Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Summary

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Abstract

Viral enfeksiyon yanıt olarak, bir dizi gibi antiviral sitokin üretimini ^1,2 yol doğuştan gelen bağışıklık sinyal yolakları aktive gibi çeşitli savunma yanıtları, geliştirir. Ana koloni için, virüs konak antiviral yanıtları kaçmasına ve sinyal yolları işlemek için zorunlu bulunmaktadır. Konak-virüs etkileşimi unraveling viral enfeksiyona karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi ışık tutacaktır.

Mürin γHV68 yakından insan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epsten-Barr virüsü ^3,4 ilişkilidir. laboratuvar farelerde γHV68 enfeksiyonu insan herpesvirüslerinin için mevcut değildir vivo, konak yanıtları ve viral enfeksiyon tüm kurs incelemek için uysal küçük bir hayvan modeli sağlar. Bu protokol, biz γHV68 litik replic bir fenotipik karakterizasyon yöntemleri paneli ve ana sinyal bileşenlerinin moleküler diseksiyonu sunmakvivo ve ex vivo hem ation. Genetiği değiştirilmiş fare suşlarının durumu vivo γHV68 akut enfeksiyon sırasında ana sinyal yollarının rolleri sorgulamaya izin verir. Buna ek olarak, bu eksik fare suşu izole edilmiş fare embriyo fibroblast (MEFS) ileri γHV68 litik çoğaltma ex vivo sırasında bu moleküllerin rolleri incelemek için kullanılabilir.

Virolojik ve moleküler biyoloji deneyleri kullanarak, konak-virüs etkileşimlerinin moleküler mekanizması kesin ve viral litik replikasyon için gerekli ana ve viral genleri tespit edebilirsiniz. Son olarak, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) sistemi özellikle ev sahibi-virüs etkileşim kesme viral faktör (ler) içine mutasyonların girişini kolaylaştırır. Bu mutasyonlar taşıyan rekombinant γHV68 bileşenleri sinyal anahtar konak içinde eksik MEFS içinde γHV68 litik çoğaltma fenotipleri tekrarlamak için de kullanılabilir.Bu protokol vivo ve ex vivo müdahale birden çok düzeyde konak-patojen etkileşimi sorgulamak için mükemmel bir strateji sunar.

Son zamanlarda, biz γHV68 usurps doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon yolağı viral litik replikasyon ⁵ teşvik etmek olduğunu keşfettiler. Özellikle, γHV68 de novo enfeksiyonu bağışıklık kinaz IKKβ aktive Olmanız IKKβ viral transkripsiyonel aktivasyon teşvik etmek, ana viral transkripsiyon faktörü, çoğaltma ve Transaktivatörü (RTA) fosforile. Bunu yaparken, γHV68 verimli çiftler doğal immün aktivasyon ev sahipliği için transkripsiyonel aktivasyon, böylece viral transkripsiyon ve litik replikasyon kolaylaştırmak. Bu çalışmada ana-virüs etkileşimi sorgulamak diğer virüsler uygulanabilir mükemmel bir örnek sağlar.

