Un modelo porcino de la asfixia neonatal

Summary

Modelos de animales grandes tienen buenos valores de traslación en el examen de fisiología y farmacología de la asfixia neonatal. Utilizando los lechones recién nacidos, desarrollamos un protocolo experimental para simular asfixia neonatal que tiene ventajas de estudiar la hemodinámica sistémica y regional, el transporte de oxígeno a las vías bioquímicas y patológicas y correlaciones.

Abstract

Anualmente más de 1 millón de recién nacidos mueren en el mundo en relación a la asfixia. Recién nacidos asfixiados suelen tener un fallo multiorgánico, incluyendo hipotensión, déficit de perfusión, la encefalopatía hipóxico-isquémica, hipertensión pulmonar, enterocolitis vasculopática, insuficiencia renal y las complicaciones tromboembólicas. Los modelos animales se han desarrollado para ayudarnos a comprender la fisiopatología y farmacología de la asfixia neonatal. En comparación con los roedores y los corderos recién nacidos, los lechones recién nacidos ha demostrado ser un valioso modelo. El lechón recién nacido tiene varias ventajas, incluyendo el desarrollo similar a la de 36 a 38 semanas el feto humano con los sistemas del cuerpo comparable, el tamaño corporal grande (~ 1,5-2 kg al nacer) que permite la instrumentación y el seguimiento de los animales y el control de las variables de confusión alteraciones hemodinámicas y la hipoxia.

Se describen un protocolo experimental para simular asfixia neonatal y nos permite examinar los cambios hemodinámicos sistémicos y regionales durante el proceso de asfixia y reoxigenación, así como los respectivos efectos de las intervenciones. Además, el modelo tiene la ventaja de estudiar un fallo multiorgánico o disfunción de forma simultánea y la interacción con varios sistemas del cuerpo. El modelo experimental es un procedimiento no-supervivencia que consiste en la instrumentación quirúrgica de los lechones recién nacidos (1-3 días de edad y de 1.5 a 2.5 kg de peso, de raza mixta) para permitir el establecimiento de ventilación mecánica, vascular (arterial y venosa central) el acceso y la colocación de catéteres y sondas de flujo (Transonic Inc.) para el seguimiento continuo de la presión intra-vascular y el flujo sanguíneo a través de las arterias carótidas principales diferentes, incluyendo pulmonar, común, mesentérica superior y la izquierda las arterias renales. El uso de estos lechones cirugía instrumentada, después de la estabilización de 30-60 minutos como se define por la variación de Z <10% en los parámetros hemodinámicos y los gases sanguíneos normales, se iniciará un protocolo experimental de hipoxemia grave que es inducida por la hipoxia alveolar normocápnicos. El lechón se ventila con un 10-15% de oxígeno al aumentar la concentración inhalada de gas nitrógeno durante 2 horas, con el objetivo de saturación arterial de oxígeno del 30-40%. Este grado de hipoxemia se produce la asfixia clínica con acidosis metabólica severa, hipotensión sistémica y shock cardiogénico con hipoperfusión de los órganos vitales. La hipoxia es seguido por la reoxigenación con oxígeno al 100% de 0.5h y 21% de oxígeno para 3.5h. Las intervenciones farmacológicas pueden ser introducidos en su momento y sus efectos investigados en un estudio ciego, aleatorizado en bloques de la moda.

