Levande cell imaging av Bacillus subtilis Och Streptococcus pneumoniae Med hjälp av automatiserade Time-lapse Mikroskopi

Summary

Detta protokoll är en steg-för-steg förfarande för att övervaka enskilda cellens beteende olika bakterier i tiden med hjälp av automatiserade fluorescens time-lapse mikroskopi. Dessutom ger vi riktlinjer för hur man kan analysera mikroskopi bilder.

Abstract

Under de senaste åren har forskarna blivit alltmer medvetna om att genomsnittliga data från mikrobiell populationsbaserade experiment är inte representativa för beteende, status eller fenotyp av enstaka celler. På grund av denna nya insikt antalet enda cell studier ökar ständigt (för senaste recensionerna se ^1,2,3). Däremot tillåter många av de enskilda tillämpas cellen tekniker inte övervaka utvecklingen och beteendet hos en viss enskild cell i tid (t.ex. flödescytometri eller standard mikroskopi).

Här ger vi en detaljerad beskrivning av en mikroskopi metod som används i flera aktuella studier ^{4, 5, 6, 7,} som gör att följa och inspelning (fluorescens) enskilda bakterieceller av Bacillus subtilis och Streptococcus pneumoniae genom tillväxt och delning i många generationer. Den resulterande filmer kan användas för att bygga träd fylogenetiska släktlinje genom att spåra historien om en enstaka cell i en befolkning som härstammar från en gemensam förfader. Detta tidsförlopp fluorescensmikroskopi metod kan inte bara användas för att undersöka tillväxt, delning och differentiering av enskilda celler, men också att analysera effekten av cellens historia och anor på specifika cellulära beteende. Dessutom är tidsförlopp mikroskopi idealisk för att undersöka dynamiken genuttryck och protein lokalisering vid bakteriella cellcykeln. Metoden förklarar hur man förbereder bakterieceller och konstruera mikroskop för att utväxt av enskilda celler i en microcolony. Kort sagt, enskilda celler fläckig på ett halvfast yta bestående av odlingsmedium kompletteras med agaros som de växa och dela sig under ett fluorescensmikroskop inom en temperaturstyrd klimatkammare. Bilderna är tagna vid specifika intervaller och senare analyseras med hjälp av öppen källkod ImageJ.

Protocol

1. Beredning av B. subtilis kulturer

1. Inokulera celler från -80 ° C aktier i 10 ml tidsförlopp mikroskopi (TLM) medium (62 mm K ₂ HPO _4, 44mm KH ₂ PO _4, 15 mm (NH _{4) 2} SO _4, 6,5 mm natriumcitrat, 0,8 mm MgSO _4, 0,02% casamino syror, 27,8 mM glukos, 0,1 mm L-tryptofan, var pH-värdet satt till 7 med hjälp av en KOH-lösning) kompletteras med antibiotika vid behov.
2. Väx cellerna över natten i en skaka kolven (30 ° C, 225 rpm).
3. Följande morgon, späd cellerna 1:10 i förvärmda kemiskt definierat medium (CDM) (62 mm K ₂ HPO _4, 44mm KH ₂ PO _4, 15 mm (NH _{4) 2} SO _4, 6,5 mm natriumcitrat, 0,8 mM MgSO _4, 2,2 mm glukos, 2,1 mm L-glutaminsyra, 6 mikroM L-tryptofan, 7,5 mikroM MnCl _2, 0,15 x metall mix (förbereda 50x MT Blanda lager (ref ⁸⁾ som innehåller: 0,2 M MgCl _2, 70 mm CaCl _2, 5 mm MnCI _2, 0,1 mM ZnCl _2, 0,2 mM tiamin-hydroklorid, 2 mM HCl, 0,5 mM FeCl ₃ (lägg till sist)) utan antibiotika.
4. Växa B. subtilis celler till mitten av exponentiell fas (30 ° C, 225 rpm). Vanligtvis tar detta cirka fyra timmar. Viktigt förbereda agarosen bilden en timme innan cellerna når mitten av exponentiell fas (se avsnitt 2).
5. Mät absorbansen för kulturen på 600 Nm (A ₆₀₀₎ och späd cellerna till en ungefärlig En ₆₀₀ av 0,035 använda CDM. Detta OD garanterar att enskilda celler med lämpliga avstånd är fläckig på objektglas för time-lapse mikroskopi.

