Summary
Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.
Abstract
Virüsler zorunlu hücresel parazitler, ve böylece kendi DNA çalışma, konak hücre kirleticiler ve DNA viral malzeme izole gerektirir. Birkaç downstream uygulamalar bu protokolü tarafından sağlanan saf viral DNA, büyük miktarlarda gerektirir. Bu uygulamalar, viral genom konak DNA kaldırılması viral dizileri için veri çıkışı optimize etmek için çok önemlidir sıralama, ve yeni rekombinant virüs suşları üretimi, plazmid ve lineer viral DNA rekombinasyon kolaylaştırır saflaştırılmış co-transfeksiyon 1,2, 3
Bu prosedür, ekstraksiyon ve enfekte hücrelerden doğrusal herpesvirus nucleocapsid saflaştırılmış DNA izole etmek için yoğunluk tabanlı santrifüj bir kombinasyonunu kullanır. 4,5 ilk arıtma adımları ekstraksiyon ve santrifüj adımları sırasında viral DNA içermediğinden ve korumak, saflaştırılmış virüs capsids izole etmek amacı hücresel protein ve DNA kaldırmak. Nucleocapsids, Lizis sonra viral DNA açıklamaları ve son iki fenol-kloroform adımları kalan proteinler kaldırmak. Çözüm yakalanan son DNA, 1.90 ortalama OD 260/280 ile, son derece konsantre ve saf. Kullanılan enfekte hücreler, viral DNA aralığı 150-800 mg veya daha fazla verim miktarına bağlı olarak değişir. Bu DNA saflık 4C uzun süreli depolama sırasında istikrarlı hale getiriyor. Bu DNA böylece ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonları ve transfections için çok uygundur.
Protokol başlamadan önce, çanak başına hücre (örneğin konfluent 15 cm çanak ortalama 8 x 10 6 PK-15 hücreleri) ve viral stokunun titresi (ortalama sayısını bilmek önemlidir. örneğin 1 x 10 ml başına 8 plak oluşturan birim). Bu protokol için uygun enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamak için gereklidir. Örneğin 6, 5 bir İçişleri Bakanlığı Yukarıdaki viral stoğu ile PK-15 hücreleri, biri 15 cm çanak bulaştırmak için, 400 ul 3.6 ml (15 cm plaka için toplam aşılama hacmi 4 ml) orta ile viral stok ve sulandırmak.
Çoklu viral DNA preparatları aynı zamanda hazırlanabilir. Sadece ultrasantrifüjdeki rotor tarafından düzenlenen tüplerin sayısına göre eş zamanlı olarak hazırlıkları sayısı sınırlıdır (virüs başına bir adım aşağıda 3.9). Burada bir virüs için yapılıyor gibi prosedürü açıklar.
Protocol
1. İlk Gün: Viral Enfeksiyon ve Tamponlar hazırlanması
- Doku kültürü enfeksiyon hücreleri 5-10 yemekleri hazırlayın (15 cm çapında), örneğin pseudorabies virüs (PRV) veya herpes Vero hücreleri PK-15 hücreleri virüs simpleks (HSV).
- Hücreleri 95 -% 100 birleşmiş, bir (İçişleri Bakanlığı) 5-10 onları bozar. Bunu yapmak için, plaka, plaka başına 4 ml toplam hacmi virüs stok kullanılarak her aşılamak, daha sonra 37 tabak az 1 saat inkübe ° C Rock plates yavaşça her 15 dakikada bir hücre tek tabaka virüs inokulum tarafından tamamen kaplı kalmasını sağlamak için. Bu arada, bir sonraki adım için ortam sıcak.
- Bir saat sonra enfeksiyon, viral inokulum plakalardan aspire 15 ml sıcak orta ekleyin ve 37 ° C'de 12-20 saat süreyle nemlendirilmiş bir inkübatör.
- LCM tamponlar (bkz. Tablo 1) ve geceleme kaya 4 ° C tam karıştırma için hazırlayın. (Bkz. Tablo 2) viral DNA tabanda için TNE hazırlayın.
2. İkinci Gün, 1. Aşama: Hücre Lizis ve Ultrasantrifügasyon
- Görme hücre enfeksiyon tekdüze sitopatik etki (CPE) neden oldu onaylamak. Tüm hücreleri yuvarlak var, ama plaka kaldırdı kadar enfeksiyon ilerlemeye izin ver.
