Summary
We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.
Abstract
Virussen zijn obligate cellulaire parasieten, en dus de studie van hun DNA te isoleren vereist viraal materiaal uit de buurt van de gastheercel verontreinigingen en DNA. Diverse afgeleide toepassingen vereisen grote hoeveelheden pure viraal DNA, die wordt verzorgd door dit protocol. Deze toepassingen omvatten virale genoom, waar het wegnemen van gastheer-DNA is cruciaal voor data-uitgang te optimaliseren voor virale sequenties, en de productie van nieuwe virale recombinante stammen, waar de co-transfectie van gezuiverd plasmide en lineaire viraal DNA vergemakkelijkt recombinatie. 1,2, 3
Deze procedure maakt gebruik van een combinatie van extracties en dichtheid op basis van centrifugatie te isoleren gezuiverd lineair herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. 4,5 De eerste zuiveringsstappen doel om gezuiverd viraal capsiden isoleren, bevatten en het virale DNA te beschermen tijdens de extracties en centrifugeren stappen dat cellulaire eiwitten en DNA te verwijderen. Lysis van nucleocapsiden releases dan viraal DNA, en de twee laatste fenol-chloroform stappen te verwijderen resterende eiwitten. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is sterk geconcentreerd en zuiver, met een gemiddelde OD 260/280 van 1.90. Afhankelijk van de hoeveelheid van de gebruikte geïnfecteerde cellen, opbrengsten van viraal DNA range 150 tot 800 ug of meer. De zuiverheid van dit DNA is het stabiel tijdens langdurige opslag bij 4C. Dit DNA is dus bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties.
Voor het begin van het protocol, is het belangrijk om te weten het gemiddeld aantal cellen per schaal (bijvoorbeeld een gemiddelde van 8 x 10 6 PK-15 cellen in een confluente 15 cm schotel) en de titer van de virale voorraad worden gebruikt ( bijv. 1 x 10 8 plaque-vormende eenheden per ml). Deze zijn nodig om de juiste multipliciteit van infectie (MOI) te berekenen voor het protocol. 6 Bijvoorbeeld, om een 15 cm schotel van PK-15 cellen met de bovenstaande virale voorraad, bij een MOI van 5 infecteren, zou u 400 pi virale voorraad en verdun het met 3,6 ml van het medium (in totaal inoculatie volume van 4 ml voor een 15 cm plaat).
Meerdere viraal DNA-preparaten kunnen worden bereid op hetzelfde moment. Het aantal gelijktijdige voorbereiding wordt alleen beperkt door het aantal buizen gehouden door de ultracentrifuge rotor (een per virus, zie stap 3.9 hieronder). Hier beschrijven we de procedure zoals ook al is gedaan voor een virus.
Protocol
1. Eerste dag: virale infectie en voorbereiding van buffers
- Bereid 50-10 gerechten (15 cm diameter) van weefselkweek cellen voor infectie, bijvoorbeeld PK-15 cellen voor pseudorabies virus (PRV) of Vero-cellen voor herpes simplex virus (HSV).
- Wanneer de cellen zijn 95 - 100% confluent, infecteren ze op een (MOI) van 5-10. Om dit te doen, elke plaat met behulp van virus voorraad in een totaal volume van 4 ml per plaat te enten, dan de platen incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Rock platen voorzichtig om de 15 minuten om ervoor te zorgen dat de cel monolayer blijft volledig gecoat door het virus inoculum. Ondertussen, warm het medium voor de volgende stap.
- Na een uur van de infectie, zuigen virale inoculum van de platen, voeg 15 ml warm medium, en incuberen bij 37 ° C voor 12-20 uur in een vochtige incubator.
- Bereid LCM buffers (zie tabel 1) en rock overnacht bij 4 ° C voor een grondige mengen. Bereid TNE voor resuspensie van viraal DNA (zie tabel 2).
2. Tweede dag, Fase 1: Cell Lysis en Ultracentrifugatie
- Bevestig visueel dat de infectie van cellen heeft geleid tot een uniforme cytopathogeen effect (CPE). Laat infectie om de voortgang totdat alle cellen hebben afgerond, maar nog niet opgetild de plaat.