2. Beredning av mikroskop urvalet (se även figur 2)

En timme före celler når mitten av exponentiell tillväxt, förbereda objektglas enligt följande:

1. Rengör två bilder mikroskop glas (t.ex. Knittel Glas, 7,6 x 2,6 cm) med 70% etanol och vatten.
2. Ta en gen ram (ABgene, 1,7 x 2,8 cm) och försiktigt ta bort ett av plastfolien från den gen som ram utan att demontering av plastskyddet på andra sidan av genen ramen.
3. Fäst genen ram i mitten av en av glaset bilderna genom att först underlätta kontakten på bara en sida, följt av guidad infästning av återstående genen ramen med en nagel. Förhindra luftbubblor när du monterar den gen som ram till glaset bilden.
4. Använd en mikrovågsugn för att lösa upp 150 mg (1,5%) med hög upplösning lågsmältande agaros (Sigma) i 10 ml CDM. Den agaros måste vara helt upplöst för att erhålla minimal bakgrund som krävs för tidsförlopp mikroskopi experiment. Om det behövs, komplettera agaros-CDM med inducerare eller andra föreningar vid denna tid
5. Överför 500 ìl av den varma agaros-CDM i mitten av genen ramen. Se till att hela området inklusive (gränserna) är fullständigt täckt.
   Följande steg (2,6-2,10) måste genomföras snabbt för att förhindra överdriven torkning av agarosen-CDM.
6. Placera den andra glasskiva på den fyllda agarosen-CDM-genen ram. Försök att undvika luftbubblor. Placera inklämt bilderna i ett horisontellt läge i 45 minuter vid 4 ° C i kylskåpet så att agaros-CDM stelna tillräckligt.
7. Skjut försiktigt bort det övre glaset bilden. Använd ett rakblad för att skära ut agar remsor av ~ 5 mm bredd inom genen ram, som cellerna kommer att odlas. Maximalt tre remsor kan användas per bild, separerade med ~ 4 mm utrymme för båda sidor. Dessa utrymmen kommer att ge luft som är avgörande för B. subtilis tillväxt. Om fyra olika stammar behöver följas i tid kan två band göras och halveras att resultera i fyra små rutor. Ta bort eventuella rester av fast substrat.
8. Ta försiktigt bort den andra och sista plastskyddet från genen ram för att exponera den klibbiga sidan av genen ram
9. Ladda enskilda celler (från steg 1,5) på fast medium utan att röra den med pipettspetsen. Använd 2,5 l för ett helt band, eller 1 l för ett litet torg. Börja alltid på toppen av agarosen pad och låt vätskan för att skingra lika mycket på sin tilldelade tillväxtområde genom att vrida bilden upp och ner. Bilden är klar, så snart kanterna av vätskan blir wellpapp och rörelse av vätskan inte längre syns när du vrider på bilden.
10. Placera en ren mikroskop slip skjut locket (24 x 50 mm) på genen ram från ena sidan till den andra (undvik luftbubblor). Ge garantier för fastsättning genom att sätta press på locket glida längs med genen ram med nageln. Om täckglas placeras på cellerna utan att låta dem torka tillräckligt länge, celler tenderar att växa ovanpå varandra under experimentet. Var också noga med att inte vänta för länge innan locket glida, eftersom agarosen kommer då att bli för torr.
11. Förvärma bild för 1 timme vid 30 ° C. Om bilden wOuld direkt placeras i förvärmda klimatkammare (se steg 3.1) i mikroskop, kan temperaturvariationer orsaka autofokus problem under de första timmarna av försöket.

