Summary
Grote diermodellen hebben een goede translationele waarden in het onderzoek van de fysiologie en farmacologie van neonatale asfyxie. Met behulp van pasgeboren biggen, ontwikkelen we een experimenteel protocol neonatale asfyxie welke voordelen van het bestuderen van de systemische en regionale hemodynamiek, zuurstof transport met biochemische en pathologische paden en correlaties heeft te simuleren.
Abstract
Jaarlijks meer dan 1 miljoen pasgeborenen sterven wereldwijd met betrekking tot verstikking. Gestikt pasgeborenen hebben gewoonlijk multi-orgaanfalen waaronder hypotensie, perfusie tekort, hypoxische-ischemische encefalopathie, pulmonale hypertensie, vasculopathic enterocolitis, nierfalen en trombo-embolische complicaties. Animal modellen worden ontwikkeld om ons te helpen begrijpen van de patho-fysiologie en farmacologie van neonatale asfyxie. In vergelijking met knaagdieren en pasgeboren lammeren, is de pasgeboren big bewezen een waardevol model te zijn. De pasgeboren biggen heeft een aantal voordelen, waaronder soortgelijke ontwikkeling als die van 36-38 weken menselijke foetus met vergelijkbare systemen in het lichaam, grote lichaamsgrootte (~ 1,5-2 kg bij de geboorte) dat de instrumentatie en monitoring van het dier laat en regelt de verstorende variabelen van hypoxie en hemodynamische stoornissen.
We beschrijven hier een experimenteel protocol om neonatale asfyxie simuleren en ons naar de syste onderzoeken latenmicrofoon en regionale hemodynamische veranderingen tijdens de verstikkende en reoxygenatie proces evenals de respectieve effecten van interventies. Verder heeft het model het voordeel van het bestuderen multi-orgaanfalen of dysfunctie tegelijkertijd de interactie met verschillende lichaamssystemen. De experimentele model is een niet-survival procedure die de chirurgische instrumenten van pasgeboren biggen (1-3 dagen oud en 1.5-2.5 kg gewicht Kruising) omvat om de instelling van mechanische ventilatie, vasculaire (arteriële en veneuze) toegang en het plaatsen van catheters en stroom probes (Transonic Inc) voor de continue bewaking van intra-vasculaire druk en bloedstroom in verschillende bloedvaten, voornaamste pulmonale, halsslagader mesenterica superior en linker renale slagaders. Met behulp van deze operatief geïnstrumenteerd biggen, na stabilisatie gedurende 30-60 minuten in de zin van Z <10% variatie in de hemodynamische parameters en normale bloedgassen, we beginnen een experimenteel protocolvan ernstige hypoxemie die wordt geïnduceerd via normocapnic alveolaire hypoxie. De biggen wordt geventileerd met 10-15% zuurstof door verhoging van de ingeademde concentratie van stikstofgas gedurende 2 uur, streven naar arteriële zuurstofverzadigingen van 30-40%. Deze mate van hypoxemie zal produceren klinische verstikking met een ernstige metabole acidose, systemische hypotensie en cardiogene shock met hypoperfusie naar vitale organen. De hypoxie wordt gevolgd door reoxygenatie met 100% zuurstof gedurende 0,5 uur en vervolgens 21% zuurstof 3.5h. Farmacologische interventies kan worden ingevoerd te zijner tijd en hun effecten onderzocht in een geblindeerde, blok-gerandomiseerde wijze.
Protocol
1. Anesthesie
- Stel het debiet van de verdoving machine 2L/min. Sluit de uitlaat om afzuiging.
- Charge masker met narcosegas (isofluraan) bij 5% (~ 3 min).
- Biggen wordt opgewekt met geïnhaleerde Isoflurane 5% in 100% zuurstof (~ 3 min).
- Handhaaf anesthesie bij 2-3% van isofluraan. Fijnafstelling van Isoflurane met 0,5% echter wenselijk kan variëren van 0,5 tot 5% afhankelijk van de toestand van biggen.
- Zodra de vasculaire toegang ingesteld, kan de inhalatie-anesthesie worden geschakeld intraveneuze anesthesie met fentanyl (5-50 mcg / kg / h) en midazolam (200-500 mcg / kg / h) infusies. Pancuronium (50-100 mcg / kg / h) vereist om buitensporige spierbewegingen controle tijdens de operatie, terwijl het vermogen dier toestand houden blijft voor de aanpassing van de medicatie verdoving.
