Um Modelo de Suínos de asfixia neonatal

Summary

Modelos animais de grande porte têm bons valores de translação no exame de fisiologia e farmacologia da asfixia neonatal. Usando leitões recém-nascidos, desenvolvemos um protocolo experimental para simular a asfixia neonatal, que tem as vantagens de estudar a hemodinâmica sistêmica e regional, o transporte de oxigênio com vias bioquímicas e patológicas e correlações.

Abstract

Anualmente mais de 1 milhão de recém-nascidos morrem no mundo como relacionado à asfixia. Neonatos asfixiados comumente têm falência de múltiplos órgãos, incluindo hipotensão déficit de perfusão, encefalopatia hipóxico-isquêmica, hipertensão pulmonar, enterocolite vasculopathic, insuficiência renal e complicações tromboembólicas. Os modelos animais são desenvolvidos para nos ajudar a entender a fisiopatologia e farmacologia de asfixia neonatal. Em comparação com os roedores e os cordeiros recém-nascido, o leitão recém-nascido foi provado ser um modelo válido. O leitão recém-nascido tem várias vantagens, incluindo desenvolvimento semelhante à de 36-38 semanas feto humano com sistemas do corpo comparáveis, tamanho grande massa (~ 1,5-2 kg no nascimento), que permite a instrumentação e monitoramento do animal e controla as variáveis ​​de confusão de desarranjos hipóxia e hemodinâmica.

Nós aqui descrever um protocolo experimental para simular a asfixia neonatal e nos permite examinar a systemic e regionais alterações hemodinâmicas durante o processo asfixiantes e reoxigenação assim como os respectivos efeitos de intervenções. Além disso, o modelo tem a vantagem de se estudar falha de múltiplos órgãos ou disfunção em simultâneo e a interacção com vários sistemas do corpo. O modelo experimental é um procedimento não-sobrevivência que envolve a instrumentação cirúrgica de leitões recém-nascidos (raça dias de idade e 1,5-2,5 kg de peso, 1-3 misto) para permitir o estabelecimento de ventilação mecânica, de acesso (arterial e venoso central) vascular ea colocação de cateteres e sondas de fluxo (Transonic Inc.) para a monitorização contínua da pressão intra-vascular e fluxo de sangue através das artérias diferentes, incluindo principal carótida, pulmonar comum, mesentérica superior e esquerda artérias renais. Usando estes leitões cirurgicamente instrumentados, após estabilização durante 30-60 minutos, tal como definidos pela variação Z <10% nos parâmetros hemodinâmicos e gases sanguíneos normais, iniciar um protocolo experimentalde hipoxemia grave que é induzida através de hipóxia alveolar normocápnica. O porquinho é ventilada com oxigénio de 10-15% por aumento da concentração de gás inalado azoto durante 2 h, com o objectivo de saturações de oxigénio arterial de 30-40%. Este grau de hipoxemia vai produzir asfixia clínica com acidose metabólica grave, hipotensão e choque cardiogênico com hipoperfusão de órgãos vitais. A hipoxia é seguida por reoxigenação com oxigénio a 100% durante 0,5 horas e, em seguida, 21% de oxigénio durante 3,5 h. Intervenções farmacológicas podem ser introduzidas em devido tempo e os seus efeitos investigada em ocultação, moda em blocos ao acaso.

Protocol

1. Anestesia

1. Definir a velocidade de fluxo da máquina de anestesia em 2L/min. Ligue o escape de sucção a vácuo.
2. Máscara de carga cara com gás anestésico (isoflurano) a 5% (~ 3 min).
3. Leitões recém-nascidos serão induzidos com isoflurano inalado 5% em 100% de oxigénio (~ 3 min).
4. Manter a anestesia em 2-3% de isoflurano. Ajuste fino de isoflurano 0,5% consoante o caso, no entanto, pode variar de 0,5 a 5%, dependendo da condição de leitões.
5. Uma vez que o acesso vascular foi estabelecida, a anestesia por inalação pode ser comutada para a anestesia intravenosa utilizando fentanil (5-50 mcg / kg / h) e midazolam (200-500 mcg / kg / h) infusões. Pancurónio (50-100 mcg / kg / h) pode ser obrigado a controlar os movimentos musculares excessivas durante a cirurgia, enquanto que a capacidade de observar estado animal é preservado para o ajustamento de drogas anestésicas.
6. O leitão é monitorada por oximetria de pulso (percutânea de oxigênio saturation a 95-100%) e ECG (ritmo cardíaco em 130-170 batimentos / min).
7. Temperatura retal do leitão é mantido a 38-40 ° C com manta de aquecimento e aquecedor radiante.
8. O estado anestésico do leitão está sendo avaliado regularmente durante todo o período experimental com neurológicos (tamanho da pupila, lacrimejamento, movimentos do corpo), comportamentais (agitação), cardiovascular (taquicardia e hipertensão) e respiratória (taquipneia) parâmetros como apropriado. Paralisia mínimo é dado. Experiência anterior de anestesia em leitões com e sem paralisia seria útil para a avaliação.
9. O protocolo é um procedimento não-sobrevivência com a eutanásia dos animais no final do experimento com uma overdose de pentobarbital (100 mg / kg) por via intravenosa.