3. Time-lapse fluorescensmikroskopi (se även figur 3 och Film 1)

1. Förvärma klimatkammare i tid (i våra händer minst 2h innan experimentet) för att förhindra autofokus problem efter start av experimentet. Den tid som krävs beror på den klimatkammare som används samt värmesystem och mikroskopet.
2. Välj rätt objektiv, filter och dikroiskt spegel enligt dina experimentella uppsättning. För långa experiment att se till att ett UV-filter placeras mellan ljuskällan och provet. Dessutom, om möjligt, blockera några av de excitation ljus med hjälp av neutrala täthetsfilter att minimera exponeringen.

Följande utrustning (som DeltaVision, Storbritannien) användes för tidsförlopp mikroskopi experiment publicerades i de Jong et al 2010 ^5:. IX71 mikroskop (Olympus), CoolSNAP HQ2 kamera (Princeton Instruments), 300W Xenon ljuskälla, 60x ljusa fältet mål (1,25 NA), GFP filterset (Chroma, excitation vid 470/40 nm, emission 525/50 nm), mCherry filterset (Chroma, excitation vid 572/35 nm, emission 632/60 nm). Autofokus utfördes med hjälp av diascopic ljus och använder autofokus rutin som finns i Deltavision är Softworx programvara. Det bör noteras att det nu finns ett antal andra autofokus system som lämpar sig också som Zeiss Definite Focus, Nikon perfekt fokus System och Leica Adaptive fokuskontroll.

3. Program experimentet enligt dina experimentella uppsättning. Det är klokt att bestämma mängden ljus som krävs för specifika konstruktioner, liksom autofokus inställningar för andra tidsförlopp mikroskop eller bakterier innan det verkliga experimentet. Kortare exponeringstider och mindre mängd excitation ljus minimerar blekning och fototoxicitet. Använd diascopic ljus för autofokus rutin.

Följande inställningar har använts för tidsförlopp mikroskopi experiment publicerades i de Jong et al 2010 ^5:. Ögonblicksbilder för filmer togs i intervall om 8 eller 12 minuter med 10% APLLC vita LED-ljus och 0,05 s exponering för ljusa fält bilder, 10% Xenon ljus och 0,5 s exponering för GFP upptäckt, och 32% Xenon ljus och 0,8 exponering för mCherry upptäckt, respektive. Rådata lagrades med hjälp av softWoRx 3.6.0 (Applied precision i återgivningen). Den autofokus var programmerad för 0,06 ìm steg och en total räckvidd på 1,2 ìm.

4. Placera den förberedda bild (punkt 2) i den förvärmda klimatkammare av mikroskopet och övervaka utväxt av enskilda celler i en microcolony monolager vid 30 ° C.

Specifika tips:

• Välj enskilda celler som finns i mitten av agar plattan. Kanterna på agar plattan torkar ut lättare. Förvara X, Y, Z position med hjälp av mikroskop programvara.
• Stora rörelser på scenen i X, Y och Z riktning kan störa den agarosen och därmed försvåra identifiering av celler genom att autofokusen rutin. I allmänhet, att minimera X, Y, Z rörelse, väljer vi inte mer än 10 positioner per försök, även om en bild innehåller flera stammar.
• Efter att ha valt den första cellen, bara justera Z-fokus med programvaran. Från denna punkt, ändrar inte fokusera manuellt på mikroskopet kroppen med hjälp av "Z-knappen" om det inte är digitalt kodade. Se till att efter varje autofokus rutin den nya X, Y, är Z-position lagras av programvaran.
• Kontrollera om autofokus inställningarna är lämpliga för försöket, innan loppet. Användningen av faskontrast mikroskopi kan förbättra autofokus rutin jämfört med att använda brightfield eller DIC mikroskopi, på grund av ökad kontrast. Gör dock fas ringen i faskontrast målen dem mindre känsliga (ca 10%) att samla fluorescens ljus. Så för svagt fluorescerande prover, är ett mål utan fas ringen bättre lämpade.
• Kontrollera om de markerade cellerna fortfarande är i fokus varje halvtimme, tills experimentet körs stabilt. När celler vid denna punkt är ur fokus, justera manuellt. På grund av temperaturvariationer, samt dåligt torkade proverna, kan detta vara nödvändigt under de första timmarna. På grund av ökad kontrast fungerar autofokus bättre när flera celler är i synfältet.

