新生児仮死の新型モデル

Summary

大型動物モデルは、新生児仮死の生理学や薬理学の試験で良い並進値を持っています。生まれたばかりの子豚を使用して、我々は全身の血行動態および地域的、生化学的および病理学的経路と相関を持つ酸素の輸送を研究の利点を持っている新生児仮死をシミュレートするための実験プロトコルを開発しています。

Abstract

仮死に関連するものとして、毎年100万人以上の新生児は、世界中で死ぬ。窒息した新生児は、一般的に低血圧、血流障害、低酸素性虚血性脳症、肺高血圧症、vasculopathic腸炎、腎不全、血栓塞栓性合併症を含む多臓器不全を持っている。動物モデルは、私たちは新生児仮死の病態生理学や薬理学の理解を助けるために開発されています。げっ歯類と新生児の子羊と比較して、生まれたばかりの子豚は、貴重なモデルであることが証明されています。生まれたばかりの子豚は、36から38週と同様の開発を含め、いくつかの利点があり、動物の計測とモニタリングを可能との交絡変数を制御匹敵するボディシステム、大規模なボディサイズ（出生時〜1.5〜2キロ）を持つヒトの胎児低酸素症および血行動態撹乱。

我々はここで新生児仮死をシミュレートする実験プロトコルを説明し、私たちはの体系を調べることができますマイクや地域の血行動態の変化窒息及び再酸素化プロセスの間だけでなく、介入のそれぞれの効果。さらに、このモデルは多臓器不全または機能不全同時に、様々な身体のシステムとの相互作用を研究することの利点を持っています。実験モデルは、機械換気、血管（動脈、中心静脈）アクセスの設立を可能にするために生まれたばかりの子豚の外科手術用器具類（1-3、日齢および1.5〜2.5キロの重量混合された品種）を含む非生存の手順ですと主肺、総頸動脈、上腸間膜と左腎動脈を含む様々な動脈にわたる血管内の圧力と血流の連続モニタリング用カテーテルとフロープローブ（トランソニック株式会社）の配置。血行動態パラメータと正常な血液ガスのZ <10％の変動によって定義されるように30〜60分間安定した後、これらの外科的にインストルメントされた豚を使用して、我々は実験プロトコルを開始normocapnic肺胞低酸素症を介して誘導され、重篤な低酸素血症の。子豚は30〜40％の動脈血酸素飽和度を目指して、2時間窒素ガスの吸入濃度を増加させることにより10〜15％酸素で換気される。低酸素血症の程度は、この重要な臓器への血流低下と重篤な代謝性アシドーシスの臨床仮死、全身性低血圧および心原性ショックを生成します。低酸素症は0.5時間、100％酸素とその後3.5時間で21％の酸素と酸素化が続いている。薬理学的介入は、追って紹介し、その効果は盲検、無作為化されたブロックの方法で調べることができます。

Protocol

1。麻酔

1. 2L/minで麻酔器の流量を設定する。真空吸引、排気を接続します。
2. 5％（約3分）での麻酔ガス（イソフルラン）との電荷フェイスマスク。
3. 新生子豚は100％酸素の吸入イソフルラン5％（約3分）で誘導されます。
4. イソフルランの2-3％で麻酔を維持している。必要に応じて、0.5％イソフルランの微調整は、しかし、それは0.5から子豚の状態に応じて5％までの範囲であってもよい。
5. 血管アクセスが確立された後、吸入麻酔はフェンタニル（5から50マイクログラム/キログラム/ h）とミダゾラム（200から500マイクログラム/ kg / h）で点滴を用いて静脈麻酔に切り替えることができます。パンクロニウム（50-100マイクログラム/ kg / h）で、動物の状態を観察する能力をしながら、手術の際に過度の筋肉の動きを制御するために必要になることがありますが、麻酔薬の調整のために保存されます。
6. 子豚は、パルスオキシメータ（経皮的酸素sによって監視されている95から100パーセントでaturation）と心電図（130から170拍/分時の心拍数）。
7. 子豚の直腸温度は、加熱毛布と暖かい晴れやかと38から40℃に維持されている。
8. 子豚の麻酔状態を定期的に行動（攪拌）、心血管（頻脈や高血圧）や呼吸器（頻呼吸）パラメータは、必要に応じて、神経（瞳孔の大きさ、引き裂き、体の動き）を使って実験期間を通じて評価されています。最小限の麻痺が与えられます。麻痺がある場合とない子豚の麻酔の経験が評価のために有用であろう。
9. プロトコルは、静脈内ペントバルビタールの過剰投与（100 mg / kg）を用いた実験の終了時に動物の安楽死と非生存手順です。

