litica de γHV68 em Mavs ^{+ / +} e ^- Mavs ^{/ -} MEFs foi avaliada por curvas de várias etapas de crescimento (A) e quantitativa de PCR em tempo real (B). Para ambos os experimentos, igual número de MEFs e quantidade de γHV68 foram utilizados para a infecção viral, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. (A) As células e os sobrenadantes foram colhidos em intervalos de tempo indicados e sujeitos a um ensaio de placas para determinar os títulos virais. (B) de ARN total foi extraído a partir de γHV68 infectado MEFs e analisadas por quantitativo em tempo real, PCR com primers específicos para determinados transcritos líticas (RTA, ORF57 e ORF60).

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Figura 3. As cinéticas de replicação litica de recombinantes γHV68 transportando mutações dentro do domínio de transactivação RTA que abolirem fosforilação por IKKγ. (A) curvas de várias etapas de crescimento de vírus de tipo selvagem recombinante (γHV68.wt) e vírus mutante (γHV68.mut) em Mavs ^{+ / +} e ^- Mavs ^{/ -} células MEFs (MOI = 0,01). MEFs foram infectadas com γHV68 a um MOI de 0,01. As células e os sobrenadantes foram colhidos em intervalos de tempo indicados e os títulos virais foram determinados por um ensaio de placas fágicas utilizando NIH 3T3 monocamada. (B) mRNA γHV68 nível RTA γHV68 em células NIH3T3 infectadas (MOI = 0,01). A 30 h após a infecção, o RNA total foi extraído a partir de células infectadas com γHV68 NIH 3T3 e analisadas por quantitativa PCR em tempo real.

Discussion

Em resposta a uma infecção viral, os MAV-dependentes imunes inatas vias de sinalização são activados para promover a produção de citocinas inflamatórias antivirais ^10-14. Usando γHV68 murina como um modelo para o vírus herpes humano oncogênico sarcoma de Kaposi associado e vírus Epstein-Barr ^3,4, descobrimos que γHV68 usurpa a via de MAV-IKKβ a promover a replicação viral via lítica de activação da transcrição ^5. Empregando MEFs geneticamente modificado e técnicas de virologia molecular, este protocolo permite a identificação eficiente de sinalização componentes de um caminho particular que são críticas para γHV68 replicação lítico. Como tal, este protocolo envolve a infecção em vivo, ex vivo replicação litica e dissecção da via de sinalização imune inato. Para delinear os moleculares do mecanismo, procedimentos adicionais, incluindo o cromossomo bacteriano artificial para gerar herpes recombinantesexperiências de biologia molecular de vírus e são necessárias. Além disso, as tensões nocaute do mouse e fibroblastos são a chave para estas experiências. Com um grande número de estirpes de ratinho knockout disponíveis, este protocolo irá permitir a dissecação molecular do hospedeiro vias de sinalização e de intervenção do mesmo viral. No caso de camundongos knockout e MEFs não estão disponíveis (por exemplo, devido à letalidade), RNAi / shRNA mediada knockdown pode ser procurado. Limitações adicionais deste protocolo incluem: 1) a interferência entre as vias de sinalização, 2) sobreposição de funções de factores candidatos virais, 3) efeito letal potencial em γHV68 replicação através de mutações. Embora este protocolo foi aplicado directamente para identificar funções dos componentes inatos imunes em γHV68 replicação lítica em particular, estratégias semelhantes podem ser usados ​​para definir os papéis importantes de um componente seleccionado no hospedeiro outras vias de sinalização durante a infecção viral in vivo e ex vivo.

Éimportante notar que a nossa abordagem de recombinação em células transfectadas ignora os passos de trabalho necessários para a identificação intensas BAC recombinante em E. coli, o que permite a introdução eficiente de mutações no gene de interesse. Especificamente, a recombinação homóloga entre a CAS e produtos de PCR contendo as mutações concebidas produz clones BAC infecciosas que, por sua vez, dão origem a γHV68 recombinante. No entanto, este protocolo baseia-se no gene essencial e mutações que não são supostos para inactivar o vírus completamente. Se as mutações completamente inactivar γHV68, transfecções não são esperados para gerar vírus recombinantes. Nós percebemos que as informações aprendidas a partir de γHV68 murino pode não se aplicar idêntico ao humano KSHV e EBV. No entanto, as estratégias para dissecar evasão imune viral e os mecanismos de exploração podem ser aplicadas a estes agentes patogénicos humanos usando células em cultura. Nossas descobertas derivadas da infecção mouse com γHV68 assim vai nos instruir de designing melhores experiências para estudar humano KSHV e EBV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006