5. När experimentet har avslutats, separera de olika kanalerna av filmen och säkra dem som separata filer (dvs faskontrast, GFP, mCherry) om det behövs (vissa förvärv paket kommer att placera alla kanaler i en staplad enda fil). För publicering, kan bilder förbättras genom 2D deconvolution, vilket är särskilt osseful för studier protein lokalisering. Deconvolve bilderna med hjälp av mikroskop programvara eller med ett kommersiellt paket som Huygens ( www.svi.nl ).
6. Analysera data med hjälp av ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) (använd den råa, obearbetade bildfiler för detta) och Microsoft Excel eller Sigma Plot. Stackar kan till exempel sparas som en. "AVI" filmfil i ImageJ. En detaljerad beskrivning av hur fluorescens av enstaka celler kan mätas i tid ges nedan.

4. Dataanalys av dynamik promotor aktivitet med hjälp av ImageJ

Vi noterar att andra bra mjukvarupaket finns tillgängliga som är specialiserade på att analysera tidsförlopp mikroskopi bilder som BHV mjukvara ^{9, 4,} Schnitzcell ^10, PSICIC ¹¹ och ^{Krilon-Tracker-12,} men här fokuserar vi på den fritt tillgängliga ImageJ paket.

1. Ladda ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) och (om nödvändigt) rätt plugin för att öppna din (staplade) fil. Till exempel inspelade filmer med ett deltavision mikroskop kan bara öppnas i ImageJ med deltavision öppnaren plugin. Kopiera DV-plugin i ImageJ plugin-mappen och starta programmet. Ändra minneskapacitet i redigera / alternativ / minne och trådar till 1250. Detta gör det möjligt att arbeta med större filer, som de framställts av time-lapse filmer.
2. För att bedöma cellen historien om en enda cell, öppna den ursprungliga filmen faskontrast av en microcolony och bläddra till den sista bildrutan i intresset för filmen. Välj "segmenterade linjer" val-knappen i menyn.
3. Rita en linje i bakgrunden och tryck på "Ctrl" + "T". Detta kommer att öppna områden av intresse (ROI) Manager. (Motsvarande bakgrundsfluorescens värde kan användas för att manuellt ta bort bakgrunden -.. Se nedan Du kan också använda bakgrunden subtraktion rutin som finns inom ImageJ) också dra en linje i cellen av intresse och lägga till ROI på ROI chef. Eftersom vi undersöker promotor-GFP fusioner i denna fallstudie och GFP sprids i hela cytoplasman bör hela cellen har liknande fluorescens värden för varje enskild pixel i längden på cellen. Rulla en bildruta bakåt i tiden och välja en ny ROI i samma cell av intresse. Spara denna tredje ROI och fortsätta med proceduren tills motsvarande avkastning i den första bildrutan i filmen har sparats.
   Var medveten om att fluorescensen hos dottern celler kan variera kraftigt efter celldelningen. Antingen använder ett membran färg som kan tillämpas tillsammans med fluorescens proteiner som produceras i celler (t.ex. en kombination av röda membran färgämnet FM ^® 5-95 (Invitrogen) och GFP) för att visualisera septum bildas. I detta fall motsvarar fluorescens kanal och inte faskontrast filmen bör användas för att följa cellerna i tid. Alternativt kan man stanna på den säkra sidan genom att välja ROI är i endast en halv av en cell.
4. Inom ROI manager, klicka på "spara". Om slutet på filen. "Roi", då en ROI är markerat i listan och bara detta en kommer att sparas. Om slutet på filen. "Zip", då hela uppsättningen ska sparas (obligatoriskt).
5. Stäng filmen faskontrast och öppna den ursprungliga fluorescens filmen (t.ex. GFP). Klicka på "visa alla" och "åtgärd" i ROI chef. Ett nytt fönster öppnas (Resultat). Kopiera resultatet till ett Excel-ark och subtrahera medelvärdet fluorescens för varje enskild cell från bakgrundsfluorescens av mediet. Den resulterande netto fluorescens kan plottas mot tiden för att avslöja initiativtagaren aktiviteten i cellen av intresse i tid.
6. Alternativt kan fluorescens av alla celler i en microcolony kan analyseras på en viss tid-punkt. För att göra detta markera och spara ROI är för bakgrunden och varenda cell i en ram som beskrivits ovan, kopiera fluorescens värden till Excel och producera histogram med hjälp av "Histogram"-funktionen i "verktyg"-menyn.
7. För att få bilder från enskilda bildrutor för publicering markerar du ramen av intresse, välj "image" - "kopiera bild" och ändra den typ av bild till "RGB" eller "8-bitars" genom att välja "bild" - "typ" - "RGB" eller "8-bitars". Spara dupliceras ram som. "Tiff". Den RGB/8-bit Bilderna kan öppnas med konventionella ritprogram som CorelDraw eller Adobe Illustrator. Vid behov kan bilderna anpassas med "bild" - "justera" - "Ljusstyrka / Kontrast" eller "bild" - "justera" - "fönster / nivå" i ImageJ.

