Summary
Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).
Abstract
Imagens ópticas e sondas fluorescentes têm avançado significativamente metodologia de pesquisa no campo da eletrofisiologia cardíaca de uma forma que não poderia ter sido realizado por outras abordagens 1. Com a utilização dos corantes em cálcio e sensíveis à voltagem, mapeamento óptico permite a medição do potencial transmembrana de ação e transientes de cálcio com alta resolução espacial sem o contato físico com o tecido. Isso faz com que as medições da atividade elétrica cardíaca possível sob muitas condições onde o uso de eletrodos é inconveniente ou impossível 1. Por exemplo, as gravações ópticas fornecer informações precisas alterações morfológicas do potencial de membrana durante e imediatamente após a estimulação e desfibrilação, enquanto as técnicas convencionais de eletrodos sofrem de estímulo induzido artefatos durante e após estímulos, devido à polarização do eletrodo 1.
O coração de coelho Langendorff-perfundidos é um dos modelos mais estudados da fisiologia e fisiopatologia do coração humano. Muitos tipos de arritmias observadas clinicamente poderia ser recapitulada no modelo de coração de coelho. Foi mostrado que os padrões de ondas no coração de coelho durante arritmias ventriculares, determinado pelo tamanho efetivo do coração e do comprimento de onda de reentrada, são muito semelhantes aos que nos dois coração humano. Também foi mostrado que os aspectos críticos da excitação-contração (CE) no acoplamento de coelho miocárdio, tais como a contribuição relativa de retículo sarcoplasmático (SR), é muito semelhante ao acoplamento CE humanos 3. Apresentamos aqui os procedimentos básicos de experimentos de mapeamento óptico nos corações perfundidos Langendorff-coelho, incluindo a configuração do sistema de perfusão Langendorff, o mapeamento de instalação de sistemas ópticos, o isolamento e canulação do coração de perfusão, e corante coloração do coração, excitação-contração desacoplamento, recolha e de sinais ópticos. Estes métodos podem ser aplicados também para o coração de outras espécies de coelho com ajustes para taxas de fluxo, óptica, soluções, etc
Dois sistemas de mapeamento óptico são descritos. O sistema de mapeamento panorâmico é usado para mapear todo o epicárdio do coração de coelho 4-7. Este sistema proporciona uma visão global da evolução dos circuitos reentrantes durante arritmogênese e desfibrilação, e tem sido usado para estudar os mecanismos das arritmias e terapia antiarrhythmia 8,9. O sistema de mapeamento dupla é usada para mapear o potencial de ação (AP) e cálcio transiente (CAT) simultaneamente a partir do mesmo campo de visão 10-13. Esta abordagem tem melhorado nossa compreensão do importante papel do cálcio no alternância elétrica ea indução de arritmia 14-16.
Protocol
1. Preparação
- Prepare recém solução Tyrodes feito '(em mM, NaCl 128,2, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, e 11,1 glicose). Para agilizar a preparação diária de soluções, preparar duas soluções estoque com antecedência e estocá-los em 4 ° C frigorífico: (1) Stock I (em g/2L, 374,6 NaCl, CaCl 2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) e (2) Stock II (em g/2L, 84,01 NaHCO 3). Para fazer 2L de solução suficiente para tomar um experimento Tyrodes '1840mL de água deionizada e misture nele 80mL de Ações I, II 80mL de stock, e 4g de glicose.
- Preparar soluções estoque de tinturas e desacopladores: (1) excitação-contração desacoplador solução estoque blebbistatin (Tocris solução, Bioscience 2mg/ml em DMSO), (2) sensíveis à voltagem corante solução estoque di-4-ANEPPS (Invitrogen, 1mg/mL solução em DMSO), (3) sensíveis à voltagem corante RH solução estoque 237 (Invitrogen, solução 1.25mg/ml em DMSO); (4) Indicador de cálcio Rhod 02:00-solução-mãe (Invitrogen, 1mg/ml solução em DMSO). Uma experiência única de coelho necessita de aproximadamente 30 mL da solução de di-4-ANEPPS, 30 mL da solução-mãe RH237, e 200 mL da Rhod-2:00 solução estoque. Para evitar congelamento e descongelamento repetidos, nós armazenamos 100 mL de alíquotas di-4-ANEPPS a -20 ° C. Outros corantes também são armazenadas a -20 ° C. Armazenar os blebbistatin dissolvido em quatro geladeira C °.