Protocol

1. ΓHV68 ile Fare enfeksiyonu

1. Altı-sekiz haftalık, cinsiyet açısından Kardeş fareler (8 ila 12 fare / grup) viral enfeksiyon için kullanılır. Fareler sevkiyat sonra dört tam gün (96 saat) boyunca gelmesini bekleyin.
2. Virüs kullanarak Protokol adımları standart BSL2'ye önlemler kullanılarak biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) bir kabin içinde yapılmalıdır.
3. Sadece deneme önce fare başına steril PBS 30 ul γHV68 (40 1 x 10 ⁵ plak oluşturan birim [PFU]) viral süspansiyonu hazırlayın. Buz üzerinde viral süspansiyon tutun.
4. Fare sedasyon için ketamin / xylazine çözeltisi (1.5 mg ketamin ve 0.15 mg xylazine/20 g vücut ağırlığı, 100 ul / fare) hazırlayın. Fareler ayak tutam gerçekleştirerek sedatize edilmiştir emin olun.
5. 1.5 mg ketamin ve intra-peritoneal enjeksiyon yoluyla 20 mg vücut ağırlığı (100 ul / fare) başına 0,15 mg ksilazin oturaklı fareler.
6. Bir damla-bilge, intranazal viral süspansiyon (30 ul / fare) sununsedasyon farelerin bir burun moda.
7. 5 için bir tarafta fareler Lay - 10 dk akciğer içine, virüs solunum getirilmesini kolaylaştıran.
8. Geri kafes ve monitör farelerde Yeri fareler tam sedasyon kurtarıldı kadar.
9. Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, CO ₂ boğulma ve ölüm / derin bilinç kaybı güvence sonra hasat akciğerler tarafından fareler kurban. Sıra akciğerler 1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk 500 ul içeren steril 1.5 ml'lik vidalı kapaklı tüpler içine. Buz üzerinde tüpleri tutun. Mağaza örnekleri -80 ° C'de aynı gün sonraki adıma geçmeden değilse. Dalak veya karaciğer dokusu deney zaman dilimine göre viral gecikme analiz için şu anda toplanmış olabilir.
10. Tüp içine soğuk serumsuz DMEM 1 ml ekleyin ve boncuk-dayak 30 saniye akciğerleri homojenize. En az 1 dakika boyunca buz üzerinde tüp soğutun. Bir kez bu işlemi tekrarlayın.
11. Santrifüj akciğer 1 dakika 4 ° C'de 16,000 RCF lizatları ve supern kullanınBir NIH3T3 veya BHK21 monolayer (detaylar için bakınız Bölüm 5) kullanarak bir plak yöntemi ile viral titresi belirlemek için atant.

2. Fare embriyonik fibroblastlar içinde γHV68 çok adımlı büyüme kinetikleri belirleyin

1. Yabani tip fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ve kaplama hücreleri önce alt konfluent (yaklaşık% 80) yoğunluk bir konak gen eksikliği olanlar büyütün.
2. 10.000 hücrelerini 24-plaka içine MEFS / Split sıra enfeksiyon öncesi gün (İB) multipilicity-of-bir enfeksiyon için. Deneyler, normal olarak 0.001 arasında, kopyalardaki içinde ve bir İB yürütülür - 0.05 genellikle kullanılır.
3. Virüs istenilen miktarda (0.5 ml'de sıra) içeren γHV68 süspansiyonu hazırlayın.
4. Orta çıkarın ve kuyu başına γHV68 süspansiyonu 0.5 ml MEFS kapsamaktadır.
5. Doku kültürü kuluçka makinesi, kaya her 30 dakikada plaka inkübe edildi ve inkübasyon 2 saat için ilerlemeye olanak tanır.
6. Viral süspansiyon çıkarın ve 0.5 ml taze c hücreleri kapakomplete DMEM ortamı% 8 fetal bovin serumu içeren.
7. Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, steril 1.5 ml santrifüj tüpleri içine orta ve hücre hasat. Hemen -80 tüpler dondurmak ° C.
8. -80 Dondurarak MEFS Bırak'ı γHV68 ° C, 37 çözdürme ° C su banyosu ve vorteks. Dondurma ve buz çözme üç döngü genellikle örnekleri uygulanır.
9. Bir NIH3T3 veya BHK21 monolayer (detaylar için bakınız Bölüm 5) kullanarak bir plak yöntemi ile viral titresi belirleyin.
10. Viral titresi ve MEFS ilgili arsa γHV68 çok adımlı büyüme eğrisi okuyun.