5. Producera filmer för publicering med ImageJ

1. Öppna den ursprungliga faskontrast och motsvarande fluorescens filmen (er) i ImageJ enligt ovan. Välj den rektangulära val-knappen (1 ^m på vänster) och rita en rektangel ROI i den första bilden på ett sådant sätt, att utveckla microcolony omges av ROI throughout hela filmen. Välj "image" - "gröda" och säkra denna mindre version av filmen under ett nytt namn. Välj samma ROI via ROI chef i fluorescens filmen och fortsätt som tidigare.
2. Att kombinera de filmer antingen horisontellt eller vertikalt, välj "plugin" - "stack combiner". Om så önskas kan en tid stamper läggas till via "plugin" - "tiden stamper". Spara den kombinerade stacken en gång som ". DV" eller ". Tiff" och en gång som ". Avi" eller QuickTime-film.

Alternativa Protokoll Anpassningar för Streptococcus pneumoniae (Figur 4 och Film 2):

6. Beredning av S. pneumoniae kulturer

1. Väx S. pneumoniae celler (kapslad stam D39 ¹³ eller oinkapslat stam R6 ¹⁴ som stående kulturer i C + Y medelhög ¹⁵ vid 37 ° C tills en OD på A _600Nm på cirka 0,4 uppnås. Centrifugera cellerna i 2 min vid 14000 rpm och suspendera cellpelleten i en volym av färska C + Y medium som innehåller 14,5% glycerol (v / v) som skulle resultera i ett A _600Nm på exakt 0,4. Alikvotera cellerna och förvara dem vid -80 ° C för framtida bruk.
2. För tidsförlopp mikroskopi, ta en alikvot av tidigare odlade S. pneumoniae celler. Inokulera 4 ml färsk C + Y medelstora 1:100 med celler från -80 ° C delmängd. Väx cellerna fram till mitten av exponentiell fas till en OD En _600Nm av 0,1 till 0,2. Vanligtvis tar detta ca 2 timmar vid användning av celler från -80 ° C alikvoter.

7. Beredning av mikroskop prov

1. Förbered ett objektglas som beskrivs ovan för B. subtilis men se till att agarosen innehåller komplexa C + Y medium. Sedan S. pneumoniae är en microaerophile bör luftfickor mellan agaros band vara mindre än för B. subtilis (~ 1 mm utrymme på båda sidor).
2. Mät absorbansen av kulturen vid 600 nm (A _600), späd exponentiellt växande S. pneumoniae-celler till en ungefärlig En ₆₀₀ på 0,05 med C + Y medellång och använda denna spädning för att ladda agaros bilden.