2. Cirurgia de colocação de cateteres vasculares na virilha (Figura 1)

1. Faça uma incisão 2-3cm de comprimento na virilha direita.
2. Dissecar um centímetro da veia femoral direita e retidão 1 centímetrot artéria femoral. Coloque duas cordas 3-0 em torno de cada navio.
3. Cateterização venosa femoral direita: Ligar o distal da veia. Inserir um cateter Argyle (3,5 ou 5 French, duplo-lúmen) (Covidien, Mansfield, MA) a 15cm e isso vai colocar no átrio direito. Amarre as duas cordas para fixar o cateter. O cateter pode ser usado para fluido de manutenção e de infusão de medicamentos (porta secundária) e venosa central / medição da pressão atrial direita (porta principal).
4. Cateterismo femoral direito arterial: Ligar o distal da artéria. Levante-se a cadeia de proximal para parar o fluxo de sangue. Inserir um cateter Argyle (3,5 ou 5 francês, único lúmen) a 5cm. Isto irá colocar o cateter arterial na aorta infra-renal para a medição contínua da pressão arterial média e a amostragem de sangue. Amarre as duas cordas para fixar o cateter.
5. Fechar a pele.

3. Estabelecer ventilação mecânica (Figura 2)

1. Fazer uma horizontal 2-3cm de comprimentoincisão no pescoço.
2. Dissecar e expor um centímetro da traquéia. Coloque duas cordas 1-0 ao redor da traquéia.
3. Insira um tubo endotraqueal (3.0 ou 3.5) a um centímetro na traquéia. Conectar a um ventilador e iniciar ventilação mecânica. Fixe o tubo endotraqueal.
4. Dissecar e expor a artéria carótida comum. Cercar o navio com um fluxo de tempo de trânsito sonda de ultra-som (2SB ou 2RB, Transonic Systems Inc., Ithica, NY) para medir continuamente o fluxo de sangue.

4. Colocação de sondas de fluxo em mesentérica superior (Figura 3) e renal esquerda (Figura 4) artérias

1. Doses adicionais de fentanil (5-10 mcg / kg) e acepromazina (0,01-0,02 mg / kg) são necessárias antes da incisão da pele.
2. Fazer uma incisão lateral-subcostal longa e dissecar cuidadosamente camadas musculares.
3. Exposição da aorta abdominal.
4. Minimizar manuseamento vascular (vasospasmo) e lesão linfática.
5. Dissecar 0,5 a 1 cm ea artéria mesentérica superiorcolocar uma sonda de fluxo Transonic (3SB) em torno dele.
6. Dissecar 0,5 a 1 cm da artéria renal esquerda e colocar uma sonda de fluxo Transonic (2SB) em torno dele.
7. Fechar a pele e fixar a sonda de fluxo.

5. A colocação de cateter na artéria pulmonar (Figura 5) e o fluxo de sonda (Figura 6)

1. Doses adicionais de fentanil (5-10 mcg / kg) e acepromazina (0,01-0,02 mg / kg) são necessárias antes da incisão da pele.
2. Deite o animal na posição de lateral direito.
3. Toracotomia no 4 º espaço intercostal esquerdo.
4. Cuidado com a artéria mamária interna e veia, ligadura se necessário.
5. Utilize um cotonete dental para pressionar para baixo o pulmão esquerdo e aumentar o oxigênio, se necessário.
6. Abra o pericárdio.
7. Identificar o canal arterial, que vai da artéria pulmonar à aorta.
8. Canal arterial pode ser ligado pela colocação de um clipe ou por um grosso "3-O seda" gravata em sua origem.
9. A artéria pulmonar principal e livre passagem avestilingue ascular usando uma espessa "0" gravata.
10. Realizar um fio de bolsa (5-0 prolene) sutura na base para a colocação do cateter de artéria pulmonar.
11. Inserir um angiocath de calibre 20G (com 3 orifícios laterais em menos de 1 cm da ponta do cateter), através do fio de bolsa até um máximo de 1 cm.
12. Verifique se há livre fluxo de sangue venoso.
13. Conecte-se transdutor de pressão, verificar pressão arterial pulmonar e forma de onda.
14. Aperte o fio de bolsa e prenda o cateter pulmonar.
15. Colocar uma sonda de fluxo Transonic (6SB) em torno da artéria pulmonar principal.
16. Coloque gel de ultra-sons entre a sonda de fluxo e de artéria para permitir a transdução de sinal óptima.
17. Cobrir a ferida com gaze salina úmida.

