Summary
Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.
Abstract
I virus sono parassiti obbligati cellulare, e quindi lo studio del loro DNA virale richiede materiale isolante lontano da agenti inquinanti e del DNA della cellula ospite. Diverse applicazioni a valle richiedono grandi quantità di puro DNA virale, che viene fornito da questo protocollo. Queste applicazioni includono il sequenziamento del genoma virale, in cui la rimozione del DNA ospite è fondamentale per ottimizzare l'output dei dati per le sequenze virali, e la produzione di nuovi ceppi virali ricombinanti, in cui la co-trasfezione del plasmide purificato e lineare facilita la ricombinazione del DNA virale. 1,2, 3
Questa procedura utilizza una combinazione di estrazioni e la densità a base di centrifugazione per isolare il DNA purificato lineare herpesvirus nucleocapside dalle cellule infette. 4,5 Le fasi iniziali di purificazione scopo di isolare purificata capsidi virale, che contengono e proteggono il DNA virale durante le estrazioni e le fasi di centrifugazione che rimuovono le proteine cellulari e il DNA. Lisi delle nucleocapsidi quindi rilascia DNA virale, e due finali fenolo-cloroformio passi rimuovere le proteine rimanenti. Il DNA finale catturato da una soluzione è altamente concentrato e puro, con un valore medio di 1,90 260/280. A seconda della quantità di cellule infette utilizzati, i rendimenti della gamma DNA virale 150-800 mg o più. La purezza di questo DNA rende stabile durante conservazione a lungo termine a 4C. Questo DNA è quindi ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni.
Prima di iniziare la procedura, è importante conoscere il numero medio di cellule per piatto (ad esempio una media di 8 x 10 6 PK-15 cellule in un piatto confluenti 15 cm), e il titolo dello stock virale da utilizzare ( ad esempio, 1 x 10 8 unità formanti placca per ml). Queste sono necessarie per calcolare la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per il protocollo. 6 Per esempio, per infettare piatto da 15 cm di PK-15 celle con il brodo sopra virale, ad una MOI di 5, si usa 400 ml di magazzino virale e diluire con 3,6 ml di terreno (volume inoculazione totale di 4 ml per piastra da 15 cm).
Molteplici preparazioni di DNA virale può essere preparato allo stesso tempo. Il numero di preparati simultanea è limitata solo dal numero di tubi detenuta dal rotore ultracentrifuga (uno per ogni virus; vedi punto 3.9). Qui si descrive la procedura come se venisse fatto per un virus.
Protocol
1. Primo Giorno: Infezione virale e preparazione del buffer
- Preparare piatti 50-10 (15 cm di diametro) di cellule di coltura per le infezioni, ad esempio, PK-15 cellule per virus pseudorabbia (PRV) o cellule Vero per l'herpes simplex virus (HSV).
- Quando le cellule sono 95 - confluenti al 100%, li infettano a (MOI) di 5-10. Per fare questo, inoculare ciascuna piastra con magazzino virus in un volume totale di 4 ml per piastra, incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C. Placche di roccia dolcemente ogni 15 minuti per assicurarsi che il monostrato cellulare rimane completamente rivestito con l'inoculo del virus. Nel frattempo, scaldare la media per il prossimo passo.
- Dopo un'ora di infezione, aspirare l'inoculo virale dai piatti, aggiungere 15 ml di terreno caldo, e incubare a 37 ° C per 12-20 ore in un incubatore umidificato.
- Preparare buffer LCM (vedi tabella 1) e rock notte a 4 ° C per omogeneizzazione della miscela. Preparare TNE per la risospensione del DNA virale (vedi Tabella 2).
2. Secondo giorno, Fase 1: la lisi cellulare e ultracentrifugazione
- Verificare visivamente che l'infezione di cellule ha causato uniforme effetto citopatico (CPE). Consentire l'infezione al progresso finché tutte le cellule hanno arrotondato per eccesso, ma non hanno sollevato il piatto.