Protocol

1. Anestesia

1. Ajuste el caudal de la máquina de anestesia en 2L/min. Conecte el tubo de escape de succión al vacío.
2. Cargo máscara con gases anestésicos (isoflurano) en un 5% (~ 3 min).
3. Los lechones recién nacidos se inducirá con isoflurano inhalado 5% de oxígeno al 100% (~ 3 min).
4. Mantenimiento de la anestesia en un 2-3% de isoflurano. Ajuste fino de isoflurano en un 0,5% según el caso, sin embargo, puede variar de 0,5 a 5% dependiendo de la condición de los lechones.
5. Una vez que el acceso vascular se ha establecido, la anestesia inhalatoria se puede cambiar a anestesia intravenosa con fentanil (5-50 mcg / kg / h) y midazolam infusiones (200-500 mcg / kg / h). Pancuronio (50 a 100 mcg / kg / h) puede ser necesaria para controlar los movimientos excesivos del músculo durante la cirugía, mientras que la capacidad de observar el estado del animal se mantiene en el ajuste de los fármacos anestésicos.
6. El lechón es supervisado por la oximetría de pulso (saturación percutánea de oxígeno en el 95-100%) y ECG (frecuencia cardiaca en 130 a 170 latidos / min).
7. La temperatura rectal del lechón se mantiene a 38-40 º C con una manta de calefacción y calentador radiante.
8. El estado anestésico de los lechones se evalúan periódicamente durante todo el período experimental utilizando neurológicos (tamaño de la pupila, lagrimeo, movimientos corporales), conductuales (agitación), cardiovascular (taquicardia e hipertensión) y los parámetros respiratorios (taquipnea), según corresponda. Parálisis mínima se le da. La experiencia previa de la anestesia en los lechones con y sin parálisis sería útil para la evaluación.
9. El protocolo es un procedimiento no-supervivencia con la eutanasia de los animales al final del experimento con una sobredosis de pentobarbital (100 mg / kg) por vía intravenosa.

2. La colocación quirúrgica de catéteres vasculares en la ingle (Figura 1)

1. Hacer un largo de 2-3cm incisión en la ingle derecha.
2. Diseccionar 1 cm de la venosa femoral derecha y 1 cm de la arteria femoral derecha. Coloque dos cuerdas alrededor de 3-0 cada buque.
3. Cateterización venosa femoral derecha: Ligar la parte distal de la vena. Insertar un catéter de Argyle (3,5 o 5 franceses, de doble lumen) (Covidien, Mansfield, MA) a 15 cm, siendo este lugar en la aurícula derecha. Ate las dos cadenas para asegurar el catéter. El catéter se puede usar para líquidos de mantenimiento y la infusión de medicamentos (puerto secundario) y venosa central / medición de la presión auricular derecha (puerto principal).
4. Cateterización arterial femoral derecho: Ligar la parte distal de la arteria. Levante la cadena proximal para detener el flujo de sangre. Insertar un catéter de Argyle (3,5 o 5 franceses, de una sola luz) a 5 cm. Esta acción coloca el catéter arterial en la aorta infra-renal de la medición continua de la presión arterial media y la extracción de sangre. Ate las dos cadenas para asegurar el catéter.
5. Cerca de la piel.

3. Establecer ventilación mecánica (Figura 2)

1. Hacer un largo de 2-3cm incisión horizontal en el cuello.
2. Disección y exposición de 1 cm de la tráquea. Ponga dos cadenas 1-0 alrededor de la tráquea.
3. Insertar un tubo endotraqueal (3.0 o 3.5) a 1 cm en la tráquea. Conectarse a un respirador artificial y comenzar la ventilación mecánica. Asegure el tubo endotraqueal.
4. Diseccionar y exponer la arteria carótida común. Rodean el buque con una sonda de ultrasonido el tiempo de tránsito del flujo (2SB o 2RB, Transonic Systems Inc., Ithica, NY) para medir continuamente el flujo de sangre.

4. Colocación de sondas de flujo a mesentérica superior (Figura 3) y renal izquierda (Figura 4) las arterias

1. Dosis adicionales de fentanilo (5-10 mcg / kg) y acepromacina (0,01-0,02 mg / kg) son obligatorios antes de la incisión de la piel.
2. Hacer una larga incisión subcostal flanco y diseccionar cuidadosamente las capas musculares.
3. Exponer la aorta abdominal.
4. Minimizar la manipulación vascular (vasoespasmo) y lesiones linfático.
5. Diseccionar 0.5-1cm arteria mesentérica superior y poner una sonda de flujo Transonic (3SB) a su alrededor.
6. Diseccionar 0.5-1cm arteria renal izquierda y poner una sonda de flujo Transonic (2SB) a su alrededor.
7. Cerca de la piel y seguro que la sonda de flujo.