3. Fare embriyonik fibroblastlar içinde γHV68 litik replikasyon Moleküler diseksiyonu

1. Bölüm 2 2.6 için adım 2.1 'de açıklandığı gibi viral enfeksiyon gerçekleştirin.
2. Çeşitli gün sonrası enfeksiyon anda, supernatant atın. Soğuk PBS ve Trypsinize hücreleri ile hücreleri yıkayın. 1 dakika için oda sıcaklığında 1,000 rcf de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve-80 mağaza hücreleri ° C
3. Önceden yayınlanmış yöntemleri ^5,6 göre toplam DNA (konak ve viral genom) ve toplam RNA ayıklayın.
4. Toplam DNA ve böyle RTA (ORF50), ORF57 ve ORF60 gibi viral litik transkript, spesifik primerler kullanılarak real-time PCR gerçekleştirin. Bir ana temizlik gen (örn., β-aktin) referans olarak hücre içi γHV68 genomunun nispi miktarını belirler.
5. Genomik DNA kontaminasyonu kaldırmak için, RNaz ücretsiz DNaz tedavisi total RNA ve oligo (dT) _11-19 astar ile cDNA hazırlanması için önemlidir. RNaz ücretsiz DNaz ve RT-PCR ile tedavi de dahil olmak üzere RNA ekstraksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı için 5 başvurmak bakın. Konak temizlik genin referans viral transkript göreli miktarını belirlemek için yukarıdaki gibi cDNA ve primerler kullanılarak real-time PCR gerçekleştirin.

4. Rekombinant γHV68 kullanarak bakteriyel yapay kromozom oluşturuluyor

Metodolojid ev sahibi-virüs etkileşim içinde dahil olan bir γHV68 gen mutasyonu içine getirmek için kullanılır tanımlanmıştır.

1. Yabani tipteki sekansı ya da PCR ile merkezi bölge, istenen mutasyonu taşıyan sekansı bir DNA fragmanı (1.5 kb) hazırlayın.
2. Özellikle midi ölçekli arıtma (OriGene) ile ilgilenilen genin gen, inaktive eden, mutasyon bölgesi, etrafında bir transpozon ekleme ⁷ içeren, bakteriyel suni bir kromozom (BAC) hazırlayın. 4 Mağaza BAC DNA ° C (BAC DNA'nın çözülme / dondurma kaçının).
3. BAC DNA ile transfekte PCR ürünü, lipofektamin 2000 (Invitrogen) ile, γHV68 litik replikasyonu ile açık olan hücreleri (örneğin, NIH3T3 veya BHK21), içine ilgi geninin Arzu edilen mutasyonları içeren.
4. Sitopatik etki (CPE) tek tabaka olarak belirene kadar bölme hücreleri tutun. Virüs içeren süpernatan toplamak ve, gerekirse, NIH3T3 veya BHK21 hücreleri virüs yükseltmek.
5. NIH3T3 hücreleri ile Infect1,800 rpm'de santrifüj ile rekombinant virüs, 30 dk için 30 ° C'dir.
6. Hasat γHV68-enfekte NIH3T3 hücreleri ve Hirt protokol ^8,9 kullanarak circularized viral genom hazırlamak.
7. Kloramfenikol direnç (Cm), fakat kanamisin (Kan) (Kan-dirençli gen transpozon iken Cm-dirençli gen, BAC omurga içerisinde duyarlı olan koloniler için elektroporasyon ve ekran ile elektro-MAX yetkili DH10B hücrelerinin (İnvitrojen) Transform ekleme).
8. Medium içeren chlorophenicol Cm ^R Kan ^S koloniler büyütün ve mini veya midi ölçekli arıtma (OriGene) ile BAC DNA hazırlamak.
9. Mutasyon site kanat bölgeleri ve sekanslama için özel primerler kullanılarak PCR ile hedef geni içinde arzu edilen mutasyonların edin.
10. Seçilen restriksiyon enzimleri ve nabız-field jel elektroforezi sindirim ile BAC hiçbir kromozom onaylayın.
11. Lipofektamin ile NIH 3T3 veya BHK21 hücreleri içine transfekte rekombinant BAC2000 (Invitrogen) rekombinant γHV68 hazırlamak için.
12. CPE monolayer olarak belirene kadar hücre pasajı tutun. Virüs içeren süpernatant toplayın ve NIH3T3 veya BHK21 hücrelerinde rekombinant γHV68 yükseltmek.
13. Rekombinant virüsün titresini belirlemek ve bölüm 1 ve 2'de tarif viral büyüme özellikleri ex vivo ve in vivo olarak karakterize etmektedir.