- Schraap de geïnfecteerde cellen in het medium, en combineren cellen en het medium in 50 ml conische buizen. Het aantal conische buizen die nodig is voor deze stap is afhankelijk van het aantal schotels voor infectie in stap 1.2 hierboven, kan bijvoorbeeld een 50 ml conische buis worden gebruikt om de pellet een maximum van drie gerechten van 15 ml medium per Optioneel:. Spoel de platen met 10 ml PBS en te combineren met de cellen en medium.
- Centrifugeer cellen en medium voor 10 minuten bij 2000 ten opzichte centifugal kracht (RCF) bij kamertemperatuur, vervolgens aspireren supernatant en resuspendeer elke pellet in 10 ml PBS. Als de pellet van een virale infectie werd verspreid in meerdere conische buizen in stap 2.2, kunnen deze worden gerecombineerd in een conische buis bij deze stap. Herhaal het centrifugeren en aspiratie Optioneel:. Dit pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C en het protocol op een later tijdstip.
3. Tweede dag, Fase 2: Ultracentrifugatie
Houd de celpellet en LCM buffers op ijs zo mogelijk in de volgende stappen.
- Voeg β-mercapto-ethanol tot 0% glycerol - LCM buffer. Begin de koeling van de ultracentrifuge (voor stap 3.9 hieronder) door het naar 4 ° C en het inschakelen van het vacuüm.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml van 0% glycerol - LCM buffer totdat het niet langer klonterig. Indien nodig, vortex de buis te breken eventuele onopgeloste celpellet.
- Extract door het toevoegen van 1,5 ml Freon (1,1,2-trichloor-1 ,2,2-trifluorethaan) en de vortexen krachtig. Onmiddellijk centrifuge gedurende 10 min op 2000 RCF bij een temperatuur van 4 ° C. Verzamel de bovenste laag met een breed-boring pipetpunt (het vermijden van de interface) en over te dragen aan een nieuwe buis Optioneel:. Als de pellet is een geleiachtig solide, kunt u snel giet de bovenste laag in een nieuwe buis.
- Herhaal de Freon extractie-en centrifuge opnieuw.
- Verzamel de bovenste laag (~ 5 ml) en over te dragen aan een nieuwe polyallomer ultracentrifuge buis. Voeg β-mercapto-ethanol aan de twee resterende glycerol - LCM buffers.
- Bereid een gradiënt in de polyallomer centrifugebuis door de onderliggende Freon extract (toplaag) met 3 ml van 5% glycerol - LCM (middelste laag) en vervolgens onderliggende opnieuw met 2,5 ml 45% glycerol - LCM (onderste laag). Gebruik een dunne pipet om overloop van de buis inhoud te vermijden.
- Indien nodig, bereid een gelijkwaardige balans buis met dezelfde verhoudingen van LCM buffers.
- Overdracht buizen in ultracentrifuge emmers. Balans emmers tot op 0,1 g van elke andere, door voorzichtig het toevoegen van extra 0% glycerol - LCM buffer om de bovenste laag (~ 50 tot 100 ul per keer).
- Met behulp van een koude ultracentrifuge met een horizontale of swingende emmer rotor, draai de evenwichtige monsters gedurende 1 uur bij 77.000 RCF (bijv. 25000 rpm voor een SW41Ti rotor) bij een temperatuur van 4 ° C.
- Tijdens de ultracentrifugatie, maak een glas haak aan drijvende DNA vast te leggen op de ethanol precipitatie stap (4.6 hieronder). Houd beide uiteinden van een glas Pasteur pipet en schorten de middelste gedeelte boven een vlam. Wanneer een deel van glas is bijna gesmolten, trek aan de glazen rekken, buigt u het voorzichtig aan een strak gebogen haak (<90 graden) te creëren, en trek scherp af te sluiten het einde. Als het uiteinde van de glazen haak open is, houdt u de tip over de vlam, zodat het glas smelt genoeg om het te sluiten.
- Na de ultracentrifugatie, ziet u een dun ondoorzichtige pellet met een donkere vlek in het midden. Zorgvuldig aspireren de vloeistof uit de tube, waaronder drippings langs de zijkanten, maar het vermijden van de pellet op de bodem van de buis.
