Summary
이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.
Abstract
광학 이미징 및 형광 프로브는 다른 접근법 1 성취되지 않았을 수도 방법으로 심장 전기 생리학 분야에서 상당히 고급 연구 방법론 있습니다. 칼슘 및 전압에 민감한 염료를 사용하여, 광학 매핑은 조직과 물리적 접촉없이 높은 공간 해상도를 가진 transmembrane 액션 잠재력과 칼슘 과도 측정 수 있습니다. 이것은 전극의 사용이 불편 또는 1 불가능합니다 많은 조건에서 심장 전기 활동을 측정 할 수 있습니다. 종래의 전극 기술은 전극 분극 1 인한 자극하는 동안 및 이후 자극 유발 유물에서 고통 중에 예를 들어, 광학 녹음은 자극과 defibrillation 동안과 직후 막 잠재력을 정확하게 형태학의 변경 사항을 제공합니다.
Langendorff - perfused 토끼 심장은 인간의 심장 생리학과 pathophysiology의 가장 연구 모델 중 하나입니다. 임상 관찰 arrhythmias의 많은 종류의 토끼 심장 모델 recapitulated 수 있습니다. 이것은 마음과 재입국의 파장의 효율적인 크기에 의해 결정 심실 arrhythmias 동안 토끼 심장에 웨이브 패턴이, 사람의 마음 2에서 매우 유사 표시되었다. 그것은 또한 sarcoplasmic reticulum (SR)의 상대적인 기여로, 토끼 myocardium의 결합 여기 - 수축의 중요한 측면 (EC)는 인간 EC 커플링 3 매우 유사 것으로 나타났습되었다. 여기 Langendorff 재관류 시스템 설정, 광학 매핑 시스템 설치, 심장, 재관류 및 심장, 여기 - 수축의 염료 염색법의 고립과 cannulation 포함한 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험의 기본 절차를 제시 uncoupling, 광학 신호를 수집. 이러한 방법은 또한 유량 조정, 광학, 솔루션 등 토끼가 아닌 다른 종의 심장에 적용 될 수
두 광학 매핑 시스템이 설명되어 있습니다. 파노라마 매핑 시스템은 4-7 토끼 심장의 전체 epicardium를 매핑하는 데 사용됩니다. 이 시스템은 arrhythmogenesis 및 defibrillation 중에 들어가는 회로의 진화 글로벌 전망을 제공하고 arrhythmias 및 antiarrhythmia 치료 8,9의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 이중 매핑 시스템을 볼 수 10-13의 동일한 분야에서 동시에 (CAT) 과도 작업 잠재력 (AP)와 칼슘을지도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 전기 alternans 및 부정맥 14-16의 유도에 칼슘의 중요한 역할에 대한 우리의 이해를 강화하고 있습니다.
Protocol
1. 준비
- 갓 만든 Tyrodes '솔루션을 (㎜, 128.2 NaCl, 1.3 CaCl 2, 4.7 KCl, 1.19 아니 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 20.0 NaHCO 3, 11.1 포도당)을 준비합니다. 솔루션의 매일 준비를 신속히하기 위해 사전에 두 재고 솔루션을 준비하고 4에 그들을 저장할 ° C 냉장고 : (1) 주식 I (g/2L에서 374.6 NaCl, 9.56 CaCl 2, 17.52 KCl, 8.21 아니 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) 및 (2) 주식 II (g/2L에서 84.01 NaHCO 3). 한 실험이 걸릴 충분한 Tyrodes '솔루션의 2L하려면 주식 I, II의 주식 80mL, 그리고 포도당의 4g의 80mL 거기에 탈이온수 및 믹스의 1840mL.
- 염료 및 uncouplers의 재고 솔루션을 준비 (1) 여기 - 수축 uncoupler의 blebbistatin 주식 솔루션 (DMSO에 Tocris Bioscience, 2mg/mL 솔루션), (2) 전압에 민감한 염료 DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 (Invitrogen, 1mg/mL DMSO의 용액) (3) 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1.25mg/ml 솔루션) (4) 칼슘 표시기로드 - 오전 2시 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1mg/ml 솔루션). 한 토끼 실험은 디 - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 RH237 재고 솔루션을 30 μL 및로드 - 오전 2시 재고 솔루션을 200 μL의 약 30 μL가 필요합니다. 반복 동결 융해를 방지하기 위해, 우리는 -20 ° C.에 DI - 4 - ANEPPS 100 μL aliquots 저장 다른 염료는 -20 ° C.에 저장됩니다 4 ° C 냉장고에 녹아 blebbistatin를 저장합니다.