5. Bir plak yöntemi ile viral titresi belirleyin

1. Kaplama hücreleri önce alt konfluent (yaklaşık% 80) yoğunluk NIH3T3 hücreleri büyümek.
2. 20.000 hücrelerini / iyi enfeksiyonu önceki gün 24-plaka içine NIH3T3 Böl.
3. DMEM orta% 8 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) içeren 10 kat seri-seyreltilmiş virüs süpernatantlar hazırlayın.
4. Orta çıkarın ve γHV68 süspansiyonu 0.5 ml NIH3T3 hücreleri kapsar.
5. , Doku kültürü inkübatör plaka inkübe her 30 dakikada bir kaya, ve inkübasyon devam etmesine izin2 saat için.
6. 0.5 ml DMEM,% 2 NCS içeren orta ve% 0.75 metilselüloz (Sigma) ile viral süspansiyon ve kapak hücreleri çıkarın.
7. Doku kültürü inkübatör plaka inkübe edin. Günde 6 sonrası enfeksiyona plaklar sayın. Kristal viyole ile örneğin tek tabaka, boyanması, plak sayım kolaylaştırabilir.
8. Seyreltilmemiş doku özütündeki viral titre hesaplama ya da hücre lizatları aşağıdaki formül ile: titresi (PFU / ml) D = x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N, uygun dilüsyon plak sayısı ortalaması, D, seyreltme V (ul) (örneğin 5, 10 gibi, 100 .....) kat, seri-seyreltilmiş süpernatant hacmi başına iyi ekledi.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

^{/ - -} Fare ¹⁰ fare embriyonik fibroblastlar (MEF) olarak γHV68 litik replikasyon fenotipleri ve recombin Üç temsili rakamlar yabani tip ve Mavs ve akciğerde γHV68 litik çoğaltma dahil olmak üzere, burada gösterilmektedirkarınca γHV68 Mavs bağımlı IKKβ tarafından düzenlendiği fosforilasyon siteleri içinde mutasyonları taşıyan. Bu üç doğrulayan deneyler vivo ve ex vivo γHV68 litik replikasyon doğuştan immün bileşenlerin rolleri tanımlamak için bir plan oluşturur.

Şekil 1, Mavs ^{+ / +} ve Mavs ve akciğerlerde γHV68 yükler ^{-. / -} Fareler. A) İki ana doğuştan sinyalizasyon Mavs mansabında patikaların. Da, proinflamatuar sitokinler ve interferonlar gen ekspresyonu up-regüle NFKB ve interferon düzenleyici faktörler (IRFS) etkinleştirmek için sitozolik RIG-I-benzeri reseptörler Mavs adaptör molekül röleleri. B) Mavs ^{+ / +} ve Mavs ^{- / -} farelerde caydırmak edildi Belirtilen zaman noktalarında 40 PFU intranazal γHV68 ve akciğer viral yük ile enfekte edildi NIH3T3 monolayer kullanarak bir plak yöntemi ile mayınlı. Her sembol bir fare temsil eder.

Şekil 2. Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olarak γHV68 litik replikasyon kinetiği. Mavs üzerinde γHV68 bir litik replikasyon ^{+ / +} ve Mavs ^{- / -} MEFS çok-aşamalı büyüme eğrilerinin belirlenmesi (A) ve kantitatif gerçek-zamanlı PCR (B) ile ölçüldü. Her iki deney için, γHV68 eşit MEFS sayısı ve miktarı, 0.01 çokluğu-of-enfeksiyon (MOI) de viral enfeksiyonu için kullanılmıştır. (A) Hücreler ve süpernatan belirtilen zaman noktalarında hasat ve viral titresi belirlemek için bir plak tahlil konu edildi. (B) RNA γHV68-enfekte MEFS çıkarılan ve seçilen litik transkript (RTA, ORF57 ve ORF60) spesifik primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi.

ig3.jpg "/>
Şekil 3. IKKγ tarafından fosforilasyon kaldıracak RTA transaktivasyonunun etki alanı içinde rekombinant γHV68 taşıyan mutasyonların litik replikasyon kinetiği. (A) Mavs Çok-aşamalı büyüme rekombinant yabani-tip virüs eğrileri (γHV68.wt) ve mutant virüsü (γHV68.mut) ^{+ / +} ve Mavs ^{- / -} hücrelerinde MEFS (MOI = 0.01). MEFS bir İçişleri Bakanlığı 0.01 de γHV68 ile enfekte edildi. Hücreler ve süpernatan belirtilen zaman noktalarında hasat edilmiş ve viral titreler NIH 3T3 tek tabaka ile bir plak deneyi ile belirlendi. ΓHV68 ile enfekte edilmiş NIH3T3 hücreleri içinde (B) γHV68 RTA mRNA düzeyi (MOI = 0.01). 30 saat sonrası enfeksiyon, toplam RNA γHV68-enfekte NIH 3T3 hücreleri elde edildi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz.