6. Hipóxia e reoxigenação protocolo

1. Reduzir a concentração de oxigénio inspirado para 10% por aumento da concentração de gás de azoto para induzir a hipoxemia inalado.
2. Ajuste o oxigênio inspiradoconcentração entre 10% e 15% para se obter uma PaO ₂ de 20-40 mmHg ou SaO ₂ de 30-40%, durante 2 h.
3. Realizar análise de sangue arterial para avaliar PaCO ₂ e ajustar a taxa de ventilação de acordo.
4. Com a indução de hipoxemia, a primeira hora é dedicada a indução de uma resposta constante (e o débito cardíaco) taquicardia.
5. Continue a acompanhar as mudanças no fluxo de sangue no comum mesentérica, carótida superior e esquerda artérias renais.
6. Durante a segunda hora de hipóxia, o stress hipóxico é aumentada para saída constante inferior cardíaca a 30-40% da linha de base, a pressão arterial média de 30-35 mmHg e pH arterial 6,95-7,05.
7. Estresse hipóxico pode ser encerrado prematuramente ou prorrogado por 15 min, conforme apropriado.
8. Aumentar a concentração de oxigênio inspirado abruptamente para 100% abruptamente interrompendo gás nitrogênio, continuando oxigênio puro.
9. Monitorar o débito cardíaco, pressão arterial média e outros hemodinâmica parágrafometros para a rápida recuperação.
10. Ressuscitação com oxigênio a 100% pode ser continuado por 0,5 h. Após este período de tempo, reduzir a concentração de oxigénio inspirado para 21% rapidamente.
11. Continuar reoxigenação com 21% de oxigênio para o restante período de experiência. A concentração de oxigénio inspirado pode ser titulada para 25%, se necessário.
12. Bolus de fluido de uma solução a 10 ml / kg de Ringer de lactato pode ser necessária, conforme apropriado, durante o período experimental. Seu uso deve ser protocolizado.

7. Resultados representativos:

A indução de hipoxemia no leitão recém-nascido durante a primeira hora de hipóxia deve aumentar o débito cardíaco (fluxo arterial pulmonar) e 120% -130% dos valores iniciais (Figura 7A) e a frequência cardíaca (Figura 7B). Normalmente, o débito cardíaco deve atingir o seu pico de compensação entre o primeiro e 0,5 h 1h de hipóxia. Além disso, o fluxo de sangue deve ser centralizada, resultando em diminuição mimperfusão senteric e renal, mas um aumento do fluxo ou preservado carótida comum arterial (Figura 8). Durante a segunda hora de hipóxia, há uma diminuição contínua do débito cardíaco, o desenvolvimento de hipotensão (Figura 9A), diminuição da frequência cardíaca, com ou sem arritmia ocorreu. Hipóxia deve induzir hipertensão pulmonar, com a pressão da artéria pulmonar aumentado (Figura 9B), a qual pode por vezes reduzir no min 30 final de hipóxia como a diminuição do débito cardíaco.

Após a reanimação, todos os parâmetros hemodinâmicos vai recuperar imediatamente a linha de base normóxica, exceto para o fluxo de sangue renal, que se recupera gradualmente durante a primeira hora de reoxigenação. No entanto, os parâmetros hemodinâmicos, especialmente para o débito cardíaco e da pressão arterial média deteriora-se gradualmente ao longo de 2 horas, antes de a reoxigenação e cerca de 70-75% da linha de base normóxicas e 35-45 mm Hg, respectivamente. Este dysfuncti cardiovascularem, pelo menos, em parte, para o atordoamento do miocárdio e garante cardiovasculares terapias de apoio, tais como agentes vasoativos e inotrópicos.