2。脚の付け根の血管カテーテルの外科的配置（図1）

1. 右脚の付け根の長い2〜3センチメートル切開を行います。
2. 右大腿静脈さ1cm righの1cmを解剖トン大腿動脈。各容器の周囲2 3から0までの文字列を入れてください。
3. 右大腿静脈カテーテル法：静脈の遠位をライゲーションする。 15センチメートルにアーガイルカテーテル（3.5または5フランス語、ダブルルーメン）（コヴィディエン、マンスフィールド、マサチューセッツ州）を挿入し、これは、右心房に配置されます。カテーテルを固定するために、両方の文字列を結ぶ。カテーテルは、維持液と薬の注入（セカンダリポート）と静脈/右心房圧測定（プライマリポート）は、中央に使用することができます。
4. 右大腿動脈カテーテル法：動脈の遠位をライゲーションする。血流を止めるために近位列を持ち上げます。 5cmにアーガイルカテーテル（3.5または5フランス語、シングルルーメン）を挿入します。これは、連続平均動脈圧測定と採血用のインフラ腎動脈に動脈カテーテルを配置します。カテーテルを固定するために、両方の文字列を結ぶ。
5. 皮膚を閉じます。

3。機械換気（図2）を確立

1. 長い2〜3センチメートル水平を作る首の切開。
2. 解剖すると気管の1cm公開します。気管の周りに2 1から0の文字列を入れてください。
3. 気管に1センチメートルで気管内チューブ（3.0または3.5）を挿入します。人工呼吸器に接続して、機械的人工換気を開始。気管内チューブを固定します。
4. 総頸動脈を切開し、公開します。継続的に血流を測定するために通過時間の超音波流量プローブ（2SBまたは2RB、トランソニックシステムズ、Ithica、NY）を容器を取り囲んでいます。

4。上腸間膜における流量プローブの配置（図3）と左腎（図4）動脈

1. 余分なフェンタニルの用量（5-10マイクログラム/ kg）およびアセプロマジンは（0.01から0.02 mg / kg）の前に皮膚切開する必要があります。
2. 長い肋骨下、側腹切開を行い、慎重に筋層を切開。
3. 腹部大動脈を公開します。
4. 血管処理（攣縮）やリンパの傷害を最小限に抑えることができます。
5. 0.5〜1センチメートル上腸間膜動脈を切開し、その周り遷音速流プローブ（3SB）をつけて下さい。
6. 0.5〜1センチメートル左腎動脈を切開し、その周り遷音速流プローブ（2SB）をつけて下さい。
7. 皮膚を閉じ、流量プローブを固定します。