- 이전 2L 병에 심장, 전송 Tyrodes '솔루션을 수확하고 37 솔루션 온도를 유지 물을 욕조 (피셔 과학) ° C.에 그것을 장소 5% CO 2 - 솔루션 95% O 2 산소입니다. 산도는 7.35에서 관리하고 있습니다 ± 0.05을 산소 수준을 조정하여. 솔루션은 Langendorff 재관류 시스템의 순환이며 나일론 그물 필터 (기공 크기 : 11μm, Millipore)에 의해 필터링되는 정맥 전에 재관류 라인에 배치.
- 마음을 수확하기 전에 모니터링 장비를 준비합니다. 압력 변환기 (WPI)은 실험 동안 대동맥 압력을 모니터링하는 데 사용됩니다. 압력 변환기의 기준은 심장이 재관류 시스템으로 연결하지 않을 때 mmHg를 제로로 조정됩니다. 의사 - ECG 전극은 대략 리드 I, II, 및 Einthoven 삼각형 ECG의 III에 챔버에 배치됩니다.
2. 토끼 하트의 수확 및 재관류
- 토끼 restrainer의 토끼를 수정. 나트륨 pentobarbital (50 MG / ㎏) 2000 U의 헤파린의 정맥 주사하여 토끼를 안락사. 토끼 고통 반사의 부족에 의해 결정되는, 완전히 euthanized되면 흉강은 빠르게 개방되고 심장과 폐가 excised 수 있습니다.
- 대동맥 아치의 모든 지점 전에 대동맥을 오름차순의 위쪽 끝에 상처를 확인합니다. 오름차순 대동맥에서 공기를 제거하고 신속하게 이전 coronaries의 공기를 밖으로 유지하는 것이 매우 중요합니다 버블 사냥꾼에 첨부되어 16 게이지 정맥에 마음을 cannulate. 심장이 retrogradely 아닌 순환 Langendorff 재관류 시스템에 perfused되면 상처가 빠르게 심장막를 엽니다합니다.
- 혈액이 재관류에 의해 플러시하는 동안, 폐, 기관, 지방과 결합 조직을 제거합니다.
- 매우 중요하다! 실리콘 튜브는 (직경 3cm ~ 긴, 그리고 2mm) 좌심실 (LV)에 폐동맥 정맥과 승모판을 통해 삽입하여 실험을하는 동안 거기에 보관됩니다. 이 튜브는 LV에 갇혀있는 솔루션을 출시. 기계식 고정 마음에 Langedorff - 재관류 실험 기간 동안 시간 동안 순환이 없다면, 그것은 LV에 고인 심각한 국소 빈혈을 일으킬하고 부정맥을 생산 가능성이 높습니다.
- 광학 매핑 장치로 재순환 Langendorff - 재관류 시스템에 정맥으로 마음을 이동합니다.
3. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시
- 사용자 정의 - 만든 육각 챔버에 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 재관류 펌프의 유량을 조정하여 60 대동맥 압력 ± 5 mmHg를 유지합니다. 나는 의사 - ECG를 이끌어 모니터링합니다. 주변에 산도 7.35 ± 0.05를 유지합니다.
- blebbistatin는 스펙트럼의 보이는 부분의 자외선과 낮은 엔드 (450-490 nm의) 17에 의해 photoinactivated 때문에 방의 조명을 해제합니다. 천천히 정맥 위에있는 공기 거품 사냥꾼의 사출 포트를 통해 blebbistatin 재고 솔루션을 주입. 천천히 모든 bolus 주입에 대한 0.1ml blebbistatin를 삽입. 다음 주사하기 전에 안정화에 압력을 기다립니다.
- 너의 기치를 실험 디자인에 특정 위치에 서성 거려 전극을 배치.
- 거미의 각 사진 - 다이오드 배열의 이미지 비행기 (PDA)에있는 프로스트 유리의 중심부의 이미지를 초점골고루 마음을 주변 각도 간격. 세 PDA의 뷰 필드의 중심부에 맞게하기 위해 정맥 각 PDA와 심장 사이의 거리의 위치를 조정합니다. 프로스트 유리의 각 초점을 맞춘 이미지의 사진을 가져가라.