- Antes da colheita do coração, a solução Tyrodes transferência "dentro da garrafa 2L e colocá-lo em banho-maria (Fisher Scientific), que mantém a temperatura da solução a 37 ° C. A solução é oxigenada com 95% O 2 - 5% CO 2. O pH é mantida em 7,35 ± 0,05, ajustando o nível de oxigenação. A solução é distribuída no sistema de perfusão Langendorff e é filtrada por um filtro de nylon líquido (tamanho dos poros: 11μm, Millipore) colocado na linha de perfusão antes da cânula.
- Prepare o equipamento de vigilância, antes da colheita do coração. Um transdutor de pressão (WPI) é usado para monitorar a pressão aórtica durante o experimento. Linha de base do transdutor de pressão é ajustado para zero mmHg quando o coração não está conectado ao sistema de perfusão. Pseudo-ECG eletrodos são colocados na câmara de chumbo aproximada I, II, e III do triângulo de Einthoven ECG.
2. Colheita e de perfusão de corações de coelho
- Corrigir o coelho no limitador de coelho. Euthanize o coelho por uma injeção intravenosa de pentobarbital sódico (50 mg / kg) de heparina U com 2000. Quando o coelho é completamente eutanásia, que é determinada pela falta de reflexo de dor, a cavidade torácica é rapidamente aberta eo coração e os pulmões são excisadas.
- Faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes de todos os ramos do arco aórtico. Expulsar o ar da aorta ascendente e então rapidamente canular o coração a uma cânula de calibre 16, que foi previamente ligado a um caçador bolha que é muito importante para manter o ar para fora de coronárias. Uma vez que o coração é perfundido retrogradamente em um sistema de perfusão não-recirculação Langendorff, faça um corte para abrir o pericárdio rapidamente.
- Remover o pulmão, traquéia, gordura e tecido conjuntivo, enquanto o sangue é lavado pela perfusão.
- Muito importante! Um tubo de silicone (~ 3cm de comprimento e 2mm de diâmetro) é inserido através de uma veia pulmonar e valva mitral para o ventrículo esquerdo (LV) e mantido lá durante todo o experimento. Este tubo libera a solução que está preso no LV. Sem circulação por horas durante o experimento Langedorff-perfusão em um coração mecânico imobilizada, é susceptível de causar isquemia severa na cavidade do VE e produzir arritmia.
- Mover o coração com a cânula para a recirculação do sistema Langendorff-perfusão com o aparelho de mapeamento óptico.
3. Realização de experimentos usando o Sistema de Mapeamento Panorâmica Optical
- Coloque o coração em uma câmara de hexágono feito por encomenda e se conectar a cânula para o sistema de perfusão. Manter a pressão aórtica em 60 ± 5 mmHg, ajustando a vazão da bomba de perfusão. Monitor de derivação I pseudo-ECG. Manter o pH em torno de 7,35 ± 0,05.
- Desligue a luz da sala, porque é blebbistatin photoinactivated até o final UV e baixo (450-490 nm) 17 da parte visível do espectro. Injecte lentamente solução estoque blebbistatin através da porta de injeção no caçador bolha de ar localizado acima da cânula. Injecte lentamente blebbistatin 0,1 ml para cada injeção de bolus. Aguarde a pressão para estabilizar antes da próxima injeção.
- Delicadamente, coloque o eletrodo de estimulação para o local específico para seu projeto experimental.
- Focalizar a imagem do coração no vidro fosco localizadas no plano da imagem de cada matriz foto-diodo (PDA) a partir de trêsespaçados ângulos que envolve o coração. Ajustar a posição da cânula e as distâncias entre cada PDA eo coração a fim de encaixar o coração no campo de visão de todos os três PDAs. Tire uma foto de cada imagem focada no vidro fosco.
- Injecte lentamente 10 ~ 20μL de solução stock di-4-ANEPPS através da porta de injeção na armadilha bolha de ar na solução de perfusão. Esperar 1 a 3 minutos antes de tomar gravações ópticas.
