Ett svin modell av neonatal asfyxi

Summary

Stora djurmodeller har goda translationella värden i undersökningen för fysiologi och farmakologi av neonatal asfyxi. Med hjälp av nyfödda smågrisar, utvecklar vi ett experimentellt protokoll för att simulera neonatal asfyxi som har fördelar studera systemiska och regionala hemodynamik, syretransport med biokemiska och patologiska vägar och korrelationer.

Abstract

Årligen över en miljon nyfödda dör i världen i relation till asfyxi. Asphyxiated nyfödda har ofta multiorgansvikt inklusive hypotension, perfusion underskott, hypoxisk-ischemisk encefalopati, pulmonell hypertension, vasculopathic enterokolit, njursvikt och tromboemboliska komplikationer. Djurmodeller har utvecklats för att hjälpa oss att förstå pato-fysiologi och farmakologi av neonatal asfyxi. I jämförelse med gnagare och nyfödda lamm, har nyfödda smågrisar visat sig vara en värdefull modell. Det nyfödda smågris har flera fördelar, inklusive liknande utveckling som för 36-38 veckor mänskligt foster med jämförbara kroppens system, stora kroppsstorlek (~ 1,5-2 kg vid födseln) som gör det möjligt för instrumentering och övervakning av djuret och styr förbryllande variabler hypoxi och hemodynamiska rubbningar.

Vi beskriver här ett experimentellt protokoll för att simulera neonatal asfyxi och tillåter oss att undersöka systemamikrofon och regionala hemodynamiska förändringar under kvävande och ny syresättning processen samt respektive effekterna av insatserna. Vidare har modellen fördelen att studera multiorgansvikt eller dysfunktion samtidigt och interaktion med olika kroppens system. Den experimentella modellen är en icke-överlevnad åtgärd som innebär kirurgisk instrumentering av nyfödda smågrisar (1-3 dagar gamla och 1,5-2,5 kg, blandras) för att möjliggöra införandet av mekanisk ventilation, vaskulära (arteriell och central venös) tillträde och placeringen av katetrar och sonder flöde (Transonic Inc.) för kontinuerlig övervakning av handeln inom vaskulär tryck och blodflöde i olika artärer inklusive de huvudsakliga pulmonell, carotis, överlägsen mesenteriska och vänster njurartärerna. Med hjälp av dessa kirurgiskt instrumenterade smågrisar efter stabilisering i 30-60 minuter enligt definitionen i Z <10% variation i hemodynamiska parametrar och normala blodgaser, börjar vi ett experimentellt protokollav svår hypoxemi som induceras via normocapnic alveolär hypoxi. Smågrisarnas ventileras med 10-15% syre genom att öka den inhalerade koncentrationen av kvävgas under 2 h, siktar på arteriella syremättnader på 30-40%. Denna grad av hypoxemi ger klinisk asfyxi med svår metabolisk acidos, systemisk hypotension och kardiogen chock med hypoperfusion till vitala organ. Hypoxi följs av ny syresättning med 100% syre under 0,5 h och därefter 21% syre under 3,5 timmar. Farmakologiska insatser kan införas i sinom tid och deras effekter studerats i en blindad, block-randomiserad sätt.

Protocol

1. Anestesi

1. Ställ in flödeshastigheten för anestesiapparaten på 2L/min. Anslut avgaserna till vakuumsugning.
2. Laddnings ansiktsmask med anestesigas (Isofluran) vid 5% (~ 3 min).
3. Nyfödda spädgrisar att induceras med inhalerad Isofluran 5% i 100% syre (~ 3 min).
4. Upprätthålla anestesi vid 2-3% av isofluran. Finjustering av isofluran med 0,5% så är lämpligt, kan det emellertid sträcka sig från 0,5 till 5%, beroende på tillståndet hos smågrisar.
5. När vaskulär access har upprättats, kan inhalationsanestesi kopplas till intravenös anestesi med fentanyl (5-50 mikrogram / kg / h) och midazolam (200-500 mikrogram / kg / timme) infusioner. Pankuronium (50-100 mikrogram / kg / timme) kan krävas för att kontrollera överdriven muskelrörelser under operationen, medan förmågan att observera djurets tillstånd bevaras för justering av anestesi läkemedel.
6. Den smågris övervakas av pulsoximetri (perkutan syre äraturation på 95-100%) och EKG (hjärtfrekvens vid 130-170 slag / min).
7. Den Nasses rektala temperaturen hålls vid 38-40 ° C med värmefilt och strålande varmare.
8. Den anestetiska tillstånd smågris håller regelbundet utvärderas under försöksperioden med neurologiska (pupillstorlek, tårflöde, kroppsrörelser), som är lämpligt beteende (agitation), hjärt (takykardi och hypertoni) och respiratoriska (takypné) parametrar. Minimal förlamning ges. Tidigare erfarenhet av anestesi hos smågrisar med och utan förlamning skulle vara användbar för utvärdering.
9. Protokollet är en icke-överlevnad förfarande med euthanization av djuret vid slutet av experimentet med en överdos av pentobarbital (100 mg / kg) intravenöst.

