Summary
Vi beskriver processen att isolera hög renhet herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. Den slutliga DNA fångas från lösning med hög koncentration och renhet, vilket gör den idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections att producera nya virus rekombinanter.
Abstract
Virus är obligata cellulära parasiter, och därmed att studera deras DNA kräver att isolera virus material från värdcellen föroreningar och DNA. Flera nedströms tillämpningar kräver stora mängder ren virus-DNA, som tillhandahålls genom detta protokoll. Dessa applikationer inkluderar virusgenom sekvensering, där avlägsnande av värd-DNA är avgörande för att optimera utdata för viral sekvenser, och produktionen av nya virus rekombinanta stammar, där samarbetet transfektion av renat plasmiden och linjär viralt DNA underlättar rekombination. 1,2, 3
Detta förfarande använder en kombination av extraktioner och täthet-baserade centrifugering för att isolera renas linjär herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. 4,5 Den inledande reningssteg syftar till att isolera renat virus capsids, som innehåller och skyddar den virala DNA under extraktioner och steg centrifugering som tar bort cellulära proteiner och DNA. Lys av nucleocapsids släpper sedan viralt DNA, och två sista fenol-kloroform steg bort återstående proteiner. Den slutliga DNA fångas från Lösningen är mycket koncentrerad och ren, med en genomsnittlig OD 260/280 på 1,90. Beroende på mängden infekterade används celler, ger av virus-DNA intervallet 150 till 800 mikrogram eller mer. Renheten av detta DNA gör den stabil under långvarig förvaring vid 4C. Detta DNA är därför idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections.
Före början protokollet är det viktigt att veta det genomsnittliga antalet celler per fat (t.ex. i genomsnitt 8 x 10 6 PK-15 celler i ett sammanhängande 15 cm fat), och titer av virala materiel som skall användas ( t.ex. 1 x 10 8 plaque-forming enheter per ml). Dessa är nödvändiga för att räkna ut rätt mängd av infektion (MOI) för protokollet. 6 Till exempel för att infektera en 15 cm parabolantenn i PK-15 celler med ovanstående virus beståndet, i ett MOI av 5, vill du använda 400 ìl virala lager och späd den med 3,6 ml medium (totalt ympning volym på 4 ml för en 15 cm platta).
Flera viralt DNA preparat kan vara beredd på samma gång. Antalet samtidiga förberedelserna begränsas bara av antalet rör som innehas av ultracentrifugen rotorn (en per-virus, se steg 3,9 nedan). Här beskriver vi proceduren som om görs för ett virus.
Protocol
1. Första dag: virusinfektion och Beredning av buffertar
- Förbered 5-10 rätter (15 cm diameter) av celler vävnadskultur för infektion, exempelvis PK-15 celler för pseudorabies-virus (PRV) eller Vero celler för herpes simplex virus (HSV).
- När celler är 95 - 100% konfluenta, infekterar dem på en (MOI) på 5-10. För att göra detta, inokulera varje platta med hjälp av viruset lager i en total volym på 4 ml per platta, då Inkubera plattorna under 1 timme vid 37 ° C. Rock plattor försiktigt var 15 minuter för att se till att cellen cellslager förblir fullt belagda av viruset inokulat. Samtidigt varma mediet för nästa steg.
- Efter en timme av infektion, aspirera virala inokulat från tallrikar, tillsätt 15 ml varmt medium och inkubera vid 37 ° C under 12-20 timmar i en fuktig kuvös.
- Förbered LCM buffertar (se tabell 1) och rock över natten vid 4 ° C för omsorgsfull blandning. Förbered TNE för resuspension av virus-DNA (se tabell 2).
2. Andra dagen, Fas 1: cellslys och ultracentrifugering
- Se noga efter att infektion av celler har lett till enhetliga cytopatisk effekt (CPE). Tillåt infektionen att utvecklas tills alla celler har avrundats uppåt, men har inte lyfts upp från tallriken.
- Skrapa de infekterade cellerna i medium, och kombinera celler och medium i 50 ml koniska rör. Antalet koniska rör som behövs för detta steg beror på antalet antenner för infektion i Steg 1,2 ovan kan exempelvis en 50 ml koniska rör användas till pellets högst 3 rätter av 15 ml medelstora varje Tillval:. Skölj plattor med 10 ml PBS och kombinera med celler och medium.
- Centrifugera cellerna och mellanstora i 10 minuter vid 2000 jämfört centifugal kraft (RCF) vid rumstemperatur, sedan aspirera supernatanten och återsuspendera varje pellet i 10 ml PBS. Om pellets från en virusinfektion spreds i flera koniska rör i steg 2,2 kan dessa rekombinerat i ett koniskt rör i detta steg. Upprepa centrifugeringen och aspiration Tillval:. Detta pellets kan förvaras vid -20 ° C och protokollet fortsätta vid ett senare tillfälle.