- Voeg 0,5 ml TNE bij kamertemperatuur.
- Laat de pellet zitten voor ten minste 10 minuten voor hydratatie van de pellet mogelijk te maken. Optional: De pellet kan ook 's nachts opnieuw in suspensie in TNE, indien bewaard bij 4 ° C.
4. Derde dag: "Ghost" DNA Neerslag
- Verdeel de pellet door pipetteren met een klein kaliber pipetpunt (bijvoorbeeld een P200 pipetpunt). Maak je geen zorgen over het afschuiven van deze stap, omdat het virale DNA is nog steeds in capsiden op dit punt. Voeg de volgende reagentia voor de buis met de virale pellet, bij kamertemperatuur, tot capsiden te vernietigen:
- 4,25 ml TNE
- 0,25 ml 10% SDS
- 2 mg proteïnase K
Pas op voor scheren van hier, bijv. gebruik op grote boring pipetten en niet vortex de virale materiaal
- Extract virale eiwitten door het toevoegen van 5 ml van de fenol-chloroform en begin onmiddellijk omkeren of vortexen om een emulsie te houden. Mix voor 10 seconden, dan centrifuge de emulsie gedurende 5 minuten bij 2000 RCF bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenste laag met een breed-boring pipetpunt, het vermijden van de interface, en transfer naar een nieuwe buis Optioneel:. Gebruik phase lock gel (PLG) buizen in deze stap om besmetting van de interface te voorkomen.
- Herhaal de fenol-chloroform extractie en centrifuge opnieuw.
- Na de tweede fenol-chloroform extractie, het verzamelen van de bovenste laag in een 30 ml glazen buis Corex en chill de buis bij -20 ° C gedurende 10-15 minuten, zorg dat het niet bevriezen.
- Voeg 10 ml ijskoude ethanol, hebben betrekking op de buis (bv. door rekken een stuk van Parafilm M over de top), en omkeren om onmiddellijk te mengen. Kijk uit voor een DNA "geest" te verschijnen, die bestaat uit een dun stroperige neerslag. Keer de buis voorzichtig om verder te mengen en de plakkerige DNA precipitaten samen naar cluster veroorzaken.
- Gebruik een glazen haak aan het DNA ghost (s) vast te leggen. Voorzichtig blot het DNA om overtollige vloeistof te verwijderen, plaats dan de haak (down tip) in een 1,5 ml tube en laten drogen. Voeg 0,25 tot 0,5 ml van TE naar de DNA-spook te ontbinden. Laat resuspensie van DNA om door te gaan voor ten minste een uur. Bewaar DNA bij 4 ° C. Optioneel: DNA-opbrengst te maximaliseren, breken van het glas in de haak 1,5 ml buis, kan zo dat resuspensie uit de glasscherven blijven in de tijd.
5. Representatieve resultaten
Met een voldoende hoge MOI, moeten cellen tot volledige CPE binnen ~ 18 uur na infectie (HPI) voor de wild-type PRV stammen, en ~ 24 HPI voor wild-type HSV-1-stammen (figuur 1). Zodra de geïnfecteerde cel pellet wordt geoogst, kan de resterende stappen-protocol volledig in een lange dag of uitgevoerd in twee dagen (figuur 2).
Bij de voorbereiding van glas haken aan de DNA-spook te vangen, is het belangrijk om de haak hoek kleiner dan 90 graden, zodat later kan passen in de basis van een 1,5 ml buis (figuur 3). Het afdichten van de tip van deze haak voorkomt dat DNA-verlies in de pipet.
