Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Процедуры для Крысы doi: 10.3791/3167 Published: October 15, 2011

Summary

Это видео демонстрирует хирургической подготовки и процедуры, необходимые для изучения сократительной реакции крыс медиальная подготовки икроножной мышцы

Abstract

Есть много случаев, когда желательно получить сократительная реакция скелетных мышц при физиологических условиях: нормальное кровообращение, нетронутыми все мышцы, при температуре тела. Это включает в себя изучение сократительные ответы, как posttetanic потенцирования, подъезд и усталость. Кроме того, последствия лечения заболеваний, употребления, травмы, профессиональная подготовка и препарат может представлять интерес. Это видео демонстрирует соответствующие процедуры, чтобы настроить и использовать этот ценный подготовки мышц.

Чтобы установить этот препарат, животное должно быть под наркозом, и медиальной икроножной мышцы хирургическим изолированные, с началом нетронутыми. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить кровь и нервные запасы. Длинный участок седалищного нерва очищается от соединительной ткани и разорвал проксимально. Все ветви дистальной культи, которые не иннервирует медиальную икроножной мышцы порваны. Дистальной культи нерва inserТед в манжете выложены из нержавеющей стали стимулирующим провода. Пяточной кости отделяется, оставляя небольшой кусочек кости еще привязаны к ахиллова сухожилия. Sonometric кристаллов и / или электроды для электромиографии может быть вставлен. Иммобилизация металлическими зондами в бедра и голени препятствует движению мышц происхождения. Ахиллово сухожилие прикрепляется к датчиком силы и ослабил кожа подтягивается по сторонам, чтобы сформировать контейнер, наполненный нагретым маслом парафина. Нефти распределяет тепло равномерно и сводит к минимуму потери тепла испарительного. Тепла лампы направлена ​​на мышцы, а мышцы и крысы могут нагреваться до 37 ° С. В то время как прогревается, максимальное напряжение и оптимальная длина может быть определена. Они важны начальные условия для любого эксперимента по нетронутым целый мышцы. Эксперимент может включать в себя определение стандартных сократительные свойства, такие как сила, частота отношения, сила длиной отношения, и сила-скорость отношений. С осторожностью в хирургической изоляции, иммобилизация происхождения мышц и выравнивание мышц и сухожилий устройство с датчиком силы, и надлежащего анализа данных, измерения высокого качества могут быть получены с этой мышцей подготовки.

Protocol

1. Введение

  1. Макинтош лаборатория использует медиальной икроножной мышцы подготовку в течение нескольких лет, а до этого, весь икроножной мышцы подготовки, разработанные с доктором Филом Gardiner 1.

2. Анестезия

  1. Взрослые Sprague-Dawley крыс (200-300 г) обычно используются в нашей лаборатории для изучения свойств сократительного на месте. Крыса может быть ограничен в плексиглас устройства, имеющиеся в продаже, или покрытие с полотенцем и, держа.
  2. Мы используем кетамин / ксилазина, (100 мг · мл -1, каждого) смешиваются в 85:15 и администрирования 0,1 мл на 100 г веса крысы внутримышечно 2,3. Пентобарбитала натрия (50-60 мг · кг -1, intraperiteneal) или изофлурана (2-3,5%, ингаляционные), также могут быть использованы 4.
  3. В то время как анестетик вступления в силу, точный вес может быть получена и левой задней конечности побрился. Это также хороший тимэлектронной, чтобы убедиться, все электроника включен и готов. Это включает в себя компьютер, усилитель тензодатчиков, масляный обогреватель и другие.
  4. Проверка на возвращение рефлекс периодически и дополнять по мере необходимости анестезии (0,05 до 0,1 мл на 100 г).

3. Начало хирургии

  1. Мы используем оргстекло платформа, на которой для иммобилизации крыс на операцию. Простой клейкую ленту делает свое дело. Будьте уверены, что животное простиралась от левой задней конечности на правой передней лапы. Добавить каплю смазки на глазах. Мы используем парафинового масла. В противном случае глаза будут высыхать с кетамином анестезию.
  2. Небольшое хирургическое свет полезен. Это одна излучает достаточно тепла, чтобы помочь сохранить животных теплой. Кроме того, одеяло нагрева воды может быть использована. Убедитесь в том, роговицы или ног щепотку рефлексы отсутствуют, прежде чем продолжить. Стерильная техника не нужна, потому что эта процедура является острой. Животное не выйдет из наркоза. Мы усыпить крысу с анестетикомПередозировка (0,2 мл, внутрисердечных), когда все процедуры будут завершены.
  3. Первый разрез через кожу от пятки к позвоночнику. Мы используем ножницы, потому что глубина разреза можно контролировать и ножницы используются, чтобы отделить кожу от нижележащих тканей. Крысы имеют отличные гемостаз, это так долго, как вам избежать крупных кровеносных сосудов, кровотечение будет ограничено. Хранить открытые поверхности покрыты изотонический солевой раствор пропитанной марли, когда это возможно.
  4. После того, как кожа отделяется от подлежащей соединительной ткани, поверхностный слой мышц вырезать. Будьте уверены, чтобы не зайти слишком глубоко, вы не хотите повредить седалищный нерв и кровеносные сосуды, мышцы или интереса. Начать над икроножной мышцы и сократить проксимально, по той же линии, что и разрез кожи. Peek под обнаружить и избежать седалищного нерва. Как только вы видите нерв, вы можете следовать своим путем с разрезом, но при этом оставаться значительно выше нерва. Существует четкая шов между музчастиц. Найдите это, и разрезать вдоль этого шва в направлении колена. Следите за и избежать кровеносных сосудов.