3. Andra dagen, Fas 2: ultracentrifugering
Håll cellpelleten och LCM buffertar på is när det är möjligt under de följande stegen.
- Lägg β-merkaptoetanol till 0% glycerol - LCM buffert. Börja kyla ultracentrifugen (för steg 3,9 nedan) genom att ställa den till 4 ° C och slå på vakuum.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml 0% glycerol - LCM buffert tills det inte längre är klumpiga. Om det behövs, vortex röret för att bryta upp alla olösta cellpelleten.
- Utdrag genom att tillsätta 1,5 ml freon (1,1,2-triklor-1 ,2,2-trifluoretan) och vortexa kraftigt. Omedelbart Centrifugera 10 min vid 2000 RCF vid en temperatur på 4 ° C. Samla det översta lagret med en bred-bar pipettspetsen (undvika gränssnitt) och överför till en ny tub Tillval:. Om pellets är ett geléliknande fast, kan du hälla snabbt det översta lagret i ett nytt rör.
- Upprepa Freon utvinning och centrifugera igen.
- Samla det översta lagret (ca 5 ml) och förflyttas till en ny polyallomer ultracentrifugen rör. Lägg β-merkaptoetanol på de två återstående glycerol - LCM buffertar.
- Förbered en gradient i polyallomer centrifugrör av bakomliggande i Freon extrakt (översta lagret) med 3 ml 5% glycerol - LCM (mellanskiktet) och bakomliggande igen med 2,5 ml 45% glycerol - LCM (understa lagret). Använd en tunn pipett för att undvika överflöd av röret innehåll.
- Om det behövs, förbereda en motsvarande balans rör med samma proportioner av LCM buffertar.
- Överför rör i ultracentrifugen hinkar. Balans hinkar till inom 0,1 g av varandra, genom att försiktigt lägga till extra 0% glycerol - LCM buffert för att det översta lagret (~ 50-100 l åt gången).
- Med hjälp av en kall ultracentrifugen med en horisontell eller svängande hink rotorn snurra balanserade prover för 1 timme vid 77 tusen RCF (t.ex. 25.000 rpm för en SW41Ti rotor) vid en temperatur på 4 ° C.
- Under ultracentrifugering, göra ett glas krok för att fånga flytande DNA på etanol nederbörd steg (4,6 nedan). Håll båda ändarna av ett glas Pasteurpipett och avbryta den mellersta sektionen över en låga. När en sektion av glas är nästan smält, dra försiktigt att sträcka glaset, böj den försiktigt för att skapa en hårt vinklad krok (<90 grader) och dra kraftigt till täta slutet. Om spetsen på glaset kroken är öppen, håll spetsen över lågan så att glaset smälter nog att stänga den.
- Efter ultracentrifugering bör du se ett tunt ogenomskinligt pelleten, med en mörk fläck i mitten. Försiktigt aspirera vätskan från röret, inklusive drippings längs sidorna, men undvika pellets i botten av röret.
- Tillsätt 0,5 ml TNE vid rumstemperatur.
- Låt pelleten sitta i minst 10 minuter så hydrering av pelleten. Optional: Den pellets kan också återsuspendera i TNE över natten, om den förvaras vid 4 ° C.
4. Tredje dagen: "Ghost" DNA Nederbörd
- Dela upp pelleten genom att pipettera med en liten bar pipettspetsen (t.ex. en P200 pipettspets). Oroa dig inte för klippning i detta steg, eftersom virus-DNA är fortfarande i capsids på denna punkt. Lägg till följande reagenser till röret som innehåller virus pellets, vid rumstemperatur, för att förstöra capsids:
- 4,25 ml TNE
- 0,25 ml 10% SDS
- 2 mg proteinas K
Se upp för klippning från och med nu, t.ex. genom att använda stora hål pipetter och inte Vortexa virala materialet
- Utdrag virusproteiner genom att tillsätta 5 ml av fenol-kloroform och genast börja vända eller vortexa att upprätthålla en emulsion. Blanda i 10 sekunder och centrifugera sedan emulsionen i 5 minuter vid 2000 RCF vid rumstemperatur. Samla det översta lagret med en bred-bar pipettspetsen, undvika gränssnitt, och förflyttas till en ny tub Tillval:. Använd låsenhet gel (PLG) rör i detta steg för att undvika kontaminering från gränssnittet.
- Upprepa fenol-kloroform utvinning och centrifugera igen.