- Raschiare le cellule infettate nel mezzo, e combinano le cellule e mezzo in 50 ml provette coniche. Il numero di tubi conici necessarie per questo passo dipenderà dal numero di piatti usati per l'infezione nella fase 1.2, ad esempio, un tubo da 50 ml può essere utilizzato per far sedimentare un massimo di 3 piatti a base di 15 ml di mezzo di ogni opzione:. Sciacquare il piastre con 10 ml di PBS e si combinano con le cellule e medie imprese.
- Cellule centrifuga e medie per 10 minuti a 2000 centifugal forza relativa (RCF) a temperatura ambiente, poi aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet in 10 ml di PBS. Se il pellet da una infezione virale è stata diffusa in più tubi conici al punto 2.2, questi possono essere ricombinati in un tubo conico in questa fase. Ripetere centrifugazione e aspirazione. Optional: Questo pellet possono essere conservati a -20 ° C e il protocollo ha continuato in un secondo momento.
3. Secondo giorno, Fase 2: ultracentrifugazione
Tenere il pellet di cellule e buffer LCM sul ghiaccio, quando possibile durante le fasi seguenti.
- Aggiungi β-mercaptoetanolo allo 0% glicerolo - buffer LCM. Iniziare il raffreddamento del ultracentrifuga (per il passo 3.9) impostandolo a 4 ° C e accendere il vuoto.
- Risospendere il pellet in 5 ml di glicerolo 0% - buffer LCM fino a quando non è più disomogeneo. Se necessario, il tubo vortex per rompere ogni cellula indisciolto pellet.
- Estrarre con l'aggiunta di 1,5 ml di Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vortex vigorosamente. Immediatamente centrifugare per 10 minuti a 2000 rcf ad una temperatura di 4 ° C. Raccogliere lo strato superiore con un ampio tunnel puntale (evitando l'interfaccia) e il trasferimento in una nuova provetta. Facoltativo: Se il pellet è un solido gelatinoso, si può rapidamente versare lo strato superiore in un nuovo tubo.
- Ripetere l'estrazione Freon e centrifugare di nuovo.
- Raccogliere lo strato superiore (~ 5 ml) e il trasferimento in una nuova provetta ultracentrifuga polyallomer. Aggiungi β-mercaptoetanolo per i restanti due glicerolo - buffer LCM.
- Preparazione di un gradiente nella provetta da centrifuga polyallomer dal sottostante l'estratto Freon (strato superiore) con 3 ml di glicerolo al 5% - LCM (strato intermedio), sottostante e poi di nuovo con 2,5 ml di 45% glicerolo - LCM (strato inferiore). Utilizzare una pipetta sottile per evitare di overflow del contenuto della provetta.
- Se necessario, preparare un tubo equivalente bilancia con le stesse proporzioni di buffer LCM.
- Trasferimento tubi in secchi ultracentrifuga. Equilibrio secchi di 0,1 g di ogni altro, da dolci aggiungendo ulteriore glicerolo 0% - buffer LCM al livello superiore (~ 50-100 microlitri alla volta).
- Utilizzando un ultracentrifuga freddo con un rotore orizzontale o oscillare, ruotare i campioni equilibrato per 1 ora a 77000 rcf (ad esempio 25.000 rpm per un rotore SW41Ti) ad una temperatura di 4 ° C.
- Durante ultracentrifugazione, fare un gancio di vetro per catturare DNA galleggiante nel passaggio precipitazione in etanolo (4.6). Tenere entrambe le estremità di una pipetta Pasteur in vetro e sospendere la sezione centrale a fuoco. Quando una sezione del vetro è quasi fuso, tirare delicatamente per allungare il vetro, piegare delicatamente per creare un gancio ben angolato (<90 gradi), e tirare bruscamente a sbarrare la strada alla fine. Se la punta del gancio vetro è aperto, tenere la punta sulla fiamma in modo che il vetro fonde a sufficienza per chiuderla.
- Dopo l'ultracentrifugazione, si dovrebbe vedere un sottile opaca pellet con una macchia scura al centro. Con attenzione aspirare il liquido dal tubo, tra cui colature lungo i lati, ma evitando il pellet sul fondo della provetta.