8. Time-lapse faskontrast mikroskopi

Justera mikroskopet inställningarna för S. pneumoniae: använd faskontrast mikroskopi sedan S. pneumoniae är svårt att identifiera med hjälp av ljus-fält mikroskop. Fortsätt det protokoll som beskrivs för B. subtilis (följ steg från 2,9 till 3,7). S. pneumoniae celler kan odlas på antingen 30 ° C eller 37 ° C (de växer snabbare vid 37 ° C).

9. Representativa resultat:

Det tidsförlopp fluorescens experiment har genomförts framgångsrikt, om bakterierna växte till en microcolony monolager, som helt ligger inom synfältet i slutet av experimentet (se Figur 5A-C). Om celler växte ovanpå varandra, är det inte bara omöjligt att spåra deras historia korrekt, men också fluorescens nivåer av överlappande celler kan inte mätas korrekt. Celler tenderar att växa ovanpå varandra, om prickiga cellerna inte torkat tillräckligt (steg 2,9) eller om mediet sammansättning behöver justeras för att få långsammare tillväxt. Om en microcolony växte utom synhåll, då fördelningen av fluorescens signaler inom en koloni inte kan fastställas. Orsaker till "microcolony rörelse" kan vara otillräcklig torkning av prickig celler (steg 2,9), eller om programmet inte var programmerad för att spåra microcolony under utvecklingen. Dessutom är det viktigt att lokala fläckar av ökad fluorescens kan inte identifieras på medellång eftersom detta döljer fluorescens signaler som kommer från cellerna (se figur 5D-F). Bakgrund problem kan uppstå från media föreningar luftbubblor eller oupplösta agaros klumpar. För att visualisera detta visar vi i figur. 5F bakgrund signaler om detta specifika bild när bilden togs med excitation / emission filter för rött fluorescerande färger. Som synes, ljusa autofluorescent fläckar är närvarande som kan hindra avbildning. Att förhindra sådana fläckar, se till att agarosen helt upplöst och det finns inga luftbubblor när du placerar täckglas på objektglas.

Figur 1: Experimentell översikt

Figur 2: Förberedelse av mikroskop prov

Figur 3: Time-lapse fluorescensmikroskopi av B. subtilis celler hyser en P _kinB-GFP fusion. Snapshots är hämtade från Film 1. Krönskivor: ljusa fält, botten paneler: GFP-kanal.

Figure 4: Time-lapse faskontrast mikroskopi av S. pneumoniae vilda stammen R6. Snapshots är hämtade från Movie 2.

Figur 5: Illustration av möjliga (time-lapse) mikroskopi resultat. AC visar faktorer som måste beaktas för data som erhållits med diascopic ljus inställningar. (A) brightfield mikroskop av en microcolony monolager (positivt resultat) av sporulating B. subtilis celler (B) brightfield bilden av ett B. subtilis microcolony där vissa celler växte ovanpå varandra (negativt utfall) (C) brightfield bild av en sporulating B. subtilis microcolony som växte fram ur området fokus (negativt utfall). DF visar faktorer som måste beaktas för data som erhållits med episcopic ljusinställningar (D) faskontrast bild av B. subtilis celler i exponentiell fas avbildade att visualisera där fluorescens signaler i E och F kommer från (E) GFP signaler av cellerna visas i D. Observera att bakgrunden signalerna är lika i varje pixel (positivt resultat). Observera också att exponeringstiden kan vara för mycket eftersom en cell visar en mättad signal (negativt utfall) (F) Signaler som erhållits genom den röda kanalen av cellerna visas i D. Observera att bakgrunden innehåller områden med ökad röd fluorescens nivåer (negativ utfall).

Film 1. Time-lapse fluorescensmikroskopi av B. subtilis celler hyser en P _kinB-GFP fusion. Ögonblicksbilder tagna i 8 min intervaller. Vänster: ljusa fältet höger: GFP-kanal. Klicka här för att se filmen.

Film 2. Time-lapse faskontrast mikroskopi av S. pneumoniae vilda stammen R6. Ögonblicksbilder tagna i 10 min intervaller. Klicka här för att se filmen.