- Enfekte olmuş hücreleri ortama Pençe ve 50 ml konik tüpler içine hücreleri ve orta birleştirmek. Bu adım için gerekli konik tüpler sayısı yukarıdaki Adım 1.2 enfeksiyon için kullanılan yemekler sayısına bağlı olacaktır, örneğin bir 50 ml konik tüp maksimum 3 yemekler her Opsiyonel 15 ml orta pelet kullanılır: durulayın 10 ml PBS ile plakaları ve hücreleri ve orta ile birleştirir.
- Santrifüj hücreleri ve 2000 oda sıcaklığında göreceli centifugal kuvveti (RCF) 10 dakika orta, sonra supernatant aspirat ve 10 ml PBS her pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bir viral enfeksiyon pelet Adım 2.2 'de birden fazla konik tüpler içine yayılmış ise, bu adım konik bir tüp içine recombined olabilir. Tekrar santrifüj ve aspirasyon Opsiyonel: Bu pelet -20 ° C'de saklanır ve protokol, daha sonraki bir zamanda devam edilebilir .
3. İkinci Gün, 2. Aşama: Ultrasantrifügasyon
Aşağıdaki adımları sırasında hücre pelet ve buz üzerinde LCM tamponlar zaman tutun.
- 0% gliserol β-mercaptoethanol Ekle - LCM tampon. Ayarlayarak ultrasantrifüjdeki (aşağıda adım 3.9) soğutma başlayın 4 ° C ve vakum açma.
- Uzun clumpy kadar LCM tampon - 0% gliserol 5 ml hücre pelletini tekrar. Gerekirse tüp herhangi bir çözünmemiş hücre pelletini break up, girdap.
- 1.5 ml Freon (1,1,2-trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) ekleyerek ve şiddetle vorteks ayıklayın. Hemen 4 ° C sıcaklıkta 2000 RCF az 10 dakika süreyle santrifüj Geniş çaplı bir pipet (arayüz kaçınarak) ile üst katman toplayın ve yeni bir tüp Opsiyonel transferi: pelet jelatinimsi bir katı ise, yeni bir tüp içine hızlı bir şekilde en üst tabakasını dökmek.
- Freon çıkarma tekrarlayın ve tekrar santrifüj.
- En üst tabakası (~ 5 ml) toplayın ve yeni bir polyallomer ultrasantrifüjdeki tüp transfer. LCM tamponlar kalan iki gliserol β-mercaptoethanol ekleyin.
- LCM (orta tabaka), ve sonra tekrar 2.5 ml% 45 gliserol ile underlaying - - LCM (alt tabaka) 3 ml% 5 gliserol ile Freon ekstraktı (üst tabaka) underlaying polyallomer santrifüj tüpüne bir degrade hazırlayın. Tüp içeriğinin taşma önlemek için ince bir pipet kullanın.
- Gerekirse, LCM tamponlar aynı oranlarda kullanarak eşdeğer bir denge tüp hazırlayın.
- Tüpler ultrasantrifüjdeki kova içine aktarın. LCM tampon üst tabakası (bir kerede ~ 50-100 ul) - hafifçe ekstra% 0 gliserol ekleyerek, 0,1 g birbirlerinin içinde kova Dengesi.
- Yatay veya sallanan bir kova rotor soğuk bir ultrasantrifüjdeki kullanarak, 77,000 RCF (örneğin bir SW41Ti rotor için 25.000 rpm), 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle dengeli örnekleri Spin
- Ultrasantrifügasyon sırasında, etanol yağış adım (4.6), kayan DNA yakalamak için bir cam kanca olun. Bir bardak yeniden süspanse her iki ucundan tutun ve bir alev üzerinde orta bölümü askıya. Cam bir bölüm neredeyse erimiş olduğunda, cam germek için nazikçe çekin sıkıca açılı bir kanca (<90 derece) oluşturmak için hafifçe bükün, ve sonunda mühür keskin çekin. Cam, cam kanca ucu açık ise kapatmak için yeterli erir, böylece ateşte ucu tutun.