- Efter den andra fenol-kloroform utvinning, samla in det översta lagret i en 30 ml glasflaska Corex rör och kyla röret vid -20 ° C i 10-15 minuter, se till att den inte fryser.
- Tillsätt 10 ml av iskall etanol, täcka röret (till exempel genom att sträcka ut en bit Parafilm M över toppen), och invertera att blanda omedelbart. Håll utkik efter en DNA "spöke" visas, som består av en tunn ropy fällning. Vänd röret försiktigt för att blanda ytterligare och orsaka kladdiga DNA fällningar för kluster tillsammans.
- Använd ett glas krok för att fånga DNA-spöket (s). Försiktigt blot DNA för att ta bort överflödig vätska, placera sedan kroken (spetsen ner) i ett 1,5 ml rör och låt torka. Lägg 0,25 till 0,5 ml TE att lösa upp DNA-spöke. Tillåt resuspension av DNA för att fortsätta i minst en timme. Förvara DNA vid 4 ° C. Tillval: För att maximera DNA avkastning, bryta glaset kroken i 1,5 ml tub, kan så att resuspension bort glassplitter fortsätta över tiden.
5. Representativa resultat
Med en tillräckligt hög MOI, bör celler uppnå full CPE inom ~ 18 timmar efter infektion (HPI) för vildtyp PRV stammar, och ~ 24 HPI för vildtyp HSV-1 stammar (Figur 1). När den infekterade cellpellet skördas, kan de kvarvarande protokollet steg vara komplett i en lång dag eller genomförs under två dagar (figur 2).
När man förbereder glas krokar för att fånga DNA spöke, är det viktigt att kroken vinkeln är mindre än 90 grader, så att senare kan passa in i botten av en 1,5 ml rör (Figur 3). Tätning toppen av denna krok förhindrar DNA-förlust inuti pipett.
DNA spöken form under nederbörden steg och kommer att visas som vita, ropy trådar (Figur 4). Dessa aggregat och hålla sig till varandra och / eller glaset kroken som används för att fånga DNA. Således samma glas krok kan användas för att samla upp flera trådar av DNA inifrån fällningslösningen.
| Välj kolumn baserat på önskad volym: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCL | 1,3 ml | 1,9 ml | 2,5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7,4) | 300 l | 450 l | 600 l | 1,2 ml |
| 1M MgCl 2 | 50 l | 75 l | 100 l | 200 l |
| 0,5 EDTA | 10 l | 15 l | 20 l | 40 l |
| NP40/IGEPAL | 50 l | 75 l | 100 l | 200 l |
| β-merkaptoetanol (lägg omedelbart före användning) | 4,3 l | 6,5 l | 8,6 l | 17,2 l |
| Använd proportioner för önskad procent glycerol (0, 5 eller 45%) | ||||
| 0% glycerol | Ingen | Ingen | Ingen | Ingen |
| vatten | 8,3 ml | 12,5 ml | 16,7 ml | 33,4 ml |
| 5% glycerol | 0,5 ml | 0,8 ml | 1,0 ml | 2,0 ml |
| vatten | 7,8 ml | 11,7 ml | 15,7 ml | 31,4 ml |
| 45% glycerol | 4,5 ml | 6,8 ml | 9,0 ml | 18,0 ml |
| vatten | 3,8 ml | 5,7 ml | 7,7 ml | 15,4 ml |
Tabell 1. Recept för beredning av LCM buffertar
| För 50 ml volym |
| 5 ml 1M NaCl |
| 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 |
| 1 ml 0,5 EDTA |
| 41,5 ml H 2 O |
Tabell 2. Beredning av TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA)
| För 1 l volym |
| 0,2 g KCl |
| 0,2 g KH 2 PO 4 |
| 8 g NaCl |
| 1.15g Na 2 HPO 4 |
| H 2 O till 1L |
Tabell 3. Beredning av PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mm KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0)
Figur 1. PK15 celler (A) före infektion, (B) halvvägs infektion och (C) vid cytopatisk effekt (CPE), efter en stor mångfald av infektion.
Figur 2. Översikt av protokollet.
Figur 3. Tre representativa exempel av glas krokar som används för att samla den virala DNA-spöken.