- Aggiungere 0,5 ml di TNE a temperatura ambiente.
- Lasciate che i pellet riposare per almeno 10 minuti per permettere l'idratazione del pellet. Optional: Il pellet può anche risospendere in TNE durante la notte, se conservato a 4 ° C.
4. Terzo Giorno: "Ghost" Precipitazione del DNA
- Spezzare il pellet pipettando con un piccolo foro puntale (ad esempio una punta p200 pipetta). Non preoccupatevi di taglio in questa fase, perché il DNA virale è ancora contenuto in capsidi a questo punto. Aggiungere i seguenti reagenti per il tubo contenente il virale a pellet, a temperatura ambiente, di distruggere capsidi:
- 4,25 ml TNE
- 0,25 ml 10% SDS
- 2 mg proteinasi K
Attenzione taglio da qui in poi, ad esempio l'uso di grosso calibro pipette e non vortice del materiale virale
- Estratto di proteine virali con l'aggiunta di 5 ml di fenolo-cloroformio e iniziare immediatamente invertendo o vortex per mantenere una emulsione. Mescolare per 10 secondi, quindi l'emulsione centrifuga per 5 minuti a 2000 rcf a temperatura ambiente. Raccogliere il strato superiore con un ampio tunnel punta della pipetta, evitando l'interfaccia, e il trasferimento in una nuova provetta. Optional: Usa ad aggancio di fase gel (PLG), tubi in questa fase per evitare la contaminazione con l'interfaccia.
- Ripetere l'estrazione fenolo-cloroformio e centrifugare di nuovo.
- Dopo la seconda estrazione fenolo-cloroformio, raccogliere lo strato superiore in una provetta di vetro da 30 ml Corex e freddo il tubo a -20 ° C per 10-15 minuti, avendo cura che non congelare.
- Aggiungere 10 ml di etanolo ghiacciato, coprire il tubo (ad esempio allungando un pezzo di Parafilm M sopra le righe), e miscelare immediatamente. Guardare per un DNA "fantasma" a comparire, che consiste in un precipitato ropy sottile. Capovolgere la provetta delicatamente per mescolare ulteriormente e provocare il DNA appiccicoso precipitati di raggruppare insieme.
- Utilizzare un gancio di vetro per catturare il fantasma del DNA (s). Con attenzione macchia il DNA per eliminare il liquido in eccesso, quindi inserire il gancio (punta verso il basso) in una provetta da 1,5 ml e lasciare asciugare. Aggiungi 0,25-0,5 ml di TE per sciogliere il fantasma del DNA. Lasciare risospensione del DNA per procedere per almeno un'ora. DNA conservare a 4 ° C. Facoltativo: per massimizzare la resa del DNA, rompere il gancio di vetro nella provetta da 1,5 ml, in modo che la risospensione fuori i frammenti di vetro possa continuare nel tempo.
5. Rappresentante Risultati
Con un sufficientemente elevato MOI, le cellule devono raggiungere la piena CPE entro ~ 18 ore dopo l'infezione (HPI) per i ceppi wild-type PRV, e ~ 24 HPI di wild-type ceppi di HSV-1 (Figura 1). Una volta infettato il pellet cellulare viene raccolta, i passaggi rimanenti protocollo può essere completa in un solo giorno o svolte nell'arco di due giorni (Figura 2).
Quando si prepara ganci di vetro per catturare il fantasma del DNA, è importante per rendere l'angolo gancio essere inferiore a 90 gradi, in modo che poi si può andare bene nella base di un tubo da 1,5 ml (Figura 3). Sigillando la punta di questo gancio previene la perdita di DNA all'interno della pipetta.