5。肺動脈カテーテルの配置（図5）とフロープローブ（図6）

1. 余分なフェンタニルの用量（5-10マイクログラム/ kg）およびアセプロマジンは（0.01から0.02 mg / kg）の前に皮膚切開する必要があります。
2. 右側臥位で動物が眠っているのです。
3. 左第4肋間で開胸術。
4. 必要に応じて内胸動脈と静脈に気をつけろ、結紮する。
5. 左肺を下に押して、必要に応じて酸素を増加させる歯科綿棒を使用しています。
6. 心膜を開きます。
7. 大動脈肺動脈から実行動脈管を識別します。
8. 動脈管は、クリップを配置することによって、またはその原点に厚い "3-O絹"タイで連結することができる。
9. 主肺動脈、無料でAVを渡す厚い "0"タイを使用してascularスリング。
10. 肺動脈カテーテルを配置するための基地で巾着（5-0プロレン）縫合を行います。
11. 1cmの最大巾着を通して20G Angiocathを（カテーテルの先端から1cm未満で3側孔付き）を挿入します。
12. 静脈血の自由な流れを確認してください。
13. 圧力変換器に接続し、肺動脈圧と波形を確認してください。
14. 巾着を締め、肺カテーテルを固定します。
15. 主肺動脈の周り遷音速流プローブ（6SB）を置きます。
16. 最適な信号伝達を可能にするためにフロープローブと動脈の間に超音波ゲルを置きます。
17. 湿った生理食塩水ガーゼで傷口をカバーしています。

6。低酸素および再酸素化プロトコル

1. 低酸素血症を誘発するために吸入窒素ガスの濃度を増加させることにより10％に吸入酸素濃度を下げます。
2. 吸入酸素を調整します2時間30から40パーセントの20〜40 mmHgまたはSAO ₂のPAO _2を取得するために10％と15％の間の濃度。
3. パコ_2を評価し、それに応じて人工呼吸器の速度を調整するために動脈血分析を実行します。
4. 低酸素血症の誘導と、最初の一時間は着実に頻脈（および心拍出量）応答を誘導するに捧げられています。
5. 総頸動脈、上腸間膜と左腎動脈の血流の変化を継続的に監視します。
6. 低酸素症の二時間の間に、低酸素ストレスがベースラインの30〜40％まで徐々に低い心拍出量を増加させ、30から35 mmHgのと動脈血pH 6.95から7.05への平均動脈圧。
7. 低酸素ストレスが途中で終了したり、必要に応じて15分延長することができる。
8. 純酸素を継続しながら、突然100％には、窒素ガスを中止することによって突然引き起こされた酸素濃度を増加させます。
9. 動脈圧および他の血行動態パラを意味し、心拍出量を監視急速な回復のためのメートル。
10. 100％酸素と蘇生は0.5時間継続することができる。この期間の後、21％に素早く吸入酸素濃度を低下させる。
11. 実験の残りの期間の21％の酸素と酸素化を続行します。必要に応じて吸入酸素濃度は25％まで滴定することができる。
12. 10ミリリットル/ kgの乳酸リンゲル液の流体ボーラスは実験期間の間に、必要に応じて必要となる場合があります。その使用はprotocolizedする必要があります。

7。代表的な結果：

低酸素症の最初の一時間以上新生豚における低酸素血症の誘導は120％-130％のベースライン（ 図7A）と心拍数（ 図7B）に心拍出量（肺動脈の血流）を増加させる必要があります。典型的には、心拍出量は、低酸素の最初の0.5時間と1時間の間にそのピーク補償に達する必要があります。また、血液の流れが私を減少、結果として中央集中型になるべきsentericおよび腎灌流が、保持または増加頚動脈フロー（ 図8）。低酸素症の二時間の間に、心拍出量の着実な減少が低血圧の開発（ 図9A）、があり、不整脈の有無にかかわらず、心拍数減少が発生しました。低酸素症は時々心拍出量が減少すると低酸素の最後の30分で下げる可能性が増加した肺動脈圧（ 図9B）と肺高血圧症を誘発する必要があります。

蘇生時には、すべての血行動態パラメータはすぐに徐々に再酸素化の第一時間以上かけて回復し、腎血流量を除いて、正常酸素ベースラインに回復します。しかし、特に心拍出量および平均動脈圧血行動態パラメータは、徐々にそれぞれ、正常酸素ベースラインと35から45 mmHgの70から75％程度に再酸素化の最初の2時間以上悪くなります。この心臓血管dysfunctiには、このような血管作用と強心薬などの心筋素晴らしいとワラント心臓血管の支持療法のために、少なくとも部分的にである。