- De big wordt gecontroleerd door pulsoximetrie (percutane zuurstof enaturation op 95-100%) en ECG (hartslag aan 130 tot 170 slagen / min).
- De biggen rectale temperatuur op 38-40 ° C met verwarmingsdeken en stralingsverwarmer.
- De verdoving toestand van biggen wordt regelmatig geëvalueerd gedurende de experimentele periode met behulp van neurologische (pupilgrootte, tranen, lichaamsbewegingen), gedragsmatige (agitatie), cardiovasculaire (tachycardie en hypertensie) en respiratoire (tachypnoe) parameters naargelang het geval. Minimale verlamming wordt gegeven. Eerdere ervaring van anesthesie in biggen met en zonder verlamming zou nuttig voor evaluatie.
- Het protocol is een niet-survival procedure euthanization van het dier aan het einde van het experiment met een overdosis pentobarbital (100 mg / kg) intraveneus.
2. Operatief plaatsen van vasculaire catheters bij de lies (figuur 1)
- Maak een lange 2-3cm incisie in de rechter lies.
- Prepareer 1cm van de rechter femorale veneuze en 1cm right dijslagader. Leg twee 3-0 strings in elk vaartuig.
- Rechter femorale veneuze catheterisatie: Ligeren van het distaal van de ader. Plaats een Argyle katheter (3,5 of 5 Frans, dubbel-lumen) (Covidien, Mansfield, MA) tot 15cm en dit zal plaatsen op het rechter atrium. Bind beide strings aan de katheter vast te zetten. De katheter kan gebruikt worden voor onderhoud vloeistof en medicatie infusie (nevenpoort) en centraal veneuze / rechter atrium drukmeting (primaire poort).
- Recht femorale arteriële katheterisatie: Ligeren van het distaal van de slagader. Til de proximale string om de bloedstroom te stoppen. Plaats een Argyle katheter (3,5 of 5 Franse, single-lumen) tot 5 cm. Dit plaatst de arteriële katheter in de infra-renale aorta voor continue gemiddelde arteriële drukmeting en bloedafname. Bind beide strings aan de katheter vast te zetten.
- Sluit de huid.
3. Bepaal mechanische ventilatie (figuur 2)
- Maak een lange 2-3cm horizontaleincisie in de nek.
- Ontleden en bloot 1cm van de luchtpijp. Plaats twee 1-0 snaren rond de luchtpijp.
- Plaats een endotracheale tube (3,0 of 3,5) op 1 cm in de luchtpijp. Verbinding maken met een ventilator en beginnen mechanische ventilatie. Zet de endotracheale tube.
- Ontleden en bloot de gemeenschappelijke halsslagader. Omcirkel het schip met een transittijd ultrasone stroom probe (2SB of 2RB, Transonic Systems Inc, Ithica, NY) voor het continu meten van de bloedstroom.
4. Plaatsing van stroming probes met superieure mesenteriale (figuur 3) en linker nier (figuur 4) slagaders
- Extra doses fentanyl (5-10 mcg / kg) en acepromazine (0,01-0,02 mg / kg) voorafgaand aan incisie nodig.
- Maak een lange subcostal-flank incisie en zorgvuldig ontleden spierlagen.
- Expose de abdominale aorta.
- Minimaliseer vasculaire behandeling (vasospasme) en lymfatische verwondingen.
- Ontleden 0,5-1cm a. mesenterica superior enzet een Transonic stroom sonde (3SB) omheen.
- Ontleden 0,5-1cm links nierslagader en zet een Transonic stroom sonde (2SB) omheen.
- Sluit de huid en zet de stroom sonde.
5. Plaatsing van pulmonale katheter (Figuur 5) en stromingsonde (figuur 6)
- Extra doses fentanyl (5-10 mcg / kg) en acepromazine (0,01-0,02 mg / kg) voorafgaand aan incisie nodig.
- Liggen het dier op de juiste laterale positie.
- Thoracotomie aan de linkerkant 4e intercostale ruimte.
- Kijk uit voor de interne mamma slagader en ader, ligeren indien nodig.
- Gebruik een tandheelkundige wattenstaafje om druk de linker long en zuurstof te verhogen als dat nodig is.
- Open het hartzakje.