Figur 4. Representativt exempel på en välformad och riklig DNA "spöke".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delar av detta protokoll utvecklades ursprungligen för viralt DNA isolering i BSL4 förhållanden, men den anpassar lika bra för icke-BSL villkor. 4 Vi brukar använda det här protokollet för att isolera DNA från alfa-herpesvirus PRV och HSV-1, som har DNA-genomet inneslutna i ett proteinhaltig kapsid och omgiven av en lipid kuvert. 7,8 Det är dock sannolikt direkt kan anpassas till andra stora DNA-virus, inklusive beta-och gamma-herpesvirus och adenovirus. Liknande extraktioner används ofta för RNA-virus också. 9
Robustheten i detta sannolikt DNA-preparation resultat från flera olika metoder för rening som ingår. Den initiala freon extraktioner urvattnat lipid membraner, separera celler komponenter och även släppa fett kuvert och yttre proteiner inneragnen som omger herpesvirus capsids. Detta följs av ultracentrifugering, där de tunga virala nucleocapsids pellets genom två lutning kuddar, effektivt separera dem från de flesta andra cellulära komponenter. Dessa capsids är återsuspenderade, och den virala nukleokapsid DNA frigörs genom spricker den capsids med proteinas K och rengöringsmedel. Två fenol-kloroform extraktioner bort ordentligt nukleokapsid komponenter och resterande cellulära proteiner. Slutligen minskar fällning av stora virus-DNA genomet i lösning överföring av salter och föroreningar partiklar.
Detta förfarande för att isolera virus nukleokapsid DNA ger riklig, hög renhet material för tillämpningar i efterföljande led. Kombinationen av flera utvinning och steg centrifugering skiljer detta protokoll från enklare singel-extraktion protokoll som lämnar mer cellulärt skräp eller försämrade proteiner med DNA 10. Protein föroreningar kan minska lagringsstabilitet av virus-DNA och minska transfektion effektivitet i celler. Cellens DNA föroreningar inverkar negativt PCR-reaktioner och hög genomströmning protokoll sekvensering. 1 DNA avkastningen av detta protokoll är också hög, vilket gör det väl lämpat för begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) analys och södra blotting. 5,11 En nukleokapsid preparatet ger tillräckligt material för alla dessa analyser.
Den mängd celler som används för infektion påverkar eventuella avkastningen av virus-DNA. För PRV stammar med en vild typ tillväxttakt, inmatning av 5-10 rätter av PK-15 celler (en 15 cm diameter fat rymmer ca 8 x 10 6 celler) normalt ger 250-500 mikrogram av virus-DNA. För viral mutanter med en minskad avkastning på smittsamma virioner bör insatsmaterial skalas uppåt därefter. Fördubbling ingången antal rätter kommer ungefär dubbelt avkastning, och kan bearbetas med samma mängder reagens, som beskrivs här. För att öka input bortom denna punkt rekommenderar vi skiljer insatsvaran i två parallella hantering strömmar (t.ex. två cell pellets och två rör utvinning) genom steg 3,13. Två ultracentrifugering pellets av samma virusstam kan kombineras till en tub på denna resuspension steg. Om DNA inte rent bilda ett spöke i slutet av förfarandet är det primära felsökning metod för att öka ingången mängden av celler, vilket kommer att öka DNA avkastning och förbättra dess nederbörd.
Andra tillstånd kan också påverka framgången för spöket bildas. Till exempel är det viktigt att tiden skörden av infektioner vid en tidpunkt då virus nucleocapsids är riklig, men mestadels intracellulära eller cell-associerade. Virioner ut till mediet kommer inte att fångas upp av detta förfarande, och därför skörda celler för sent på infektion (t ex vid CPE har utvecklats till den punkt där cellerna lossnar från skålen) kommer att minska potentiella DNA avkastning och ghost bildas. Det är också viktigt att helt upplösa den skördade cellpelleten i LCM buffert (steg 3,2) att dra full nytta av följande extraktionen, vilket resuspension kräver mer tid och omsorg om cellpelleten har varit fryst på föregående steg. Mindre förfarandedetaljer påverka DNA avkastningen också. Medan Steg 3 och 4 kan utföras utan att använda kylda lösningar och hålla alla rören på is, är framgång för DNA-ghosting mycket högre när de reagenser förvaras kallt. På samma sätt stabiliteten i β-merkaptoetanol i lösning minskar över tid, och därför lägga till det i LCM lösningarna omedelbart före användning optimerar sin minska kapaciteten, förbättra protein störningar och ökar DNA avkastning och ghost bildas. Noggrann uppmärksamhet på dessa detaljer kommer att förbättra produktionen av hög kvalitet viralt DNA.
Eftersom virus-DNA är trögflytande, kan den resulterande lösningen heterogen. Att tillåta mer tid för resuspension från glaset kroken ökar användbara DNA avkastning och bättre lösning homogenitet. Standard spektrofotometrikan användas för att kvantifiera DNA avkastning och renhet. DNA fluorimetri ger ännu mer exakt mått på DNA avkastning (t.ex. Invitrogen PicoGreen dsDNA fläcken).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna uppskattar bidragen från Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, och medlemmar av Enquist lab i finjusterande detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