5. Colocación de catéter de arteria pulmonar (Figura 5) y caudal de la sonda (Figura 6)

1. Dosis adicionales de fentanilo (5-10 mcg / kg) y acepromacina (0,01-0,02 mg / kg) son obligatorios antes de la incisión de la piel.
2. Se encuentran los animales en la posición de lateral derecho.
3. Toracotomía en el cuarto espacio intercostal izquierdo.
4. Tenga cuidado con la arteria mamaria interna y la vena, si es necesario ligar.
5. Use un hisopo dental para presionar hacia abajo el pulmón izquierdo y el aumento de oxígeno según sea necesario.
6. Abrir el pericardio.
7. Identificar el conducto arterioso, que va desde la arteria pulmonar con la aorta.
8. Ductus arterioso puede ligarse mediante la colocación de un clip o por una gruesa "3-O de la seda" empate en su origen.
9. Libre de la arteria pulmonar principal y pasar avhonda ascular con un grosor "0" empate.
10. Realice una bolsa de tabaco (5-0 Prolene) de sutura en la base para la colocación de catéter de arteria pulmonar.
11. Inserte un 20G angiocath (con 3 orificios laterales a menos de 1 cm desde la punta del catéter) a través de la bolsa de tabaco a un máximo de 1 cm.
12. Compruebe que el libre flujo de la sangre venosa.
13. Conectarse a un transductor de presión, control de la presión arterial pulmonar y la forma de onda.
14. Apriete la bolsa de tabaco y asegurar el catéter pulmonar.
15. Colocar una sonda de flujo Transonic (6SB) alrededor de la arteria pulmonar principal.
16. Coloque el gel ultrasónico entre la sonda de flujo y de la arteria para permitir que para la transducción de señal óptima.
17. Cubra la herida con una gasa húmeda salina.

6. La hipoxia y reoxigenación protocolo

1. Disminuir la concentración de oxígeno inspirado del 10% al aumentar la concentración de nitrógeno gaseoso inhalado para inducir a la hipoxemia.
2. Ajustar la concentración de oxígeno inspirado entre 10% y 15% para obtener una PaO ₂ de 20-40 mmHg o SaO ₂ de 30-40% durante 2 horas.
3. Realizar un análisis de sangre arterial para evaluar la PaCO ₂ y ajustar la velocidad del ventilador en consecuencia.
4. Con la inducción de la hipoxemia, la primera hora se dedica a la inducción de una taquicardia constante (y el gasto cardíaco) respuesta.
5. Continuará monitoreando los cambios en el flujo sanguíneo en la arteria carótida común, mesentérica superior y la izquierda las arterias renales.
6. Durante la segunda hora de la hipoxia, el estrés hipóxico es mayor para reducir progresivamente el gasto cardíaco al 30-40% del valor basal, presión arterial media de 30 a 35 mmHg y pH arterial 6,95 a 7,05.
7. Estrés hipóxico puede ser terminado prematuramente o ampliarse en 15 min, según corresponda.
8. Aumentar la concentración de oxígeno inspirado abruptamente al 100% por la interrupción abrupta de gas nitrógeno, sin dejar de oxígeno puro.
9. Monitorear el gasto cardiaco, presión arterial media y otros parámetros hemodinámicos para una rápida recuperación.
10. Reanimación con oxígeno al 100% se puede continuar por 0.5h. Después de este período de tiempo, reducir la concentración de oxígeno inspirado rápidamente al 21%.
11. Continuar con la reoxigenación del 21% de oxígeno para el resto del período del experimento. La concentración de oxígeno inspirado se puede valorar a un 25% si es necesario.
12. Bolos de líquido de 10 ml / kg de solución de Ringer lactato puede ser necesaria en su caso durante el período experimental. Su uso debe ser protocolizado.