- Identificeer de ductus arteriosus die loopt van de longslagader naar de aorta.
- Ductus arteriosus kan worden geligeerd door het plaatsen van een clip of door een dikke "3-O zijde" stropdas op zijn oorsprong.
- Gratis de belangrijkste longslagader en pas avascular sling met een dikke "0" das.
- Voer een portemonnee touwtje (5-0 Prolene) hechting aan de basis voor de plaatsing van de pulmonale arteriële katheter.
- Plaats een 20G Angiocath (met 3 zijgaten op ongeveer 1 cm van de punt van de katheter) door de tas string maximaal 1 cm.
- Controleer op vrij verkeer van veneus bloed.
- Maak verbinding met drukopnemer, controleren op pulmonale arteriële druk en golfvorm.
- Draai de portemonnee string en zet de pulmonale katheter.
- Plaats een Transonic stroom sonde (6SB) rond de belangrijkste longslagader.
- Plaats ultrasone gel tussen de stroom sonde en slagader te zorgen voor een optimale signaaloverdracht.
- Bedek de wond met vochtige zoutoplossing gedrenkt.
6. Hypoxie en reoxygenatie protocol
- Verlaag de ingeademde zuurstof concentratie 10% van de concentratie van geïnhaleerde stikstofgas hypoxemie induceren.
- Pas de ingeademde zuurstofconcentratie tussen 10% en 15% tot een PaO2 van 20-40 mmHg of SaO 2 van 30-40% te verkrijgen gedurende 2 uur.
- Voer arteriële bloed-analyse om Paco 2 te beoordelen en dienovereenkomstig aan te passen ventilator tarief.
- Met de inductie van hypoxemie is het eerste uur geleidelijk gewijd aan het induceren van een tachycardie (en hartminuutvolume) respons.
- Blijven controleren op veranderingen in de bloedstroom aan de gemeenschappelijke halsslagader, mesenterica superior en linker nier slagaders.
- Tijdens het tweede uur van hypoxie, de hypoxische stress wordt verhoogd tot gestaag lagere cardiale output tot 30-40% van de uitgangswaarde, gemiddelde arteriële druk tot 30-35 mmHg en arteriële pH 6,95-7.05.
- Hypoxische stress kan voortijdig worden beëindigd of verlengd met 15 minuten naargelang het geval.
- Abrupt tot 100% te verhogen ingeademde zuurstofconcentratie abrupt door het stopzetten van stikstofgas, en tegelijkertijd pure zuurstof.
- Monitor cardiale output, gemiddelde arteriële druk en andere hemodynamische parameter voor snel herstel.
- Reanimatie met 100% zuurstof kan worden voortgezet gedurende 0,5 uur. Na deze periode, snel te verminderen de ingeademde zuurstofconcentratie tot 21%.
- Ga verder reoxygenatie met 21% zuurstof gedurende de resterende periode van het experiment. De ingeademde zuurstofconcentratie kan worden getitreerd naar 25% indien nodig.
- Fluid bolussen of 10 lactaat ml / kg Ringer kan nodig zo nodig tijdens de experimentele periode. Het gebruik ervan moet worden geprotocolleerde.
7. Representatieve resultaten:
De inductie van hypoxie in de pasgeboren big gedurende het eerste uur van hypoxia is bedoeld om de cardiac output (pulmonale arteriële) tot 120% -130% van de uitgangswaarde (Figuur 7A) en hartslag (Figuur 7B). Gewoonlijk moet de cardiac output te bereiken zijn hoogtepunt compensatie tussen de eerste 0,5 uur en 1 uur van hypoxie. Verder bloedstroom zou moeten worden gecentraliseerd resulteert in een verminderde mijsenteric en renale perfusie, maar een bewaard gebleven of toegenomen gemeenschappelijke arteria carotis flow (figuur 8). Tijdens het tweede uur van hypoxia is er een gestage afname van cardiale output ontwikkeling van hypotensie (figuur 9A), vertraging van de hartslag met of zonder aritmie optrad. Hypoxie te induceren pulmonale hypertensie met verhoogde pulmonale arteriële druk (Figuur 9B), die soms in de laatste 30 min van hypoxie verlagen de cardiac output afneemt.