- Ultrasantrifügasyon sonra, ince bir opak pelet ortasında karanlık bir nokta göreceksiniz. Dikkatle tüpten kenarları boyunca damlayan da dahil olmak üzere sıvı aspire, ancak tüpün alt kısmında pelet kaçınarak.
- Oda sıcaklığında 0,5 ml TNE ekleyin.
- Pelet, pelet hidrasyon sağlamak için en az 10 dakika oturup Optional: 4 tutulması durumunda pelet gecede TNE tekrar süspansiyon ° C
4. Üçüncü Gün: "Ghost" DNA Yağış
- Küçük çaplı bir pipet ucu (örneğin bir P200 pipet) ile pipetleme pelet kadar Break . Viral DNA, hala bu noktada capsids bulunan olduğundan, bu aşamada kesme hakkında endişelenmeyin. Capsids yok oda sıcaklığında viral pelet, içeren tüp aşağıdaki reaktifler ekleyin:
- 4.25 ml TNE
- 0.25 ml% 10 SDS
- 2 mg Proteinaz K
Burada kesme dikkat edin, örneğin büyük çaplı pipetler viral malzeme kullanımı ve vorteks yok
- Fenol-kloroform 5 ml ekleyerek viral proteinler ayıklayın ve bir emülsiyon korumak için hemen tersini veya vorteks başlar. 10 saniye boyunca karıştırın, sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 RCF emülsiyon santrifüj. , Geniş çaplı bir pipet ucu ile üst tabaka toplama arayüzü kaçınarak, ve yeni bir tüpe transfer İsteğe bağlı: Bu adımda kullanın faz kilidi jel (PLG) tüpler arayüzü kirlenmesini önlemek amacıyla.
- Fenol-kloroform ekstraksiyon tekrarlayın ve tekrar santrifüj.
- Ikinci fenol-kloroform ekstraksiyon sonra, 30 ml cam Corex tüpe üst tabaka toplamak ve tüp -20 ° C'de 10-15 dakika soğuk dondurma olmadığını özen.
- 10 ml buz gibi soğuk etanol, tüp örtüsü, (örneğin Parafilm M üstünden bir parça uzanan) ve hemen karıştırmak için ters. Ince bir vıcık vıcık çökelti oluşur görünür bir DNA "hayalet", dikkat edin. Hafifçe daha da karıştırmak ve yapışkan DNA birlikte küme çökeltileri neden Tüpü ters çevirin.
- DNA hayalet (ler) yakalamak için bir bardak kanca kullanın. Dikkatlice aşırı sıvı kaldırmak için DNA blot, daha sonra 1.5 ml tüpe kanca (aşağı ucu) yerleştirin ve kurumasını bekleyin. Ekle 0.25 - 0.5 ml TE DNA hayalet çözülür. En az bir saat devam etmek için DNA tabanda İzin. 4 Mağaza DNA ° C İsteğe Bağlı: 1.5 ml tüp içine cam kanca kesiyorum, DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için, cam parçaları kapalı böylece tabanda zamanla devam edebilirsiniz.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Hücreleri ile İçişleri Bakanlığı yeterince yüksek bir, yabani tip PRV suşları için ~ 18 saat sonrası enfeksiyon (HPI) içinde tam CPE ulaşmak, ve yabani tip HSV-1 suşu (Şekil 1) ~ 24 HPI. Bir kez enfekte hücrenin pelet hasat edilir, kalan protokol adımları tam bir uzun gün ya da iki gün (Şekil 2) üzerinden yürütülmektedir.
DNA hayalet yakalamak için cam kanca hazırlarken, daha sonra 1.5 ml tüp tabanı (Şekil 3) içine sığabilecek kadar kanca açı 90 dereceden daha az olması, yapmak için önemlidir. Bu kanca ucu Sızdırmazlık pipetlemeyin içindeki DNA kaybını önler.
