Summary
Questo articolo descrive le procedure di base per lo svolgimento di esperimenti di mappatura ottica nella Langendorff-perfuso cuore di coniglio con il sistema di imaging panoramico, e il doppio (tensione e calcio) modalità di imaging.
Abstract
L'imaging ottico e sonde fluorescenti hanno metodologia di ricerca avanzate in modo significativo nel campo della elettrofisiologia cardiaca in modi che non avrebbe potuto essere realizzato da altri approcci 1. Con l'uso dei coloranti calcio e voltaggio-sensibile, la mappatura ottica permette la misurazione dei potenziali d'azione transmembrana e transienti di calcio ad alta risoluzione spaziale, senza il contatto fisico con il tessuto. Questo rende le misurazioni dell'attività elettrica cardiaca possibile in molte condizioni in cui l'utilizzo di elettrodi è scomodo o impossibile 1. Per esempio, le registrazioni ottiche fornire accurate cambiamenti morfologici del potenziale di membrana durante e immediatamente dopo la stimolazione e defibrillazione, mentre le tecniche di elettrodi convenzionali soffrono di stimolo-indotta artefatti durante e dopo gli stimoli a causa di polarizzazione degli elettrodi 1.
Il Langendorff-perfuso cuore di coniglio è uno dei modelli più studiati della fisiologia e fisiopatologia cuore umano. Molti tipi di aritmie clinicamente osservato potrebbe essere riassunta nel modello cuore di coniglio. E 'stato dimostrato che i modelli di onda nel cuore di coniglio durante aritmie ventricolari, determinata dalla dimensione effettiva del cuore e la lunghezza d'onda di rientro, sono molto simili a quella del 2 cuore umano. E 'stato anche dimostrato che gli aspetti critici di eccitazione-contrazione (CE) accoppiamento in coniglio miocardio, come ad esempio il contributo relativo del reticolo sarcoplasmatico (SR), è molto simile a uomo accoppiamento CE 3. Qui vi presentiamo le procedure di base di esperimenti di mappatura ottica in Langendorff-perfuso cuori di coniglio, tra cui la configurazione del sistema perfusione Langendorff, l'ottica di mappatura dei sistemi, l'isolamento e la cannulazione della perfusione cardiaca, colorazione e tintura del cuore, eccitazione-contrazione disaccoppiamento, e la raccolta di segnali ottici. Questi metodi possono essere applicate anche al cuore da specie diverse da coniglio con adattamenti portate, ottica, soluzioni, ecc
Due sistemi di mappatura ottica sono descritti. Il sistema di mappatura panoramica è utilizzato per mappare l'intera epicardio del cuore di coniglio 4-7. Questo sistema fornisce una visione globale dell'evoluzione dei circuiti rientranti durante arrhythmogenesis e la defibrillazione, ed è stato utilizzato per studiare i meccanismi di aritmie e antiaritmici terapia 8,9. Il sistema di doppia mappatura viene utilizzato per mappare il potenziale d'azione (AP) e di calcio transitoria (CAT) contemporaneamente dallo stesso campo di vista di 10-13. Questo approccio ha migliorato la nostra comprensione del ruolo importante di calcio nel alternanza elettrica e l'induzione di aritmia 14-16.
Protocol
1. Preparazione
- Preparare appena Tyrodes fatto 'la soluzione (in mm, 128,2 NaCl, 1.3 CaCl 2, 4.7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, e 11.1 glucosio). Per velocizzare la preparazione quotidiana di soluzioni, preparare due soluzioni stock in anticipo e conservarli a +4 ° C frigorifero: (1) Azione i (in g/2L, 374,6 NaCl, CaCl 2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) e (2) Stock II (in g/2L, 84,01 NaHCO 3). Per rendere 2L di soluzione sufficiente per un esperimento prendere Tyrodes '1840mL di acqua deionizzata e mescolare in esso 80ml di Stock I, 80 ml di Stock II e 4g di glucosio.
- Preparare soluzioni di coloranti e uncouplers: (1) eccitazione-contrazione blebbistatin soluzione disaccoppiatore magazzino (Tocris Bioscience, soluzione 2mg/ml in DMSO), (2) voltaggio-sensibile colorante di-4-ANEPPS soluzione madre (Invitrogen, 1mg/mL soluzione in DMSO), (3) tensione sensibile colorante RH 237 soluzione madre (Invitrogen, soluzione 1.25mg/ml in DMSO), (4) Indicatore di calcio Rhod-2:00 soluzione madre (Invitrogen, soluzione 1mg/ml in DMSO). Un esperimento unico coniglio richiede circa 30 l di la di-4-ANEPPS soluzione madre, 30 microlitri della soluzione del RH237 stock, e 200 microlitri della Rhod-2:00 soluzione madre. Per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti, memorizziamo aliquote di 100 ml di di-4-ANEPPS a -20 ° C. Altri coloranti sono inoltre conservati a -20 ° C. Conservare il blebbistatin sciolto in frigorifero 4 ° C.