2. Kirurgisk placering av vaskulära katetrar vid ljumsken (figur 1)

1. Göra en lång 2-3cm snitt i höger ljumske.
2. Dissekera 1cm av rätten femorala venösa och 1cm right lårbensartären. Sätt två 3-0 strängar runt varje kärl.
3. Högra femorala venös kateterisering: Ligera distala av venen. Sätt i en Argyle kateter (3,5 eller 5 franska, dubbel-lumen) (Covidien, Mansfield, MA) till 15cm och detta kommer att ställa till höger förmak. Knyt båda strängar för att säkra katetern. Katetern kan användas för underhåll vätska och mediciner infusion (sekundära porten) och centrala venösa / höger förmak mätning (primär port).
4. Högra femorala arteriell katetrisering: Ligera distala av artären. Lyft upp den proximala strängen för att stoppa blodflödet. Sätt i en Argyle kateter (3,5 eller 5 franska, singel-lumen) till 5 cm. Detta kommer att placera den arteriella katetern vid infra-renala aorta för kontinuerlig medelartärtryck mätning och blodprovstagning. Knyt båda strängar för att säkra katetern.
5. Stäng huden.

3. Upprätta mekanisk ventilation (figur 2)

1. Göra en lång 2-3cm horisontellsnitt i nacken.
2. Dissekera och exponera 1cm av luftstrupen. Sätt två 1-0 strängar runt luftstrupen.
3. Sätt en endotrakealtub (3,0 eller 3,5) vid 1 cm in i luftstrupen. Anslut till en respirator och börja mekanisk ventilation. Säkra endotrakealtuben.
4. Dissekera och exponera den gemensamma karotidartären. Omringa kärlet med en genomgångstid ultraljud flödesprob (2SB eller 2RB, Transonic Systems Inc., Ithica, NY) för att kontinuerligt mäta blodflödet.

4. Placering av flödet sonder vid överlägsen mesenteriska (Figur 3) och vänster nedsatt (Figur 4) artärer

1. Extra doser av fentanyl (0,01-0,02 mg / kg) (5-10 mikrogram / kg) och acepromazin krävs är före hudsnitt.
2. Göra en lång subcostal-flanken snitt och noggrant dissekera muskler lager.
3. Exponera bukaortan.
4. Minimera vaskulär hantering (vasospasm) och lymfatiska skada.
5. Dissekera 0,5-1cm mesenterica superior ochsätta en Transonic flödesprob (3SB) runt den.
6. Dissekera 0,5-1cm vänstra njurartären och sätta en Transonic flödesprob (2SB) runt den.
7. Stäng huden och säkra flödet sonden.

5. Placering av lungartären kateter (fig. 5) och flödessond (figur 6)

1. Extra doser av fentanyl (0,01-0,02 mg / kg) (5-10 mikrogram / kg) och acepromazin krävs är före hudsnitt.
2. Lie djuret vid rätt sidoläge.
3. Torakotomi vid den vänstra 4:e interkostalrummet.
4. Se upp för den interna bröst artär och ven, ligera om det behövs.
5. Använd en tand svabb att trycka ner vänster lunga och öka syre som behövs.
6. Öppna hjärtsäcken.
7. Identifiera ductus arteriosus som löper från lungartären till aorta.
8. Ductus arteriosus kan ligeras genom att placera ett klipp eller en tjock "3-O silke" slips på dess ursprung.
9. Gratis huvudsakliga lungartären och passera AVascular sele med en tjock "0" slips.
10. Gör en handväska sträng (5-0 prolen) sutur vid basen för placering av lungartären kateter.
11. Sätt i ett 20G angiokat (med 3 sidohål på mindre 1 cm från spetsen av katetern) genom handväska sträng till maximalt 1 cm.
12. Kontrollera om fritt flöde av venöst blod.
13. Anslut till tryckgivare, kontrollera lungartärtrycket och vågform.
14. Dra väskan strängen och säkra pulmonell katetern.
15. Placera en Transonic flödesprob (6SB) runt den huvudsakliga lungartären.
16. Placera ultraljud gel mellan flödet sonden och artär för att möjliggöra optimal signalöverföring.
17. Täcka såret med fuktig gasväv saltlösning.