DNA hayaletler yağış adım sırasında formu ve beyaz, vıcık vıcık ipler (Şekil 4) olarak görünecektir. Birbirleriyle ve / veya DNA yakalamak için kullanılan cam kanca Bu agrega ve sopa. Böylece aynı cam kanca yağış çözüm içinde birden çok iş parçacığı DNA toplamak için kullanılabilir.
| İstenen hacme dayalı sütunu seçin: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCL | 1.3 ml | 1.9 ml | 2.5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH, 7.4 ') | 300 ul | 450 ul | 600 ul | 1.2 ml |
| 1M MgCl 2 | 50 ul | 75 ul | 100 ul | 200 ul |
| 0,5 EDTA | 10 ul | 15 ul | 20 ul | 40 ul |
| NP40/IGEPAL | 50 ul | 75 ul | 100 ul | 200 ul |
| β-mercaptoethanol (kullanmadan önce hemen eklemek) | 4.3 ul | 6.5 ul | 8.6 ul | 17.2 ul |
| İstenen yüzde gliserol (0, 5 veya 45%) oranlar kullanın | ||||
| 0% gliserol | Hiçbiri | Hiçbiri | Hiçbiri | Hiçbiri |
| su | 8.3 ml | 12.5 ml | 16.7 ml | 33.4 ml |
| % 5 gliserol | 0.5 ml | 0.8 ml | 1.0 ml | 2.0 ml |
| su | 7.8 ml | 11.7 ml | 15.7 ml | 31.4 ml |
| % 45 glycerol | 4,5 ml | 6.8 ml | 9.0 ml | 18.0 ml |
| su | 3.8 ml | 5.7 ml | 7.7 ml | 15.4 ml |
Tablo 1. LCM tamponlar hazırlanması için tarifler
| 50 ml hacim için |
| 5 ml 1M NaCl |
| 2.5 ml 1M Tris, pH 7.5 |
| 1 ml 0,5 EDTA |
| 41.5 ml H 2 O |
Tablo 2. TNE (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM EDTA 0,1 M NaCl) hazırlanması
| 1 L hacim için |
| 0.2 g KCl |
| 0.2 g KH 2 PO 4 |
| 8 g NaCl |
| 1.15g Na 2 HPO 4 |
| 1L için H 2 O |
Tablo 3. PBS (1.5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8.1 mM 2 HPO 4 Na; pH 7.0 2.7 mM KCl) hazırlanması
Şekil 1: PK15 hücreleri enfeksiyon (A) önce, sonra (B) yüksek bir enfeksiyon çokluğu yarıda enfeksiyon yoluyla ve (C) sitopatik etki (CPE).
Şekil 2 protokol bakış.
Şekil 3. Üç cam temsilcisi örnekler viral DNA hayaletler toplamak için kullanılan kanca.
Şekil 4 iyi biçimlenmiş ve bol miktarda DNA "hayalet" temsili bir örnek .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol bölümleri başlangıçta BSL4 şartlarda viral DNA izolasyonu için geliştirilmiş, ancak bu eşit olmayan BSL koşulları iyi uyum 4. yaygın DNA genomların olan alfa-herpesvirüslerinin PRV ve HSV-1, DNA izole etmek için bu protokolü kullanan kapsid bir protein ve lipid bir zarf ile çevrili içine 7,8 Bununla beraber, beta ve gama-herpesvirüslerinin ve adenovirüs, büyük olasılıkla diğer büyük DNA virüsleri doğrudan uyarlanabilir. Benzer ekstraksiyon yaygın RNA virüsleri için de kullanılır. 9
Bu DNA hazırlanması muhtemel sonuçları dahildir arıtma birden çok yöntem sağlamlığı. Ilk Freon ekstraksiyon doğasını lipid membranlar, hücre bileşenleri ayıran ve aynı zamanda lipid zarf ve herpesvirus capsids çevreleyen dış tegüment proteinler serbest. Bu ağır viral nucleocapsids pelet iki degrade yastıklar sayesinde, diğer birçok hücresel bileşenleri etkin bir şekilde onları ayıran Ultrasantrifügasyon tarafından takip edilmektedir. Bu capsids yeniden süspanse ve viral nucleocapsid DNA proteinaz K ve deterjan ile capsids çatlaması tarafından yayınlandı. İki fenol-kloroform ekstraksiyon nucleocapsid bileşenleri ve kalan herhangi bir hücresel proteinlerin iyice kaldırın. Son olarak, tuz veya partikül kirleticiler çözelti içinde büyük bir viral DNA genomların yağış taşınmasını azaltır.