- Prima della raccolta del, cuore Tyrodes trasferimento 'soluzione nella bottiglia di 2L e posizionarlo in un bagno d'acqua (Fisher Scientific), che mantiene la temperatura della soluzione a 37 ° C. La soluzione è ossigenato con il 95% O 2 - 5% di CO 2. Il pH è mantenuto a 7,35 ± 0,05, regolando il livello di ossigenazione. La soluzione viene fatta circolare nel sistema di perfusione Langendorff ed è filtrata da un filtro a rete di nylon (diametro dei pori: 11μm, Millipore) posto nella linea di perfusione prima della cannula.
- Preparare apparecchiature di monitoraggio prima della raccolta del cuore. Un trasduttore di pressione (WPI) viene utilizzato per monitorare la pressione aortica durante l'esperimento. Linea di base del trasduttore di pressione viene regolata a zero mmHg quando il cuore non è collegato al sistema di perfusione. Pseudo-elettrodi ECG sono poste nella camera al piombo approssimativa I, II e III del triangolo di Einthoven ECG.
2. Raccolta e Perfusione di Cuori Coniglio
- Fissare il coniglio nel dispositivo di immobilizzazione coniglio. Euthanize il coniglio da una iniezione endovenosa di sodio pentobarbital (50 mg / kg) con 2000 U di eparina. Quando il coniglio è completamente eutanasia, che è determinata dalla mancanza di riflesso il dolore, la cavità toracica è aperto rapidamente e il cuore ed i polmoni sono escisse.
- Fare un taglio nella parte alta della aorta ascendente e prima di tutti i rami della aortico. Lavare l'aria dal aorta ascendente e poi rapidamente cannulate il cuore ad una 16-gauge cannula, che è stato precedentemente collegato a un cacciatore di bolla che è molto importante per mantenere l'aria fuori delle coronarie. Una volta che il cuore è retrogrado perfuso in un non-sistema di ricircolo perfusione Langendorff, fare un taglio per aprire il pericardio in fretta.
- Rimuovere il polmone, trachea, grasso e tessuti connettivi, mentre il sangue viene lavata dal perfusione.
- Molto importante! Un tubo in silicone (~ lunga tre centimetri, e 2mm di diametro) viene inserito attraverso una vena polmonare e la valvola mitrale nel ventricolo sinistro (LV) e tenuti lì per tutto l'esperimento. Questo tubo rilascia la soluzione che è intrappolato nel LV. Senza circolazione per ore durante la Langedorff-perfusione esperimento di un cuore meccanico immobilizzato, è probabile che a causare ischemia grave nella cavità ventricolare sinistra e per la produzione di aritmia.
- Spostare il cuore con la cannula al ricircolo Langendorff-perfusione sistema con l'apparato mappatura ottica.
3. Conducendo esperimenti con il sistema ottico panoramica Mapping
- Mettere il cuore in una misura da camera esagonale e collegare la cannula al sistema di perfusione. Mantenere la pressione aortica a 60 ± 5 mmHg, regolando la portata della pompa di perfusione. Monitor di piombo I pseudo-ECG. Mantenere il pH a circa 7,35 ± 0,05.
- Spegnere la luce della stanza, perché blebbistatin è photoinactivated entro la fine UV e bassa (450-490 nm) 17 per la parte visibile dello spettro. Iniettare lentamente la soluzione blebbistatin magazzino attraverso la porta di iniezione in aria a bolle cacciatore si trova sopra la cannula. Iniettare lentamente blebbistatin 0,1 ml per ogni bolo. Attendere che la pressione si stabilizzi prima dell'iniezione successiva.
- Posizionare delicatamente l'elettrodo stimolazione sul percorso specifico per il progetto sperimentale.
- Mettere a fuoco l'immagine del cuore in vetro smerigliato situato al piano dell'immagine di ogni fotodiodo array (PDA) da treequidistanti angoli che circonda il cuore. Regolare la posizione della cannula e le distanze tra ogni PDA e il cuore per adattarsi al cuore nel campo di vista di tutti e tre i PDA. Scatta una foto di ogni immagine focalizzata in vetro smerigliato.