Discussion

Viral enfeksiyon yanıt olarak, Mavs-bağımlı doğuştan gelen bağışıklık sinyal yollarının antiviral ^10-14 enflamatuvar sitokinlerin üretimini teşvik etmek için aktif hale getirilir. İnsan onkojenik Kaposi sarkomu-ilişkili herpes ve Epstein-Barr virüsü ^3,4 için model virüs olarak mürin γHV68 kullanarak, γHV68 usurps Mavs-IKKβ yolu transkripsiyonel aktivasyonu ⁵ ile viral litik replikasyon teşvik etmek olduğunu keşfetti. Genetiği değiştirilmiş MEFS ve moleküler viroloji teknikleri uygulamak suretiyle, bu protokol γHV68 litik replikasyon için kritik olan belirli bir yolun bileşenleri sinyal verimli bir kimlik verir. Bunun gibi, bu protokol vivo enfeksiyon, ex vivo litik replikasyon ve doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon yolağının diseksiyonu gerektirir. Rekombinant herpes oluşturmak için bakteriyel suni bir kromozom içeren moleküler mekanizma, ilave işlemleri betimlemek için:virüs ve moleküler biyoloji deneyleri gereklidir. Ayrıca, nakavt fare suşları ve fibroblastlar bu deneyler için anahtardır. Mevcut nakavt fare suşları arasında çok sayıda, bu protokolün ana bunların yolları ve viral müdahale sinyal moleküler diseksiyonu sağlayacaktır. Knockout farelerde ve MEFS (örneğin, ölümcül nedeniyle) mevcut olmadığını durumunda, RNAi / shRNA-aracılı knockdown aranabilir. Bu protokol Ek sınırlamaları şunlardır: Aday viral etkenler, 3 fonksiyonları örtüşen sinyal yolları arasındaki 1) karışma, 2)) mutasyonların γHV68 çoğaltma potansiyel öldürücü etkisi. Bu protokol özellikle γHV68 litik çoğaltma doğuştan gelen bağışıklık bileşenlerinin rolleri belirlemek için doğrudan uygulanabilir olmasına rağmen, benzer bir strateji in vivo ve ex vivo viral enfeksiyon sırasında sinyal yolları diğer ana seçilen bir bileşenin önemli roller tanımlamak için kullanılabilir.

It istransfekte hücreler bizim rekombinasyon yaklaşım gen-faiz içine mutasyonların etkin tanıtımı izin, E.coli 'de rekombinant BAC belirlenmesi için gerekli emek-yoğun adımları atlar dikkat etmek önemlidir. Özellikle, BAC ve tasarlanmış mutasyonları içeren PCR ürünleri arasındaki homolog rekombinasyon, sırayla, rekombinant γHV68 yükselmesine vermek bulaşıcı BAC klonları üretir. Ancak, bu protokolün temel gen ve tamamen virüs inaktive gerekmiyor mutasyonlar dayanır. Mutasyonlar tamamen inaktive γHV68 ise, Transfeksiyonlar rekombinant virüs üretmek için beklenmemektedir. Biz mürin γHV68 öğrendiğim bilgiler insanın KSHV ve EBV için aynı şekilde geçerli olmayabileceğini biliyoruz. Ancak, viral bağışıklık kaçırma ve işletme mekanizmaları incelemek için stratejiler kültürlü hücreler kullanılarak bu insan patojenleri ile uygulanabilir. ΓHV68 ile fare enfeksiyon elde Bizim bulgular dolayısıyla d bize talimat olacakİnsan KSHV ve EBV çalışmaya daha deneyleri esigning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006