図1：大腿動脈および静脈カテーテルの配置と脚の付け根の切開

図2：総頸動脈の周りに気管内チューブの配置と流れのプローブを使って首の切開

図3：上腸間膜動脈の分離と側腹切開

図4：左腎動脈の分離と側腹切開

図5：肺動脈カテーテルの配置と開胸

図6：主肺動脈の周りの遷音速流れのプローブの配置と開胸

図7（A）、心拍出量（肺動脈流）と（B）の心拍数と低酸素再酸素化時の経時変化

図8（A）総頸動脈の血流の経時変化、低酸素および再酸素化時に（B）の上腸間膜および（C）の左腎動脈

図9：時（A）の平均動脈圧と低酸素および再酸素化時に（B）の肺動脈圧の変化

Discussion

現在の実験プロトコルは、低酸素および再酸素化プロセスの間に新生児の被験者の全身および地域の血行動態の変化を検討するという利点があります。また、リカバリ時に心血管機能を改善するために用いた介入のそれぞれの効果を調べることができます。私たちと他の人が心血管^1、肺^2、神経^3、胃腸^4、肝^5、6腎、副腎⁷および血液⁸システムにおける効果に関する新生児仮死の研究の経験と知見を報告している。それは連続的なデータの測定値に基づいて情報を含む心血管機能を理解することが重要ですが、それは技術的に困難であるなどのげっ歯類やモルモットなどの手術器具の小型動物に不可能ではない。このような超音波検査およびリアルタイムイメージングなどの技術の最近の進歩は、しかし、これらの茶のいくつかを克服することができるllenges。それにもかかわらず、大型動物は、実験期間中の血漿および組織サンプルを含む生物学的サンプルの同時収集が可能になります。この付加的な生物学的サンプリングは、低酸素および再酸素化の病態生理学や薬理学の理解を助ける生化学的アッセイ及び組織学的検査が可能になります。 インビボ動物モデルの主な目的は、ただ一つの身体のシステムの病態生理学的機能の研究かもしれませんが、それは臓器器官の相互作用の文脈でそれを理解することが重要です。例えば、心機能と肺高血圧症や肝機能障害との間の相互作用は、新生児仮死⁹と多臓器不全で重要である。生まれたばかりの子羊は、新生児仮死を研究するために使用される一般的な動物モデルで豚に代わるものです。生まれたばかりの子羊の早熟と限られた産仔数はしかし、新生児の豚よりも一般使用を制限することができる妊娠38週のヒト胎児のそれに対応する、ことができ、約10ごみ^10,11あたりを持っています。それにもかかわらず、生まれたばかりの子豚は、新生児仮死の研究では、げっ歯類の後に最も頻繁に使用される動物です。

しかし、新生児仮死のこの豚モデルの限界は、動物実験からヒトに生成された調査結果の翻訳に関連する課題に加えて、そこにあります。急性設定にとして麻酔や手術侵襲の影響を比較するために十分な安定化期間、麻酔薬の適切な使用、洗練された手術手技だけでなく、偽手術対照動物の包含で最小限に抑えることができる。日を超えて実験期間を延長しても、急性血行力学的効果が長期的に持続するかどうかを調査するために必要とされる。実際、我々は拡張亜への実験的なプロトコル（例えば、48〜72時間^）12、生存期間（5-7日^）13を修正^することに成功してきた15および脳虚血のための頸動脈閉塞の添加を停止し、気胸¹⁴の作成 ​​が含まれます。我々は、行おうとする臨床的に関連する低酸素および再酸素化。実験では、個人的な観察に基づいて臨床的出血することなく、胎児仮死のため緊急帝王切開に必要な期間に近似する低酸素症の2hを含む。蘇生は30分ではなく、我々の以前の研究では60分間100％酸素で開始されます。これは、新生児の輸送チームが到着する前に多くの地域の病院では一般的な方法のままで高濃度酸素を制限することです。 21％の酸素と初期再酸素化は新生児の蘇生¹⁶の酸素補給の使用に最近更新されたガイドラインに従います。