- Para a primeira gravação, ligar a luz LED verde (sem filtro de excitação, FLOOD LED, LUMILEDS), tome gravações ópticas simultaneamente de três PDAs conectados com o sistema de aquisição de dados feito por encomenda, 5 e desligar a luz LED. Verificar a qualidade dos sinais de pixels diferente de todos os três PDAs. Adicionar 0,1 ~ 0,2 mL de solução stock blebbistatin se artefatos de movimento no potencial de ação ópticos são notados. Adicionar mais 5 mL de solução stock di-4-ANEPPS se o sinal-ruído é baixa.
- Terminar o protocolo projetado experimental para o estudo funcional. Re-manchar o coração com adicional solução estoque 5μL di-4-ANEPPS se o sinal se deteriora durante os experimentos, devido à fotodegradação ou washout.
- Ligue a luz da sala após a conclusão do estudo funcional. Tirar fotos do coração de 36 ângulos igualmente espaçados. Isto é conseguido através da rotação do coração em uma etapa de 10 ° com uma câmera digital fixa no local de um PDA.
- Leve o coração para fora da câmara. Drenar todas as soluções. Lavar o sistema de perfusão na seqüência de DI água, álcool reagente 70%, e novamente de água DI.
- A análise dos dados inclui a reconstrução da geometria do coração a partir de 36 fotografias digitais, o registro do sinal óptico sobre a superfície da geometria reconstruído, e quantificação da duração do potencial de acção (APD), velocidade de condução (CV), fase, etc 6
4. Realização de experimentos usando o Sistema de Mapeamento de dupla
- (Continue após a parte 2) Coloque o coração canulados em uma câmara de vidro (Radnoti) e se conectar a cânula para o sistema de perfusão. Fechar o coração para o fundo da câmara de silício no ápice ventricular e átrios.
- Desligar a luz do quarto. Injecte lentamente solução estoque blebbistatin (15 ~ 20 min para chegar 10μM), através da porta de injeção antes da cânula de perfusão para imobilizar o coração.
- Colocar uma placa de Petri de plástico, ou cobrir outra janela de vidro, acima da superfície epicárdica para reduzir o movimento da superfície da solução.
- Foco duas câmeras CMOS no sistema de mapeamento dual (Ultima-L, SciMedia) no mesmo campo de visão. Fluorescência emitida é separado por um espelho dicróico (635nm de corte, Omega Optical), e filtrado por um filtro de 700nm longpass (Thorlabs) para sinais de tensão e por um filtro passa-banda 590 / 30 nm (Omega Optical) para sinais de cálcio.
- Aponte a guias de luz de duas lâmpadas de halogênio (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) para o mapeamento de campo de vista para conseguir uma iluminação uniforme. Filtros de excitação (nm 531/40, SemRock) são utilizados.
- Manchar o coração com o RH corante sensíveis à voltagem solução estoque 237 (10 ~ 30 mL) através da porta de injeção.
- Misture o Rhod-2:00 (0,2 mL) solução estoque com PLURONIC F-127 (Invitrogen, 1:1 mistura). Sonicate por 1min em um sonicador banho-maria. Injetar a mistura através da porta do caçador bolha. Aguarde cerca de 20 minutos para permitir que a de-esterificação do Rhod-2:00 antes do início do mapeamento.
- Para uma gravação, desligar a bomba superfusão para evitar o movimento na superfície da solução; ligar a fonte de luz de excitação (as lâmpadas halógenas); tomar gravações ópticas usando ambas as câmeras conectadas ao sistema de aquisição de dados (Ultima-L, SciMedia) ; desligar a luz de excitação, e ligue a bomba superfusão. Verificar a qualidade dos sinais ópticos. Re-mancha o tecido, se necessário.
- Terminar o resto do protocolo projetado para um estudo experimental.
- Ligue a luz da sala e tirar uma fotografia do coração que contém o campo de visão. Leve o coração para fora da câmara. Drenar todas as soluções. Lavar o sistema de perfusão na seqüência de DI água, álcool reagente 70% (Fisher Scientific) e água DI.