Discussion

I motsats till många andra encelliga metoder kan tidsförlopp fluorescensmikroskopi här beskrivna metoden användas för att följa historien om en specifik cell med avseende på dess förfäder, sitt beteende och händelser division. I kombination med fluorescerande mål initiativtagare eller proteiner, kan särskilda utvecklingsproblem väg aktivering följas i tid och protein lokalisering samt protein dynamik kan övervakas under bakteriell utveckling.

Som nämnts ovan kan studier koncentrerar sig på olika bakteriearter utföras genom att anpassa tillväxten villkor enligt kraven för en specifik bakterie. De enda begränsningar vi stött på är relaterade till tillväxt villkor och urval. På grund av en sluten miljö kan mediet förutsättningarna inte ändras under experimentet. Dessutom kan maximalt fyra stammar per försök övervakas effektivt.

Med tanke på några kritiska steg, beskrev en enda cell analysmetoden här kan lätt appliceras med alla automatiserade mikroskop. I det följande kommer en översikt av dessa kritiska steg ges. Detaljerad information finns i huvudtexten allmän förberedelse:. Det är klokt att kontrollera autofokus inställningar som krävs för en specifik bakterie före experimentet. Likaså bör ungefärliga optimala inställningar för visualisering av fluorescens bestämmas i förväg, om möjligt. Dessutom, efter en förberedd tidslinje hjälper det att ha allt material färdigt att använda i tid (före uppvärmningen mikroskop kammaren, programmering mikroskopet inställningar, förbereda bilden en timme innan cellerna i önskad tillväxtfas, se figur 1) . Tillväxt av B. subtilis i TLM och CDM: TLM och CDM är kemiskt definierade svält medier där B. subtilis växer endast långsamt. Den tidsperiod där cellerna odlas i media kan behöva förlängas beroende på den specifika stam. Den långsamma tillväxten hindrar cellerna från hopar sig på varandra Beredning av mikroskop prov:. Luftbubblor mellan genen ram, glasplatta och locket glida måste förebyggas för att förhindra omfattande torkning av agarosen-baserade medium. Detsamma gäller på medellång / täckglas gränssnitt. Det är viktigt att låta cellerna tillräckligt torr, för att förhindra bad och / eller flera skikt tillväxt Time-lapse fluorescensmikroskopi:. Pre-uppvärmningen av bilden samt klimatkammare är avgörande för att förebygga allvarliga autofokus problem. Celler bör väljas i mitten av en agar pad, eftersom dessa har störst chans att stanna i området och fokus under försöket (förutsatt att provet var torkat tillräckligt bra). Maximalt 10 platser per experiment fungerar fortfarande väl. Efter att ha valt den första cellen av intresse endast använda programvaran för att justera fokus (se text för detaljer). Kontrollera om cellerna är fortfarande i fokus under de första timmarna av experimentet i 30 min intervaller Analys:. Det är viktigt att kontrollera före omfattande analys förfaranden om bakgrunden till mediet har liknande värden i fluorescens kanaler. Små dammpartiklar, medium komponenter, smutsiga linser eller små agaros klumpar kan bidra till lokalt ökad fluorescens, vilket gör filmen svårt eller omöjligt att analysera Felsökning:. Om cellerna växer ovanpå varandra, kan detta antingen tyda på att täckglaset var bifogas för tidigt eller att mediet inte lämpar sig för tillväxt av microcolony monolager. Om celler av intresse kontinuerligt dör i förtid, medan andra celler i bilden delar glatt, kanske du vill kontrollera om du sätter UV-filter på plats. Det kan också bidra till att minska exponeringen tid eller ljusintensitet under långa experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Frame	ABgene Limited	AB-0578	1.7 x 2.8 cm
high-resolution low melting agarose	Sigma-Aldrich	A4718
big cover slip	Multiple Suppliers		24 x 50 mm
if desired, membrane dye, e.g. FM 5-95	Invitrogen	T23360	other membrane dyes are also available: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf
Time-lapse microscope with environmental chamber	Multiple Suppliers		see details for our device in the corresponding sections