DNA spoken vorm tijdens de neerslag stap en zal verschijnen als witte, stroperige draden (figuur 4). Deze totale en plakken aan elkaar en / of het glas haak gebruikt om het DNA vast te leggen. Dus hetzelfde glas haak kan worden gebruikt voor het verzamelen van meerdere draden van DNA vanuit de neerslag oplossing.
| Kies een column gebaseerd op de gewenste volume: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCL | 1,3 ml | 1,9 ml | 2,5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7,4) | 300 ul | 450 ul | 600 ul | 1,2 ml |
| 1M MgCl 2 | 50 ui | 75 pl | 100 pi | 200 pi |
| 0,5 EDTA | 10 pi | 15 pl | 20 pl | 40 pi |
| NP40/IGEPAL | 50 ui | 75 pl | 100 pi | 200 pi |
| β-mercapto-ethanol (onmiddellijk toe te voegen voor gebruik) | 4,3 pl | 6,5 pl | 8,6 pl | 17,2 ul |
| Gebruik voor de gewenste proporties procent glycerol (0, 5, of 45%) | ||||
| 0% glycerol | Geen | Geen | Geen | Geen |
| water | 8,3 ml | 12,5 ml | 16,7 ml | 33,4 ml |
| 5% glycerol | 0,5 ml | 0,8 ml | 1,0 ml | 2,0 ml |
| water | 7,8 ml | 11,7 ml | 15,7 ml | 31,4 ml |
| 45% glycerol | 4,5 ml | 6,8 ml | 9,0 ml | 18,0 ml |
| water | 3,8 ml | 5,7 ml | 7,7 ml | 15,4 ml |
Tabel 1. Recepten voor de bereiding van LCM buffers
| Voor 50 ml volume |
| 5 ml 1 M NaCl |
| 2,5 ml 1 M Tris, pH 7,5 |
| 1 ml 0,5 EDTA |
| 41,5 ml H 2 O |
Tabel 2. Voorbereiding van de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA)
| Voor 1 L volume |
| 0,2 g KCl |
| 0,2 g KH 2 PO 4 |
| 8 g NaCl |
| 1.15g Na 2 HPO 4 |
| H 2 O tot 1L |
Tabel 3. Voorbereiding van PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0)
Figuur 1. PK15 cellen (A) voorafgaand aan de infectie, (B) halverwege infectie, en (C) op cytopathische effect (CPE), na een hoge multipliciteit van infectie.
Figuur 2. Overzicht van het protocol.
Figuur 3. Drie representatieve voorbeelden van glas haken gebruikt om het virale DNA geesten te verzamelen.
Figuur 4. Representatief voorbeeld van een goed gevormde en overvloedige DNA "ghost".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delen van dit protocol zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor viraal DNA isolatie in BSL4 omstandigheden, maar het past zich even goed aan niet-BSL omstandigheden. 4 Wij vaak dit protocol te gebruiken om DNA te isoleren van de alfa-herpesvirussen PRV en HSV-1, die DNA-genoom hebben ingesloten in een eiwitachtige capside en omgeven door een lipide envelop. 7,8 Toch is het waarschijnlijk direct aan te passen aan andere grote DNA-virussen, waaronder bèta-en gamma-herpesvirussen en adenovirussen. Vergelijkbare extracties worden vaak gebruikt voor de RNA-virussen en 9.
De robuustheid van dit DNA-preparaat waarschijnlijk het gevolg van de verschillende methodes van zuivering die zijn opgenomen. De initiële Freon extracties denatureren lipide membranen, het scheiden van cel componenten en ook het loslaten van de lipide envelop en buitenste zaadhuid eiwitten die herpesvirus capsiden omringen. Dit wordt gevolgd door ultracentrifugatie, waar de zware virale nucleocapsiden pellet door twee gradiënt kussens, effectief hen scheidt van de meeste andere cellulaire componenten. Deze capsiden zijn geresuspendeerd, en het virale DNA nucleocapside is vrijgegeven door het breken van de capsiden met proteinase K en afwasmiddel. Twee fenol-chloroform extractie grondig te verwijderen nucleocapside componenten en de resterende cellulaire eiwitten. Ten slotte is het neerslaan van de grote virale DNA genomen in een oplossing vermindert de overdracht van zouten of deeltjes verontreinigingen.