- 천천히 10을 삽입 ~ 재관류 솔루션에 공기 거품 트랩에 주입 포트를 통해 20μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션입니다. 광학 녹음을 복용하기 전에 1 ~ 3 분 동안 기다리십시오.
- 첫 녹화, 녹색 LED 조명 (NO 여기 필터, LED 홍수, LUMILEDS)에 설정 사용자 정의 - 만든 데이터 수집 시스템과 관련된 세 PDA를 5에서 동시에 광학 녹음을하고 LED 조명을 끄십시오. 세 PDA의 다른 픽셀에서 신호의 품질을 확인합니다. 광학 작업 잠재력에 모션 아티팩트가 주목하는 경우 0.1 ~ 0.2mL blebbistatin 주식 솔루션을 추가합니다. 신호 대 잡음 비율이 낮으면 앞으로 5 μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션을 추가합니다.
- 기능 연구에 대한 설계 실험 프로토콜을 마침. 신호가 photobleaching 또는 유실로 인해 실험 기간 동안 일이요 경우 추가 5μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션으로 마음을 다시 얼룩.
- 기능 연구의 완료 후 객실 라이트를 켭니다. 36 균등하게 게재 각도에서 마음의 사진을 가져가라. 이것은 하나 PDA의 위치에 고정 디지털 카메라와 10 °의 단계에서 마음을 회전하여 이루어진다.
- 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올, 다시 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오.
- 데이터 분석 36 디지털 사진, 복원된 도형의 표면에 광학 신호의 등록 및 행동 잠재력 기간 (APD)의 부량, 전도 속도 (CV), 위상 등 6 심장 기하학의 재건을 포함
4. 듀얼 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시
- (2 부 이후 계속)는 유리 챔버 (Radnoti)의 cannulated 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 심실과 심방 꼭대기에있는 챔버의 실리콘 하단에 마음을 아래로 핀.
- 방 조명을 해제합니다. 천천히 마음을 고정하기 위해 재관류의 정맥하기 전에 사출 포트를 통해 (10μM에 도달하는 15 ~ 20 분) blebbistatin 재고 솔루션을 주입.
- 솔루션 표면의 움직임을 줄이기 위해 epicardial 표면 위에 플라스틱 페트리 접시, 또는 다른 유리 창문 커버를 넣어.
- 보기의 동일한 필드에 매핑 듀얼 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에서 두 CMOS 카메라를 중점을두고 있습니다. 형광 방출은 이색성 거울 (635nm 컷오프, 오메가 광학)로 구분하고, 전압 신호 700nm longpass 필터 (Thorlabs)와 칼슘 신호 30분의 590 nm의 대역 통과 필터 (오메가 광학)에 의해 필터링됩니다.
- 심지어 조명을 달성하기 위해보기의 필드 매핑을 향해, 2 할로겐 램프 (SciMedia, 코스타 메사, CA 뉴 포트 출창 인 스트 루먼트, 스트 랫 포드, CT)의 빛을 가이드를 목표로하고 있습니다. 여기 필터 (40분의 531 NM, SemRock)이 사용됩니다.
- 사출 포트를 통해 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (10 ~ 30 μL)로 마음을 얼룩.
- Pluronic F - 127과 함께로드 - 오전 2시 (0.2mL) 재고 솔루션 (Invitrogen, 1시 1분 혼합)를 섞는다. 물 목욕 sonicator에서 1min에 대한 Sonicate. 거품 사냥꾼의 포트를 통해 혼합물을 주입. 로드 - 2의 드 에스테르화이 매핑 시작하기 전에 오전 수 있도록 약 20 분간 기다리십시오.
- 한 기록은 솔루션의 표면에서 움직임을 피하기 위해 superfusion 펌프를 해제하고, 여기 광원 (할로겐 램프)를 설정하고, 데이터 수집 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에 연결된 두 카메라를 사용하여 광학 녹음을 ; 여기 조명을 해제 및 superfusion 펌프를 켭니다. 광 신호의 품질을 확인합니다. 조직 필요한 경우를 다시 얼룩.
- 연구 설계 실험 프로토콜의 나머지 부분을 완성.
- 객실 불 켜고 볼 분야를 포함하는 심장의 사진 가져가라. 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올 (피셔 과학) 및 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오.
- 데이터 분석 APD, CV, 칼슘 과도 기간 (CaTD), AP의 상승 운동 고양이의 상승, 과도 칼슘의 상승 시간 및 고양이 부패의 monoexponential 맞지의 지속 시간 사이의 지연 측정을 포함하고 있습니다.