Bij reanimatie zullen alle hemodynamische parameters onmiddellijk herstellen normoxische basislijn, met uitzondering van de renale bloedstroom die geleidelijk herstelt gedurende het eerste uur van reoxygenatie. Echter de hemodynamische parameters in het bijzonder voor de cardiac output en de gemiddelde arteriële druk geleidelijk af gedurende de eerste 2 uur van de reoxygenatie tot ongeveer 70-75% van normoxische basislijn en 35-45 mmHg respectievelijk. Deze cardiovasculaire dysfunctiop ten minste gedeeltelijk voor myocardiale bedwelmen en warrants cardiovasculaire ondersteunende therapieën zoals vasoactieve en inotrope middelen.
Figuur 1: lies incisie met de plaatsing van femorale arteriële en veneuze katheters
Figuur 2: Neck incisie met de plaatsing van een endotracheale buis en een stromingsonde in de halsslagader
Figuur 3: Flank incisie met de isolatie van a. mesenterica superior
Figuur 4: Flank incisie met de isolatie van de linker nierslagader
Figuur 5: thoracotomie met de plaatsing van pulmonale katheter
Figuur 6: thoracotomie met de plaatsing van een Transonic stromingsonde rond grote longslagader
Figuur 7: temporele veranderingen in (A) cardiac output (pulmonale arteriële flow) en (B) hartslag tijdens hypoxie en reoxygenatie
Figuur 8: Tijdelijke veranderingen in de bloedstroom bij (A) gemeenschappelijke halsslagader, (B) mesenterica superior en (C) links nierslagaders tijdens hypoxie en reoxygenatie
Figuur 9: Tijdelijkeveranderingen in (A) en de gemiddelde arteriële druk (B) pulmonale arteriële druk tijdens hypoxie en reoxygenatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige experimentele protocol kent een voordeel voor de systemische en regionale hemodynamische veranderingen in de neonatale onderwerpen te onderzoeken tijdens de hypoxie en reoxygenatie proces. We kunnen ook na te gaan welke effecten van interventies gebruikt om de cardiovasculaire functie tijdens het herstel te verbeteren. Wij en anderen hebben gerapporteerd ervaring en bevindingen in de studie van neonatale asfyxie over de effecten op de cardiovasculaire 1, 2 pulmonale, neurologische 3, maag 4, lever 5, 6 nier, bijnier 7 en hematologische 8 systemen. Hoewel het belangrijk om de cardiovasculaire functie informatie gebaseerd op continue metingen van gegevens wordt technisch uitdagende zoniet onmogelijk chirurgisch instrument kleine dieren zoals knaagdieren of cavia's. Recente vooruitgang in technologie, zoals echografie en real-time beeldvorming kan echter overwinnen een aantal van deze challenges. Niettemin groot formaat dieren ook mogelijk de gelijktijdige verzamelen van biologische monsters waaronder plasma en weefsel monsters gedurende de experimentele periode. Deze extra biologische monsters zal biochemische assays en histologische onderzoek dat het begrip van de patho-fysiologie en farmacologie van hypoxie en reoxygenatie helpen. Terwijl de hoofddoelstelling van in vivo diermodellen kunnen de studie van patho-fysiologische functie van een lichaam systeem, is het belangrijk te begrijpen in de context van orgaan-orgaan interactie. Bijvoorbeeld, de interactie tussen de hartfunctie en pulmonale hypertensie of leverinsufficiëntie is belangrijk in een meervoudig orgaanfalen als die van neonatale asfyxie 9. De pasgeboren lam is een alternatief voor varkens in de gemeenschappelijke diermodellen van neonatale asfyxie bestuderen. De vroegrijpe ontwikkeling en de beperkte grootte van de worp van pasgeboren lammeren kan echter beperken een meer algemeen gebruik dan pasgeboren varkentermijn, die overeenkomen met die van 38 weken zwangerschap menselijke foetus en hebben ongeveer 10 per worp 10,11. Toch biggen zijn de meest gebruikte dieren na knaagdieren in de studie van neonatale asfyxie.