7. Los resultados representativos:

La inducción de la hipoxemia en el lechón recién nacido durante la primera hora de la hipoxia debe aumentar el gasto cardiaco (flujo arterial pulmonar) al 120% -130% del valor basal (Figura 7) y la frecuencia cardiaca (Figura 7). Por lo general, el gasto cardíaco debe alcanzar su pico de compensación entre la primera y la 1h 0.5h de la hipoxia. Además, el flujo de sangre debe ser centralizado que resulta en disminución de la perfusión renal y mesentérico pero conservado o aumentado el flujo de la arteria carótida común (Figura 8). Durante la segunda hora de la hipoxia, hay una disminución constante del gasto cardíaco, el desarrollo de hipotensión (Figura 9), la desaceleración de la frecuencia cardíaca con o sin arritmia ocurrió. Hipoxia debe inducir a la hipertensión pulmonar con aumento de la presión arterial pulmonar (Figura 9), que a veces puede disminuir en los últimos 30 min de hipoxia a medida que disminuye el gasto cardíaco.

Tras la reanimación, todos los parámetros hemodinámicos de inmediato se recuperará con el inicio normoxic, a excepción del flujo sanguíneo renal que poco a poco se recupera durante la primera hora de reoxigenación. Sin embargo, los parámetros hemodinámicos, especialmente para el gasto cardíaco y la presión arterial media se deteriora gradualmente durante las primeras 2 horas de la reoxigenación de cerca de 70-75% del valor basal normoxic y 35-45 mmHg, respectivamente. Esta disfunción cardiovascular por lo menos en parte, por el aturdimiento miocárdico y garantiza tratamientos cardiovasculares de apoyo tales como vasoactivos e inotrópicos.

Figura 1: en la ingle de la incisión con la colocación de catéteres femorales arterial y venosa

Figura 2: incisión en el cuello con la colocación de un tubo endotraqueal y una sonda de flujo alrededor de la arteria carótida común

Figura 3: en el flanco de la incisión con el aislamiento de la arteria mesentérica superior

Figura 4: flanco de la incisión con el aislamiento de la arteria renal izquierda

Figura 5: La toracotomía con la colocación de catéter de arteria pulmonar

Figura 6: La toracotomía con la colocación de una sonda de flujo Transonic alrededor de la arteria pulmonar principal

Figura 7: Los cambios temporales en (A) el gasto cardiaco (flujo arterial pulmonar) y (B) de la frecuencia cardíaca durante la hipoxia y reoxigenación

Figura 8: Los cambios temporales en el flujo de sangre en (A) carótida común, (B) y la mesentérica superior (C) las arterias renal izquierda durante la hipoxia y reoxigenación

Figura 9: Los cambios temporales en (A) la presión arterial media y (B) la presión arterial pulmonar durante la hipoxia y reoxigenación