대표 결과 :
그림 1. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 실험의 대표 발생합니다. 3 차원 메쉬 - 격자 표면의 형태로 토끼 심장과 복원 토끼 심장 기하학의 (A) 앞쪽에 볼 수 있습니다. (B) T그는 epicardial 표면을 풀어 색상 코드 tachyarrhythmia의 에피소드 중에 빨간색으로 표시된 파면을 나타내는 위상 (위상 비행기 분석 18 획득)에 의해. (C) 안정 들어가는 부정맥의 사이클 동안 활성화 파면 (붉은 색) 전파 패널 B. (D) 여덟 스냅샷에서 1-5로 표시된 위상 특이점 주변 5 개 지역에서 광 실천 가능성 레코딩. 파면 서클은 심장의 앞쪽에 표면에서 볼 수있는 위상 특이점 주위를 시계 방향으로. repolarization의 색상 (파란색)은 사후 파면 (예, 80ms, 100ms, 120ms에서하고) 볼 수 있도록 부분적으로 투명하게 설정됩니다. 이 들어가는 부정맥의 영화는 보충 비디오 1로 제공됩니다. 지오메 트리 재건, 신호 등록, 위상지도의 계산, 그리고 표면 unwrapping위한 방법은 다른 여섯 자세히 설명되어 있습니다.
그림 2. 이중 매핑 시스템 (일시 액션 잠재력과 칼슘을 동시에 매핑)을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 심장 실험에서 대표 발생합니다. 검은 점들의 적용을보기의 매핑 필드와 함께 마음의 (A) 앞쪽에 표면. 하나의 사이트에서 레코딩 (B) 클로즈업 볼 수 있습니다. (C) 샘플 작업 가능성의 흔적 (파란색)과 칼슘 모든 픽셀 녹음이 표시 및 공간적 해상도가 200μm있다는 것을 패널 A. 참고에 검은 점들로 표시 균등하게 게재 위치의 배열에서 (적색) 과도.
Discussion
경험을 바탕으로 성공적인 Langendorff - perfused 토끼 심장의 실험을위한 열쇠는 잘 준비 Tyrodes '솔루션의 중심 빠른 수확, 잘 유지 재관류의 압력과 재관류 시스템에서 산소 솔루션의 적절한 산도를 포함합니다. 최고의 신호 대 잡음 비율로 신호를 기록하기 위해, 우리는 광원, 광학 필터, 광학을 집중, photodetectors 등 19를 포함한 요소를 고려해야합니다. 이러한 측면의 세부 사항은 다른 19 설명합니다. 젊은 토끼는 (연령 : 4-5개월, 중량 : 7-9파운드) 광 신호의 잡음 비율로 신호를 감소 epicardial 지방을 방지하는 데 사용할 수 있습니다.
각 픽셀에 의해 기록된 신호는 조직의 볼륨에서 방출되는 빛의 가중치 통합이다. 이 조직 량의 깊이에 사용되는 염료의 여기 및 발광 파장에 따라 달라집니다. DI - 4 - ANEPPS 들어, 예를 들어, 예상 침투 깊이는 토끼 심장 20 300μm이다. 따라서 광 신호의 해석은 전기 함수의 지역 이질이 sinoatrial 노드 방실 노드에 존재하는 경우주의 완료하고, 심실 부정맥 1,21,22 동안해야합니다.
전극 기록에 비해 광학 매핑 기법 중 하나 제한 광학 행동 잠재력의 repolarization 단계가 종종 심장 수축에 의한 움직임의 유물에 의해 distored 때문입니다. 기계 제약은 유물을 줄이기 위해 사용될 수 있지만, 완전히 제거 수 없습니다. 비교에서, 약리 여기 - 수축 uncouplers는 모션 유물을 제거에 효과적입니다. 그러나 이러한 uncouplers (예 : 2,3 - Butanedione Monoxime) 상당한 electrophysiological 부작용이 없습니다. Blebbistatin은 정상적인 심장 23 심장 전기 생리학에 아무런 부정적인 부작용이 없다하는 시연하고, 따라서 광학 매핑을위한 유망한 uncoupler가되었습니다. 그것은 수축의 폐지로 인한 부종의 가속 또한 전기 생리학에 영향을 미칠 수 있다고 지적한다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NIH R01 보조금 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
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