- Iniettare lentamente 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS soluzione madre attraverso la porta di iniezione in aria-bolla trappola nella soluzione di perfusione. Attendere 1 ~ 3 minuti prima di effettuare registrazioni ottiche.
- Per la registrazione prima accendere la luce LED verde (nessun filtro di eccitazione, INONDAZIONI LED, LUMILEDS), prendi registrazioni ottiche contemporaneamente da tre PDA connessi con la misura sistema di acquisizione dati, 5 e spegnere la luce a LED. Controllare la qualità dei segnali provenienti da diversi pixel di tutti e tre i palmari. Aggiungere 0,1 ~ 0,2 ml di soluzione madre blebbistatin se artefatti da movimento nel potenziale di azione ottico si notano. Aggiungere un altro 5 microlitri di-4-ANEPPS soluzione madre se segnale-rumore è basso.
- Terminare il protocollo progettato sperimentale per lo studio funzionale. Re-macchia il cuore con l'aggiunta di 5μL-4-ANEPPS soluzione di riserva se il segnale si deteriora durante la sperimentazione a causa di photobleaching o washout.
- Accendere la luce della stanza dopo il completamento dello studio funzionale. Scatta foto del cuore da 36 angoli equidistanti. Ciò si ottiene ruotando il cuore a un passo di 10 ° con una fotocamera digitale fissa nella posizione di un PDA.
- Prendete il cuore dalla camera. Scolate tutte le soluzioni. Lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, alcol reagente al 70%, e di nuovo acqua deionizzata.
- L'analisi dei dati comprende la ricostruzione della geometria cuore dal 36 fotografie digitali, la registrazione del segnale ottico sulla superficie della geometria ricostruita, e la quantificazione della durata del potenziale d'azione (APD), la velocità di conduzione (CV), fase, ecc 6
4. Conducendo esperimenti con il sistema a doppia mappatura
- (Continua dopo parte 2) Mettere il cuore cannulata in una camera di vetro (Radnóti) e collegare la cannula al sistema di perfusione. Definire con precisione il cuore in fondo al silicio della camera ventricolare al vertice e atri.
- Spegnere la luce della stanza. Iniettare lentamente la soluzione blebbistatin magazzino (15 ~ 20 minuti per raggiungere 10μM) attraverso la porta di iniezione prima cannula perfusione per immobilizzare il cuore.
- Mettete un piatto di plastica Petri, o altri copertura vetrata, al di sopra della superficie epicardico per ridurre il movimento della superficie soluzione.
- Messa a fuoco due telecamere CMOS nel sistema di doppia mappatura (Ultima-L, SciMedia) presso lo stesso campo di vista. Fluorescenza emessa è separata da uno specchio dicroico (635nm cutoff, Omega Optical), e filtrata da un filtro longpass 700nm (Thorlabs) per i segnali di tensione e da un filtro passa-banda 590/30 nm (Omega Optical) per i segnali di calcio.
- Puntare le guide luce di due lampade alogene (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) verso il campo di mappatura al fine di raggiungere anche l'illuminazione. Filtri di eccitazione (nm 531/40, SemRock) sono utilizzati.
- Macchia il cuore con la tensione sensibile colorante RH 237 soluzione madre (10 ~ 30 mL) attraverso la porta di iniezione.
- Miscelare il Rhod-2:00 (0,2 ml) soluzione madre con Pluronic F-127 (Invitrogen, miscela 1:1). Ultrasuoni per 1 minuto in un bagnomaria ultrasuoni. Iniettare la miscela attraverso la porta del cacciatore bolla. Attendere circa 20 minuti per permettere la de-esterificazione degli Rhod-02:00 prima dell'inizio della mappatura.
- Per una registrazione, spegnere la pompa superfusione per evitare il movimento sulla superficie della soluzione; accendere la sorgente di luce di eccitazione (le lampade alogene), prendere registrazioni ottiche utilizzando entrambe le telecamere collegate al sistema di acquisizione dati (Ultima-L, SciMedia) ; spegnere la luce di eccitazione, e accendere la pompa superfusione. Controllare la qualità dei segnali ottici. Re-macchia il tessuto, se necessario.
- Termina il resto del protocollo progettato per uno studio sperimentale.
- Accendere la luce della stanza e fare una fotografia del cuore che contiene il campo visivo. Prendete il cuore dalla camera. Scolate tutte le soluzioni. Lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, alcol reagente al 70% (Fisher Scientific) e acqua deionizzata.