Discussion

El protocolo experimental actual tiene una ventaja para examinar los cambios hemodinámicos sistémicos y regionales en temas neonatal durante el proceso de hipoxia y reoxigenación. También puede examinar el efecto correspondiente de las intervenciones utilizadas para mejorar la función cardiovascular durante la recuperación. Nosotros y otros han informado de la experiencia y los resultados en el estudio de la asfixia neonatal respecto a los efectos cardiovasculares de ^{1, 2} pulmonares, neurológicos ^{3, 4} gastrointestinales, hepáticas ^{5, 6} renales, suprarrenales ⁷ y ⁸ sistemas hematológicos. Si bien es importante para entender la función cardiovascular con información basada en datos de mediciones continuas, es técnicamente difícil, sino imposible, instrumento quirúrgico de pequeño tamaño los animales tales como roedores o conejillos de indias. Avance reciente en tecnologías como la ecografía y las imágenes en tiempo real, sin embargo, pueden superar algunos de estos desafíos. Sin embargo, los animales de gran tamaño también permite la recolección simultánea de muestras biológicas, incluyendo muestras de plasma y tejidos durante el período experimental. Este muestreo biológico adicional permitirá a los ensayos bioquímicos y el estudio histológico que ayudan a la comprensión de la fisiopatología y farmacología de la hipoxia y reoxigenación. Si bien el objetivo principal de modelos animales in vivo puede ser el estudio de la pato-fisiológico función de un sistema único cuerpo, es importante para entender en el contexto de la interacción del órgano de órgano. Por ejemplo, la interacción entre la función cardiaca y disfunción hipertensión pulmonar o hepática es importante en una disfunción de múltiples órganos como el de la asfixia neonatal ^9. El cordero recién nacido es una alternativa a los cerdos en los modelos animales comunes que se utilizan para estudiar la asfixia neonatal. El desarrollo precoz y el tamaño de camada limitado de corderos recién nacidos sin embargo, puede restringir a un uso más generalizado de los lechones recién nacidos, que corresponden a la de 38 semanas de gestación del feto humano y contar con un 10 por camada ^10,11. Sin embargo, los lechones recién nacidos son los animales más utilizados después de los roedores en el estudio de la asfixia neonatal.

Sin embargo, hay limitaciones de este modelo porcino de asfixia neonatal, además de el desafío relacionado con la traducción de los resultados generados a partir de los estudios en animales a humanos. El efecto de la anestesia y el estrés quirúrgico en cuanto a la fase aguda pueden ser minimizados con un adecuado período de estabilización, el uso apropiado de medicamentos anestésicos, refinadas técnicas quirúrgicas, así como la inclusión de los animales de control de operación simulada para la comparación. Prolongar el período experimental más allá de días que se necesita para investigar si los efectos hemodinámicos agudos se mantendrá en el largo plazo. De hecho, hemos tenido éxito en la modificación del protocolo experimental para subaguda más (por ejemplo 48-72 horas) ^12, la supervivencia (5-7 días) ^13, así como los estudios crónicos instrumentado. En estos protocolos prolongada, la hipoxia y cuidado de cuidados intensivos médicos y de enfermería son importantes para minimizar la mortalidad y la morbilidad. Por otra parte, la ligadura del conducto arterioso persistente es importante el uso del flujo de la arteria pulmonar como un sustituto del gasto cardiaco, aunque hay un flujo mínimo a través del conducto durante la hipoxia y reoxigenación en estos lechones recién nacidos. La precisión de la estimación de la resistencia vascular pulmonar mejorará con la canulación de la aurícula izquierda para la medición simultánea de la presión de la aurícula izquierda. En comparación con nuestro protocolo de hipoxia, hipercapnia, la combinación de la hipoxia severa mejor que simular asfixia clínica. Aparte de la hipoxia alveolar como en el protocolo actual, otros métodos para inducir la hipoxia incluyen la creación de neumotórax ^14, detener la ventilación mecánica ¹⁵ y la adición de oclusión de la arteria carótida para la isquemia cerebral. Tratamos de hacer que la hipoxia y reoxigenación clínicamente relevantes. El experimento incluye 2 horas de la hipoxia que se aproximan a la duración requerida para la cesárea de urgencia por sufrimiento fetal, sin hemorragia clínica basada en la observación personal. La reanimación se inicia con oxígeno al 100% durante 30 minutos, en lugar de 60 minutos en nuestros estudios anteriores. Esto es para limitar la hiperoxia que sigue siendo una práctica común en muchos hospitales de la comunidad antes de la llegada del equipo de transporte neonatal. Reoxigenación inicial con 21% de oxígeno se siga la guía recientemente actualizada sobre el uso de oxígeno suplementario en la reanimación neonatal ^16.