6. Hypoxi och ny syresättning protokoll

1. Minska den inandade syrgaskoncentrationen till 10% genom att öka koncentrationen av inhalerad kvävgas för att inducera hypoxemi.
2. Justera inspirerade syrekoncentration mellan 10% och 15% för att erhålla en PAO ₂ av 20-40 mm Hg eller SAO ₂ av 30-40% i 2 timmar.
3. Utför arteriell blodanalys för att bedöma paco ₂ och justera fläkt hastigheten därefter.
4. Med induktionen av hypoxemi, är den första timmen tillägnad stadigt inducera en tachycardic (och hjärtminutvolym) svar.
5. Fortsätt att övervaka förändringar i blodflöde vid carotis, mesenterica superior och vänster njurartärerna.
6. Under den andra timmen av hypoxi, är den hypoxisk stress ökade till stadigt lägre hjärtminutvolymen till 30-40% av baslinjen, medelartärtryck till 30-35 mm Hg och arteriellt pH 6,95-7,05.
7. Hypoxisk stress kan vara förtid eller förlängas med 15 minuter så är lämpligt.
8. Öka inspirerad syrekoncentration plötsligt till 100% abrupt genom att sluta kvävgas, samtidigt rent syre.
9. Övervaka hjärtminutvolym, medelartärtryck och andra hemodynamiska paramätare för snabb återhämtning.
10. Återupplivning med 100% syre kan fortsätta under 0,5 timmar. Efter denna tidsperiod, minska den inandade syrekoncentrationen snabbt till 21%.
11. Fortsätt ny syresättning med 21% syre för den återstående perioden av experiment. Den inandade syrekoncentrationen kan titreras till 25% om det behövs.
12. Fluid bolus på 10 ml / kg Ringers laktatlösning kan behövas i förekommande fall under försöksperioden. Dess användning måste protocolized.

7. Representativa resultat:

Induktionen av hypoxemi hos nyfödda smågrisar under den första timmen av hypoxi bör öka hjärtminutvolymen (pulmonell arteriell flöde) till 120% -130% av baslinjen (fig. 7A) och hjärtfrekvens (figur 7B). Normalt bör hjärtminutvolym nå sin kulmen ersättning mellan den första 0,5 h och 1h av hypoxi. Vidare bör blodflöde bli centraliserad resulterar i minskad migsenteric och renal perfusion, men en bevarad eller ökad carotis arteriell flöde (Figur 8). Under den andra timmen av hypoxi, finns det en stadig minskning av hjärtminutvolymen, utveckling av hypotension (figur 9A), långsam hjärtfrekvens med eller utan arytmi förekom. Hypoxi bör inducera pulmonell hypertension med ökat lungartärtryck (figur 9B), som ibland kan sänka i den slutliga 30 minuter av hypoxi som hjärtminutvolymen minskar.

Vid återupplivning kommer alla hemodynamiska parametrar återhämta omedelbart normoxisk baslinjen, förutom renalt blodflöde som gradvis återhämtar över den första timmen av ny syresättning. Emellertid kommer de hemodynamiska parametrarna speciellt för hjärtminutvolym och medelartärtryck försämras gradvis över de första 2 timmen av ny syresättning till ca 70-75% av normoxisk baslinjen och 35-45 mmHg. Denna hjärt dysfunctipå är åtminstone delvis för myokardiala fantastiska och teckningsoptioner kardiovaskulära stödjande terapier såsom vasoaktiva och inotropa.