Er zijn echter beperkingen van deze varkens model van neonatale asfyxie, naast de uitdaging met betrekking tot de vertaling van bevindingen gegenereerd uit dierstudies mens. Het effect van de anesthesie en chirurgische stress om de acute instelling kan worden geminimaliseerd met een voldoende stabilisatie periode passend gebruik van verdoving medicijnen, verfijnde chirurgische technieken en de opname van schijn-geopereerde controledieren ter vergelijking. Verlenging van de experimentele periode na dag nodig om te onderzoeken of geen acute hemodynamische effect zich ook in de lange termijn. Inderdaad, hebben we succesvol in het wijzigen van de experimentele protocol om uitgebreide subacute (bijvoorbeeld 48-72 uur) 12, overleving (5-7 dagen) 13 14, het stoppen van mechanische ventilatie 15 en de toevoeging van occlusie van de halsslagader voor cerebrale ischemie. We proberen te makende hypoxie en reoxygenatie klinisch relevant. Het experiment bestaat uit 2 uur van hypoxie, die bij benadering de duur die nodig is voor noodgevallen keizersnede voor foetale nood zonder klinische bloedingen op basis van persoonlijke observatie. De reanimatie wordt begonnen met 100% zuurstof gedurende 30 minuten in plaats van 60 min in onze eerdere studies. Dit is het beperken van de hyperoxie die nog steeds een gangbare praktijk in veel gemeenschap ziekenhuizen voorafgaand aan de aankomst van de neonatale transport team. Eerste reoxygenatie met 21% zuurstof zal de recentelijk bijgewerkte richtlijn over het gebruik van extra zuurstof in neonatale reanimatie 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Canadese Institutes of Health Research (MOP53116) en de Alberta Heritage Foundation bedanken voor Medisch Onderzoek voor de exploitatiesubsidie en vestiging fonds, respectievelijk aan de ontwikkeling van deze experimentele model te ondersteunen.
References
- Borke, W. B. Increased myocardial matrix metalloproteinases in hypoxic newborn pigs during resuscitation: effects of oxygen and carbon dioxide. Eur. J. Clin. Invest. 34, 459-466 (2004).
- Munkeby, B. H. Resuscitation of hypoxic piglets with 100% O2 increases pulmonary metalloproteinases and IL-8. Pediatr. Res. 58, 542-548 (2005).
- Haaland, K. Posthypoxic hypothermia in newborn piglets. Pediatr. Res. 41, 505-512 (1997).
- Haase, E. Resuscitation with 100% oxygen causes intestinal glutathione oxidation and reoxygenation injury in asphyxiated newborn piglets. Ann. Surg. 240, 364-373 (2004).
- Stevens, J. Resuscitation with 21% or 100% oxygen is equally effective in restoring perfusion and oxygen metabolism in hypoxic newborn piglet liver. Shock. 27, 657-662 (2007).
- Johnson, S. T. N-acetylcysteine improves the hemodynamics and oxidative stress in hypoxic newborn pigs reoxygenated with 100% oxygen. Shock. 28, 484-490 (2007).
- Chapados, I. Plasma cortisol response to ACTH challenge in hypoxic newborn piglets resuscitated with 21% and 100% oxygen. Shock. 33, 519-525 (2010).
- Cheung, P. Y. Platelet dysfunction in asphyxiated newborn piglets resuscitated with 21% and 100% oxygen. Pediatr. Res. 59, 636-640 (2006).
- Martin-Ancel, A. Multiple organ involvement in perinatal asphyxia. J. Pediatr. 127, 786-793 (1995).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scan. J. Lab. Anim. Sci. Suppl. 25, 11-22 (1998).
- Chapados, I., Cheung, P. Y. Not all models are created equal: Animal models to study hypoxic-ischemic encephalopathy of the newborn. Neonatology. 94, 300-303 (2008).
- Liu, J. Q. Effects of post-resuscitation treatment with N-acetylcysteine on cardiac recovery in hypoxia-injured newborn pigs. PLoS ONE. 5, e15322-e15322 (2010).
- Cheung, P. Y. Cardio-renal recovery of hypoxic newborn pigs after 18%, 21% and 100% reoxygenation. Intensive Care Med. 34, 1114-1121 (2008).
- Temesvari, P. Modulation of the blood-brain barrier permeability in neonatal cytotoxic brain edema: laboratory and morphological findings obtained on newborn piglets with experimental pneumothorax. Biol. Neonate. 46, 198-208 (1984).
- Domoki, F. Reventilation with room air or 100% oxygen after asphyxia differentially affects cerebral neuropathology in newborn pigs. Acta. Paediatr. 95, 1109-1115 (2006).
- Part 15: Neonatal resuscitation: 2010 American Heart Association guidelines for cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care. Circulation. 122, S909-S919 (2010).