- L'analisi dei dati contiene misure di APD, CV, la durata di calcio transitoria (carta sta), il ritardo tra la salita AP e aumento CAT, il tempo di salita del calcio transitorio, e la costante di tempo di un adattamento monoesponenziale del decadimento CAT.
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Risultati rappresentante di una Langendorff-perfuso esperimento coniglio utilizzando il sistema di mappatura panoramica ottico. (A) La vista anteriore del cuore di coniglio e la ricostruzione della geometria cuore di coniglio in forma di un'immagine tridimensionale mesh-grid superficie. (B) Tscartò superficie epicardico codice colore dalla fase (ottenuti dall'analisi piano delle fasi 18) che indica il fronte d'onda in rosso durante un episodio di tachiaritmia. (C) L'ottica registrazioni del potenziale d'azione in cinque sedi in tutto il singolarità fase segnata da 1-5 in pannello B. (D) Otto istantanee di attivazione del fronte d'onda (colore rosso) propagazione durante un ciclo di un'aritmia stabile rientrante. I cerchi in senso orario attorno ad un fronte d'onda singolarità fase, che è visibile sulla superficie anteriore del cuore. Il colore di ripolarizzazione (blu) è impostato per essere parzialmente trasparente in modo che il fronte d'onda posteriore è visibile (ad esempio, a 80ms, 100ms e 120ms). Un film di questa aritmia rientro è previsto nel video supplementare 1. I metodi per la ricostruzione della geometria, la registrazione del segnale, il calcolo di mappa di fase, e l'apertura di superficie sono descritti in dettaglio altrove 6.
Figura 2. I risultati rappresentativi da una Langendorff-perfuso esperimento coniglio cuore utilizzando il sistema a doppia mappatura (mappatura simultanea di potenziale d'azione e calcio transitoria). (A) La superficie anteriore del cuore con il campo mappatura di vista coperta da puntini neri. (B) Una vista ravvicinata delle registrazioni da un sito. (C) le tracce del campione del potenziale d'azione (blu) e di calcio transitoria (rosso) da una serie di punti equidistanti segnato dai puntini neri nella nota pannello A. che non tutte le registrazioni dei pixel vengono mostrate e la risoluzione spaziale è 200μm.
Discussion
Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per il successo Langendorff-perfuso esperimento coniglio cardiaca comprendono soluzione ben preparati Tyrodes ', raccolta veloce del cuore, ben curato pressione di perfusione, e il pH della soluzione appropriata ossigenato nel sistema di perfusione. Al fine di registrare il segnale con il più alto possibile segnale-rumore, dobbiamo prendere in considerazione fattori come fonte di luce, filtri ottici, concentrandosi ottica, fotorivelatori, ecc 19. I dettagli di questi aspetti sono discussi altrove 19. Conigli giovani (età: 4-5 mesi, peso: 7-9 libbre) potrebbero essere utilizzati per evitare il grasso epicardico, che diminuisce il rapporto segnale-rumore dei segnali ottici.
Il segnale registrato da ogni pixel è un'integrazione ponderata della luce emessa da un volume di tessuto. La profondità di questo volume dei tessuti dipende dalla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione del colorante utilizzato. Per di-4-ANEPPS, ad esempio, la profondità di penetrazione stimato è 300μm nel cuore di coniglio 20. Così, l'interpretazione del segnale ottico dovrebbe essere fatto con cautela quando l'eterogeneità locali di funzioni elettriche sono presenti nel nodo seno-atriale, nodo atrio-ventricolare, e durante aritmia ventricolare 1,21,22.
Una limitazione della tecnica di mappatura ottica rispetto alla registrazione elettrodo è che la fase di ripolarizzazione del potenziale d'azione ottico è spesso distorta da artefatti da movimento causato dalla contrazione cardiaca. Vincolo meccanico potrebbe essere utilizzato per ridurre l'artefatto, ma non lo elimina completamente. In confronto, farmacologico eccitazione-contrazione uncouplers sono efficaci nel rimuovere il manufatto movimento. Tuttavia, questi uncouplers (ad esempio 2,3-Butanedione monoxime) potrebbe avere gravi effetti collaterali elettrofisiologico. Blebbistatin è stato dimostrato non avere effetti collaterali negativi sulla elettrofisiologia cardiaca nel cuore normale 23, ed è quindi un disaccoppiatore promettente per la mappatura ottica. Va notato che l'accelerazione di edema dovuto alla abolizione della contrazione potrebbe anche incidere sulla elettrofisiologia.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
NIH R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
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