Fantasmi del DNA si formano durante la fase di precipitazione e appariranno come bianco, fili filante (Figura 4). Questi aggregati e bastone tra loro e / o il gancio di vetro utilizzato per catturare il DNA. Così il gancio stesso bicchiere può essere usato per raccogliere più thread di DNA all'interno della soluzione di precipitazione.
| Scegli colonna in base al volume desiderato: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCL | 1,3 ml | 1,9 ml | 2,5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7,4) | 300 ul | 450 microlitri | 600 microlitri | 1,2 ml |
| 1M MgCl 2 | 50 microlitri | 75 microlitri | 100 ul | 200 l |
| 0,5 EDTA | 10 microlitri | 15 microlitri | 20 l | 40 microlitri |
| NP40/IGEPAL | 50 microlitri | 75 microlitri | 100 ul | 200 l |
| β-mercaptoetanolo (aggiungere immediatamente prima dell'uso) | 4,3 microlitri | 6,5 microlitri | 8,6 microlitri | 17,2 microlitri |
| Utilizzare le proporzioni per cento glicerolo desiderato (0, 5 o 45%) | ||||
| 0% glicerolo | Nessuno | Nessuno | Nessuno | Nessuno |
| acqua | 8,3 ml | 12,5 ml | 16,7 ml | 33,4 ml |
| 5% di glicerolo | 0,5 ml | 0,8 ml | 1,0 ml | 2,0 ml |
| acqua | 7,8 ml | 11,7 ml | 15,7 ml | 31,4 ml |
| 45% glycerol | 4,5 ml | 6,8 ml | 9,0 ml | 18,0 ml |
| acqua | 3,8 ml | 5,7 ml | 7,7 ml | 15,4 ml |
Tabella 1. Ricette per la preparazione di tamponi LCM
| Per 50 ml |
| 5 ml 1M NaCl |
| 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 |
| 1 ml di EDTA 0,5 |
| 41,5 ml di H 2 O |
Tabella 2. Preparazione di TNE (0,1 M di NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA)
| Per 1 volume L |
| 0,2 g KCl |
| 0,2 g di KH 2 PO 4 |
| 8 g di NaCl |
| 1.15g Na 2 HPO 4 |
| H 2 O per 1L |
Tabella 3. Preparazione del PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4; 137 mm NaCl; 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0)
Figura 1. PK15 cellule (A) prima infezione, (B) a metà strada attraverso l'infezione, e (C) a effetto citopatico (CPE), dopo una molteplicità di infezione.
Figura 2. Panoramica del protocollo.
Figura 3. Tre esempi rappresentativi di vetro ami utilizzati per raccogliere i fantasmi del DNA virale.
Figura 4. Esempio rappresentativo di una ben formata e abbondante DNA "fantasma".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parti di questo protocollo sono stati originariamente sviluppati per l'isolamento del DNA virale nel BSL4 condizioni, ma si adatta altrettanto bene a non BSL condizioni. 4 Si comunemente utilizzano questo protocollo per isolare il DNA dalla alfa-herpesvirus PRV e HSV-1, che hanno genomi di DNA racchiuso in una capside proteica e circondato da un involucro lipidico. 7,8 Tuttavia è probabile direttamente adattabile ad altri virus a DNA di grandi dimensioni, tra cui beta-e gamma-herpes virus e gli adenovirus. Estrazioni simili sono comunemente utilizzati per virus a RNA e 9.
La robustezza dei risultati di questa preparazione del DNA che potrebbero derivare dai diversi metodi di purificazione che sono inclusi. L'iniziale Freon estrazioni membrane lipidiche denaturano, separando i componenti cellulari e anche rilasciando la busta dei lipidi e le proteine tegumento esterno che circondano capsidi herpesvirus. Questo è seguito da ultracentrifugazione, dove il nucleocapsidi pesante virale pellet attraverso due cuscini di pendenza, di fatto li separa dalla maggior parte delle altre componenti cellulari. Queste capsidi sono rimesse in sospensione e il DNA virale nucleocapside viene rilasciato dalla rottura del capsidi con proteinasi K e detergenti. Due fenolo-cloroformio estrazioni completamente rimuovere i componenti nucleocapside e qualsiasi rimanenti proteine cellulari. Infine, precipitazioni dei genomi grandi DNA virale in soluzione riduce il riporto di sali o particelle contaminanti.