Deze procedure tegen virale nucleocapside DNA te isoleren biedt overvloedige, hoge zuiverheid materiaal voor afgeleide toepassingen. De combinatie van meerdere extractie en centrifugeren stappen onderscheidt dit protocol bij eenvoudige single-extractie protocols die meer cellulaire puin of afgebroken proteïne producten verlaten met het DNA 10. Eiwit verontreinigingen kunnen verminderen de stabiliteit bij opslag van viraal DNA en het verminderen van transfectie-efficiëntie in de cellen. Cellulaire DNA verontreinigingen negatief beïnvloeden PCR-reacties en de high-throughput sequencing protocollen. 1 De DNA-opbrengst van dit protocol is ook hoog, waardoor het uitermate geschikt voor restriction fragment length polymorfisme (RFLP) analyse en Southern blotting. 5,11 Een nucleocapside voorbereiding voldoende materiaal voor al deze analyses.
De hoeveelheid cellen die voor infectie invloed op de uiteindelijke opbrengst van viraal DNA. Voor de PRV stammen met een wild-type groei, inbreng van 5-10 gerechten van PK-15 cellen (een 15 cm diameter schotel bezit ongeveer 8 x 10 6 cellen) meestal levert 250 tot 500 ug van viraal DNA. Voor virale mutanten met een verminderde opbrengst van infectieuze virionen, moet het uitgangsmateriaal naar boven dienovereenkomstig worden aangepast. Verdubbeling van de inbreng aantal gerechten zal ongeveer het dubbele van de opbrengst, en kan worden verwerkt met dezelfde hoeveelheden van de reagentia hier beschreven. Ter verhoging van de input voorbij dit punt, raden wij scheiden het uitgangsmateriaal in twee parallelle verwerking streams (bijv. twee celpellets en twee extractie buizen) tot en met stap 3.13. Twee ultracentrifugatie pellets van dezelfde virusstam kunnen worden gecombineerd in een buis in deze resuspensie stap. Als het DNA niet netjes vormen een spook aan het einde van de procedure, de primaire problemen oplossen aanpak is het vergroten van de inbreng hoeveelheid cellen, die het DNA opbrengst zal toenemen en verbeteren van de neerslag.
Andere voorwaarden kunnen ook van invloed zijn voor het succes van geest formatie. Zo is het belangrijk om de tijd van de oogst van infecties op een moment dat virale nucleocapsiden overvloedig zijn, maar zijn meestal intracellulaire of cel-geassocieerd. Virionen vrijgegeven aan het medium zullen niet worden opgevangen door deze procedure, en dus oogsten cellen te laat in de infectie (bijvoorbeeld wanneer CPE is gevorderd tot het punt waar de cellen los te maken van de schotel), zal de potentiële DNA opbrengst en geest formatie te verminderen. Het is ook belangrijk om volledig op te lossen de geoogste celpellet in LCM buffer (stap 3.2) ten volle te profiteren van de volgende extractie stap te zetten, dit resuspensie vergt meer tijd en zorg als de cel pellet bevroren is geweest bij de vorige stap. Kleine procedurele details van invloed op de DNA-opbrengst ook. Terwijl de stappen 3 en 4 kan worden uitgevoerd zonder gebruik te maken gekoelde oplossingen en het houden van alle buizen op ijs, het slagingspercentage van DNA ghosting is veel hoger wanneer de reagentia koud bewaard. Ook de stabiliteit van de β-mercapto-ethanol in oplossing loop der tijd teruglopen, en dus toe te voegen aan de LCM-oplossingen direct voor gebruik de vermindering van de capaciteit optimaliseert, het verbeteren van eiwitten verstoren en het verhogen van DNA-opbrengst en geest vorming. Veel aandacht voor deze gegevens zal de output van hoge kwaliteit viraal DNA.
Omdat de virale DNA is viskeus, kan de resulterende oplossing zijn heterogeen. Waardoor er meer tijd voor resuspensie van het glas haak verhoogt de nuttige DNA-opbrengst en verbetert de oplossing homogeniteit. Standaard spectrofotometriekan worden gebruikt om DNA-opbrengst en zuiverheid kwantificeren. DNA fluorimetrie biedt zelfs nog meer precieze maatregelen van DNA-opbrengst (bv. Invitrogen PicoGreen dsDNA vlek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs waarderen de bijdragen van Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, en leden van de Enquist lab in fine-tuning van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