Figura 1: incisão na virilha com a colocação de cateteres femorais arteriais e venosos

Figura 2: incisão do pescoço com a colocação de um tubo endotraqueal e uma sonda de fluxo em torno da artéria carótida comum

Figura 3: incisão de flanco com o isolamento da artéria mesentérica superior

Figura 4: incisão de flanco com o isolamento da artéria renal esquerda

Figura 5: A toracotomia com a colocação de cateter na artéria pulmonar

Figura 6: A toracotomia com a colocação de uma sonda de fluxo em torno Transonic artéria pulmonar principal

Figura 7: mudanças temporais no (A) o débito cardíaco (fluxo arterial pulmonar) e (B) a freqüência cardíaca durante a hipóxia e reoxigenação

Figura 8: Mudanças temporais no fluxo sanguíneo em (A), carótida comum (B) mesentérica superior e (C) artérias renais esquerdas durante hipóxia e reoxigenação

Figura 9: Temporalmudanças no (A) e pressão arterial média (B) a pressão da artéria pulmonar durante hipóxia e reoxigenação

Discussion

O actual protocolo experimental tem uma vantagem para examinar as alterações sistêmicas e regionais hemodinâmicos em indivíduos recém-nascidos durante o processo de hipóxia e reoxigenação. Nós podemos também examinar o respectivo efeito das intervenções utilizadas para melhorar a função cardiovascular durante a recuperação. Nós e outros relatam a experiência e os resultados do estudo de asfixia neonatal em relação aos efeitos cardiovasculares em ^{1, 2} pulmonar, neurológica ^{3, 4} gastrointestinal, hepática ^5, renal ^{6, 7} adrenal e hematológicas ⁸ sistemas. Embora seja importante para compreender a função cardiovascular com informações com base em medições contínuas dos dados, é tecnicamente difícil se não impossível de tipo cirúrgico instrumento de tamanho pequeno de animais, tais como roedores ou cobaias. Avanço recente em tecnologias como ultra-sonografia e imagem em tempo real pode, porém, ultrapassar alguns destes challenges. No entanto, os animais de grande porte, também permitem a recolha simultânea de amostras biológicas, incluindo amostras de plasma e tecidos durante o período experimental. Esta amostragem biológica adicional permitirá ensaios bioquímicos e exame histológico, que ajudam a compreensão da fisiopatologia e farmacologia de hipóxia e reoxigenação. Embora o objectivo primário de modelos animais in vivo pode ser o estudo de pato-fisiológicas função de um sistema de único corpo, é importante compreender que, no contexto do órgão órgão interacção. Por exemplo, a interacção entre a função cardíaca e hipertensão pulmonar ou disfunção hepática é importante para uma disfunção de múltiplos órgãos como o de asfixia neonatal ^9. O cordeiro recém-nascido é uma alternativa para suínos nas modelos animais comuns usados ​​para estudar a asfixia neonatal. O desenvolvimento precoce e tamanho de leitegada limitado de cordeiros recém-nascidos podem, contudo, restringir a utilização mais generalizada do que porco recém-nascidolets, que corresponda à das 38 semanas de gestação feto humano e têm, aproximadamente, 10 por ninhada ^10,11. No entanto, os leitões recém-nascidos são os animais mais utilizados após roedores no estudo da asfixia neonatal.

No entanto, existem limitações deste modelo suíno de asfixia neonatal, em adição ao desafio relacionado com a concretização dos resultados gerados a partir de estudos com animais para humanos. O efeito de anestesia e stress cirúrgico como a definição aguda pode ser minimizado com um período de estabilização suficiente, o uso apropriado de drogas anestésicas, técnicas cirúrgicas refinadas, bem como a inclusão de animais sham-operated de controlo para comparação. Prolongar o período experimental além dia é necessária para investigar se qualquer efeito agudo hemodinâmico vai persistir a longo prazo. Com efeito, temos sido bem sucedido na modificação do protocolo experimental para subaguda prolongado (por exemplo, 48-72 horas) ^12, sobrevivência (5-7 dias) ¹³ 14, parando a ventilação mecânica ¹⁵ e a adição de oclusão da artéria carótida para a isquemia cerebral. Tentamos fazera hipóxia e reoxigenação clinicamente relevante. A experiência inclui 2h de hipóxia, que é aproximado à duração necessária para a seção de emergência cesariana por sofrimento fetal sem sangramento clínico baseado na observação pessoal. A ressuscitação é iniciada com 100% de oxigénio durante 30 minutos, em vez de 60 min nos nossos estudos anteriores. Isto é para limitar a hiperoxia que continua a ser uma prática comum nos hospitais muitos comunidade antes da chegada da equipa de transporte neonatal. Reoxigenação inicial com 21% de oxigênio vai seguir a orientação recentemente actualizadas sobre o uso de oxigênio suplementar em reanimação neonatal ^16.