Questa procedura per isolare il DNA virale nucleocapside fornisce abbondanti, materiale di alta purezza per applicazioni a valle. La combinazione di estrazione multipli e le fasi di centrifugazione distingue questo protocollo dalla semplice singola estrazione protocolli che lasciano detriti cellulari o più prodotti proteici degradate con il DNA 10. Contaminanti proteina può diminuire la stabilità allo stoccaggio del DNA virale, e ridurre l'efficienza di trasfezione nelle cellule. Contaminanti DNA cellulare influire negativamente le reazioni PCR e high-throughput protocolli di sequenziamento. 1 La resa del DNA di questo protocollo è elevata, il che rende particolarmente adatto a polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) e Southern blotting. 5,11 nucleocapside fornisce una preparazione sufficiente materiale per tutte queste analisi.
La quantità di cellule usate per l'infezione influisce sul rendimento finale del DNA virale. Per i ceppi PRV con un wild-type il tasso di crescita, ingresso di piatti 5-10 di PK-15 celle (da 15 cm di diametro piatto contiene circa 8 x 10 6 cellule), si ottiene di solito 250-500 mg di DNA virale. Per i mutanti virali con una resa ridotta di virioni infettivi, il materiale dovrebbe essere scalata verso l'alto di conseguenza. Raddoppiando il numero di input di piatti saranno circa il doppio del rendimento, e può essere lavorato con le stesse quantità di reagenti descritto qui. Per aumentare l'ingresso di là di questo punto, ti consigliamo di separare il materiale in ingresso in due flussi paralleli di gestione (ad esempio due pellet cellulari e due tubi di estrazione) fino al passo 3.13. Due palline ultracentrifugazione dello stesso ceppo virale possono essere combinati in un unico tubo in questa fase risospensione. Se il DNA non riesce a formare un fantasma pulito al termine della procedura, il metodo di risoluzione dei problemi primario è quello di aumentare la quantità di input di cellule, che consentirà di aumentare la resa del DNA e migliorare la sua precipitazione.
Altre condizioni possono anche influenzare il successo di formazione fantasma. Per esempio, è importante il tempo della raccolta delle infezioni in un momento in cui nucleocapsidi virale sono abbondanti, ma sono per lo più intracellulari o associato alle cellule. Virioni rilasciati al mezzo non sarà catturato da questa procedura, e quindi la raccolta delle cellule troppo tardi infezione (ad esempio quando CPE è progredita al punto in cui le cellule si staccano dal piatto) ridurrà resa potenziale del DNA e la formazione fantasma. E 'anche importante per sciogliere completamente il raccolto pellet cellulare in LCM buffer (punto 3.2) per sfruttare al massimo la fase di estrazione seguente: questo risospensione richiede più tempo e attenzione, se il pellet cellulare è stato congelato al passaggio precedente. Minore dettagli procedurali influenzano la resa del DNA pure. Mentre i punti 3 e 4 può essere effettuata senza l'utilizzo di soluzioni di freddo e mantenendo tutte le provette su ghiaccio, il tasso di successo di ghosting DNA è molto più alto quando i reagenti sono conservati a freddo. Allo stesso modo, la stabilità del β-mercaptoetanolo in soluzione diminuisce nel tempo e quindi di aggiungere alle soluzioni LCM immediatamente prima dell'uso ottimizza la sua capacità di ridurre, migliorare la rottura delle proteine e la maggiore produttività di DNA e la formazione fantasma. Attenzione a questi dettagli migliorerà l'uscita del DNA virale di alta qualità.
Perché il DNA virale è viscoso, la soluzione risultante può essere eterogenei. Lasciando più tempo per risospensione dal gancio di vetro aumenta il rendimento utile del DNA e migliora l'omogeneità soluzione. Standard di spettrofotometriapuò essere utilizzato per quantificare il DNA resa e la purezza. Fluorimetria DNA fornisce misure ancora più precisa del rendimento del DNA (ad esempio Invitrogen PicoGreen dsDNA macchia).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori apprezzano i contributi di Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, e membri del laboratorio Enquist nel perfezionare questo protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