Bu prosedür, viral nucleocapsid DNA'yı izole etmek için, downstream uygulamalar için bol, yüksek saflıkta malzeme sağlar. Birden fazla ekstraksiyon ve santrifüj adımları birlikte, 10 ile DNA, daha hücresel enkaz veya bozulmuş protein ürünleri terk basit bir tek-çıkarma protokolleri bu protokol ayırır. Protein kirleticiler, viral DNA depolama kararlılığı azalma, ve hücre içine transfeksiyon etkinliğini azaltır. Hücresel DNA kirleticiler PCR reaksiyonları ve yüksek verim sıralama protokolleri olumsuz etkisi, bu protokolün 1 DNA verimi iyi RFLP (RFLP) analizi ve blot Güney 5,11 Bir nucleocapsid hazırlanması için uygun yeterli sağlar, aynı zamanda yüksek Tüm bu analizler için malzeme.
Enfeksiyon için kullanılan hücre miktar viral DNA nihai verim etkiler. Yabani tip bir büyüme oranı, PK-15 hücreleri (yaklaşık 8 x 10 6 hücre bir adet 15 cm çaplı çanak tutar) 5-10 yemekler giriş PRV suşları için genellikle viral DNA 250-500 mikrogram verir. Bulaşıcı virionlar bir azalma verim ile viral mutantlar için, giriş malzeme yukarı buna göre ölçeklendirilebilir olmalıdır. Yemekler giriş sayısını iki katına verim yaklaşık iki katına çıkacak ve burada açıklanan reaktiflerin miktarları ile işlenebilir. Bu noktadan sonra giriş artırmak için, adım 3.13 ile iki paralel taşıma akışları (örneğin iki cep pelet ve iki çıkarma tüpleri) içine girdi malzemesi ayırmanızı öneririz. İki Ultrasantrifügasyon pelet aynı virüs suşu bu tabanda adım bir tüp içine kombine edilebilir. DNA temiz bir prosedürün sonunda bir hayalet kuramazsa, birincil sorun giderme yaklaşım, hücre DNA verim artışı ve yağış artıracak giriş miktarı artırmak için.
Diğer koşullar aynı zamanda hayalet oluşumu başarısını etkileyebilir. Örneğin, hasat zamanı, viral nucleocapsids bol bir noktada enfeksiyonların önemli, ama çoğunlukla hücre içi veya hücre ile ilişkili. Orta piyasaya virionlar bu yordamı tarafından yakalanan ve bu nedenle çok geç enfeksiyon (CPE hücreleri çanak ayırmak noktaya ilerlemiştir örneğin) hücreler hasat potansiyel DNA verim ve hayalet oluşumunu azaltacaktır. Aşağıdaki ekstraksiyon adımın tam olarak yararlanmak için LCM tampon hasat hücre pelletini (Adım 3.2) tamamen erimesi için de önemlidir; hücre pelletini önceki adımı dondurulmuş varsa bu tabanda daha fazla zaman ve dikkat gerektirir. Minör usul ayrıntıları yanı sıra DNA verimi etkiler. 3. ve 4. adımları, soğuk çözümlerini kullanarak ve buz üzerinde tüm tüpleri tutarak olmadan yapılabilir ederken, DNA gölgelenme reaktifleri soğuk tutulur başarı oranı çok daha yüksektir. Benzer şekilde, çözüm zamanla azalır ve bu nedenle hemen önce azaltan kapasite kullanımı optimize LCM çözümler ekleyerek protein bozulması iyileştirilmesi ve DNA verim ve hayalet oluşumunu artırarak β-mercaptoethanol istikrar. Bu detaylara dikkat yüksek kaliteli viral DNA çıkış artıracaktır.
Viral DNA viskoz olduğundan, ortaya çıkan çözüm heterojen olabilir. Cam kanca tabanda daha fazla zaman izin vermek yararlı DNA verimi artırır ve çözüm daha homojen olmasını sağlar. Standart spektrofotometriDNA verim ve saflık ölçmek için kullanılabilir. DNA fluorimetry DNA verim daha hassas önlemler (örneğin Invitrogen PicoGreen dsDNA leke) sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarları Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, Enquist laboratuvar ince ayar bu protokol üyeleri ve katkıları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