Figur 1: Ljumske snitt med placeringen av femorala arteriella och venösa katetrar

Figur 2: Hals snitt med placeringen av en endotrakealtub och en flödessond runt den gemensamma halsartären

Figur 3: Flank snitt med isoleringen av mesenterica superior

Figur 4: Flank snitt med isoleringen av vänstra njurartären

Figur 5: Torakotomi med placeringen av lungartären kateter

Figur 6: Torakotomi med placeringen av en Transonic flödesprob runt huvud lungartären

Figur 7: tidsmässiga förändringar i (A) hjärtminutvolymen (pulmonell arteriell flöde) och (B) hjärtfrekvens under hypoxi och ny syresättning

Figur 8: tidsmässiga förändringar i blodflödet i (A) carotis, (B) överlägsen mesenteriala och (C) vänster njurartärerna under hypoxi och ny syresättning

Figur 9: Temporalförändringar i (A) medelartärtryck och (B) lungartärtryck under hypoxi och ny syresättning

Discussion

Den nuvarande försöksprotokoll har en fördel att undersöka systemiska och regionala hemodynamiska förändringar neonatala patienter under hypoxi och ny syresättning process. Vi kan också undersöka respektive effekten av interventioner som används för att förbättra den kardiovaskulära funktionen under återhämtning. Vi och andra har rapporterat erfarenheter och resultat i studien av neonatal asfyxi angående kardiovaskulär ^{1, 2} pulmonell, neurologisk ^3, mag ^4, lever ^5, njur ^6, binjure ⁷ och hematologiska ^8-system. Det är viktigt att förstå den kardiovaskulära funktionen med information som bygger på kontinuerliga data mätningar är det svårt tekniskt om inte omöjligt att kirurgiskt instrument små djur som gnagare eller marsvin. Senaste framsteg inom teknik som ultraljud och realtid avbildning kan dock övervinna några av dessa challenges. Trots stora och medelstora djur kan också samtidig insamling av biologiska prover, inklusive plasma-och vävnadsprover under försöksperioden. Denna ytterligare biologisk provtagning kommer att tillåta biokemiska analyser och histologisk undersökning som hjälper förståelsen av pato-fysiologi och farmakologi hypoxi och ny syresättning. Även om det primära syftet med in vivo djurmodeller kan vara studier av pato-fysiologisk funktion av ett enda organ, är det viktigt att förstå det i samband med orgel-organ interaktion. Exempelvis är växelverkan mellan den hjärtfunktion och pulmonell hypertension eller leverdysfunktion viktigt i en multi-organdysfunktion som av neonatal asfyxi ^9. Det nyfödda lamm är ett alternativ till svin i de gemensamma djurmodeller används för att studera neonatal asfyxi. Den brådmogna utveckling och begränsad kullstorlek på nyfödda lamm kan dock begränsa en mer generell användning än nyfödda grislets, som motsvarar den av 38 veckors graviditet mänskligt foster och har cirka 10 per kull ^10,11. Trots nyfödda smågrisar är de mest använda djur efter gnagare i studien av neonatal asfyxi.

Det finns dock begränsningar i denna svin modell av neonatal asfyxi, förutom utmaningen i samband med omräkning av resultat genereras från djurstudier till människa. Effekten av anestesi och kirurgisk stress som den akuta inställningen kan minimeras med en lämplig stabiliserande tid, lämplig användning av anestetiska läkemedel, raffinerade kirurgiska tekniker samt införandet av skenopererade kontrolldjur för jämförelse. Förlänga den experimentella perioden efter dagar behövs för att undersöka om någon akut hemodynamisk effekt kommer att finnas kvar på lång sikt. I själva verket har vi varit framgångsrik i att modifiera det experimentella protokollet till förlängd subakut (t.ex. 48-72 timmar) ^12, överlevnad (5-7 dagar) ¹³ 14, stoppa mekanisk ventilation ¹⁵ och tillägget av halspulsådern ocklusion för cerebral ischemi. Vi försöker göraden hypoxi och ny syresättning kliniskt relevant. Experimentet har 2h av hypoxi, som är ungefär den tid som krävs för akut kejsarsnitt för fosterpåverkan utan klinisk blödning baserad på personlig iakttagelse. Den återupplivning initieras med 100% syre under 30 minuter, istället för 60 minuter i våra tidigare studier. Det är att begränsa hyperoxi som fortfarande vanligt i många EU-sjukhus före ankomsten av neonatal transport team. Inledande ny syresättning med 21% syre kommer att följa den nyligen uppdaterade riktlinjer för användning av extra syrgas i neonatal återupplivning ^16.