- Análise de dados contém as medidas de APD, CV, duração de cálcio transiente (CaTD), o atraso entre a AP movimento ascendente e aumento do gato, o tempo de subida do cálcio transiente, ea constante de tempo de um ajuste monoexponencial da decadência do CAT.
Resultados representativos:
Figura 1. Representante resultados de um experimento de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de mapeamento panorâmico óptica. (A) A visão anterior do coração do coelho e da geometria do coração reconstruído coelho na forma de uma imagem tridimensional da superfície de malha de grade. (B) Tele abriu superfície epicárdica de cores por fase (obtidos a partir do plano de análise de fase 18), indicando a frente de onda mostrada em vermelho durante um episódio de taquiarritmia. (C) As gravações ação óptica potencial de cinco posições em torno da singularidade fase marcada por 1-5 no painel B. (D) Oito instantâneos de frente de onda de ativação (cor vermelha) durante um ciclo de propagação de uma arritmia reentrante estável. Os círculos de frente de onda no sentido horário em torno de uma singularidade de fase, que é visível na superfície anterior do coração. A cor de repolarização (azul) está definido para ser parcialmente transparente para que a frente de onda posterior é visível (por exemplo, em 80ms, 100ms, 120ms e). Um filme desta arritmia reentrante é fornecido no vídeo suplementar 1. Os métodos para a reconstrução da geometria, o registro do sinal, o cálculo do mapa de fase, ea revelação de superfície são descritas em detalhes em outros lugares 6.
Figura 2. Representante resultados de um experimento coração Langendorff-perfundido de coelho usando o sistema de mapeamento dual (mapeamento do potencial de ação simultânea de cálcio e transitória). (A) A superfície anterior do coração com o campo de mapeamento de vista coberta por pontos pretos. (B) Uma visão de close-up das gravações de um site. (C) traça amostra do potencial de ação (azul) e de cálcio transiente (vermelho) de uma série de pontos espaçados marcada por pontos pretos no painel A. Note que nem todas as gravações de pixels são mostrados ea resolução espacial é 200μm.
Discussion
Com base em nossa experiência, as chaves para o sucesso do experimento coração Langendorff-perfundido de coelho incluem solução bem preparado Tyrodes ', a colheita rápida do coração, bem mantida a pressão de perfusão e pH adequado da solução oxigenada no sistema de perfusão. , A fim de gravar o sinal com maior relação sinal-ruído possível, é preciso considerar fatores como fonte de luz, filtros ópticos, com foco óptica, fotodetectores, etc 19. Detalhes sobre estes aspectos são discutidos em outros 19. Coelhos jovens (faixa etária: 4-5 meses, peso de 7-9 libras) poderia ser usado para evitar a gordura epicárdica, que diminui a relação sinal-ruído dos sinais ópticos.
O sinal gravado por cada pixel é uma integração ponderada de luz emitida a partir de um volume de tecido. A profundidade deste volume de tecido depende do comprimento de onda de excitação e emissão do corante utilizado. Para di-4-ANEPPS, como exemplo, a profundidade de penetração estimada é de 300μm, no coração de coelho 20. Assim, a interpretação do sinal óptico deve ser feita com cautela quando a heterogeneidade local da função elétrica estão presentes no nó sinusal, nó atrioventricular, e durante arritmia ventricular 1,21,22.
Uma limitação da técnica de mapeamento óptico em comparação com a gravação do eletrodo é que a fase de repolarização do potencial de ação é muitas vezes distorcida ótica de artefato de movimento causado pela contração cardíaca. Restrição mecânica pode ser usado para reduzir o artefato, mas não pode eliminá-lo completamente. Em comparação, farmacológicos excitação-contração desacopladores são eficazes na remoção do artefato de movimento. No entanto, estes desacopladores (por exemplo, 2,3-Monoxime Butanedione) poderia ter efeitos significativos no lado eletrofisiológico. Blebbistatin, foi demonstrado que não têm efeitos colaterais adversos sobre a eletrofisiologia cardíaca no coração normal 23, e é, portanto, um desacoplador promissoras para o mapeamento óptico. Deve-se notar que a aceleração de edema devido à abolição da contração também pode afetar a eletrofisiologia.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
NIH concede R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
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