4. Подготовка направляющее отверстие в бедре для костной контактных

  1. Разрезать тонким слоем мышц на хвостовом аспектом бедренной кости, обнажая голую кость. Использование ручной роторный инструмент, сверла, или булавкой вице-(0,9 мм из углеродистой стали бором), сделать небольшое отверстие, через пилотный коры, и только в мозге. Не сверлите слишком глубоко, или чрезмерное кровотечение приведет. Это отверстие будет использоваться в дальнейшем для размещения кости штифт для иммобилизации бедра на миографа базы.

5. Изолировать иннервацию медиальной икроножной мышцы

  1. Следующий шаг требует рассекает микроскопом. Найдите место, где подколенного нерва исчезает позади медиальной икроножной мышцы. Аккуратно разложить различных отраслях, и сократить все, что не иннервируют медиальная икроножная мышца. Иннервация может быть определена microstimulation. На Тхис этапа, а также убедиться, что поверхностные ветви седалищного нерва вырезаны.
  2. Теперь ясно, соединительная ткань от седалищного нерва, поэтому она может быть скользнул в манжете нерва (позже). Будьте уверены, чтобы лечить нервы мягко. Любой участок нерва может привести к inexcitability, и в конце эксперимента преждевременно.

6. Изолировать ахиллова сухожилия и икроножной мышцы

  1. Тупой диссекции, иногда с помощью ножниц, могут быть использованы для разделения икроножной мышцы из других тканей. Сухожилия подошвенной может быть вытащил из-под ахиллова сухожилия, связали и вырезать. Галстук просто использовал, чтобы помочь провести сухожилия и можно срезать сразу после сухожилия вырезать и подошвенной отделена от икроножной мышцы существенную длину. Поместите лигатуры № 1 шелка вокруг ахиллова сухожилия, и галстук в квадратный узел. Не тяните слишком сильно, или сухожилие будет поврежден. Мы используем кости rongeurs сократить calcan EuS, оставив небольшой кусочек кости еще привязаны к ахиллова сухожилия. Храните режущие поверхности горизонтального чтобы убедиться, что кости разрубить, а не только сухожилия. Это гарантирует, ахиллова сухожилия может быть прикреплена к миографа позже.
  2. Вдоль нижней части икроножной мышцы, камбаловидной можно увидеть. Опять же, тупой диссекции может быть использована для разделения камбаловидной мышцы от икроножной мышцы. Мы хотим, чтобы изолировать медиальной икроножной мышцы, так что это только мышцы все еще привязаны к ахиллова сухожилия. Вырезать камбаловидной сухожилия, близко к дистальному концу. Тогда Вы можете отделить медиальной и латеральной икроножной мышцы, и вырезать боковые сухожилия, оставляя только медиальной икроножной мышцы прикреплены к ахиллова сухожилия. Потяните боковой икроножной мышцы от медиальной, а около 50% его длины. Помимо этой длины, волокна пересекаются и повреждение приведет от дальнейшего затягивания. Проверьте, чтобы мышцы не содержит соединительной ткани.
е "> 7. Отрежьте голень

  1. Поместите лигатуру вокруг голени, чуть выше середины. Это должно быть плотным, без разреза в ткани. Второй цикл до связывая помогает предотвратить скольжение. Снова используйте квадратный узел, чтобы обеспечить.
  2. Используя маленькую пилу, вырезать нижнюю часть ноги от отеля. Это сокращение должно быть примерно на полпути вдоль голени.
  3. Вставьте резкое зонда в мозге голени. Этот зонд будет использоваться для иммобилизации голени на миографа базы.
  4. Прикрепите 2 резинки на кожу, используя Мишель клипов. Эти и другие резинки будет использоваться для хранения кожи вокруг мышц, чтобы сформировать контейнер, который будет заполнен с подогретой нефти парафином.

[Необязательный]

8. Вставьте sonometric кристаллов (необязательный шаг) 5

  1. Поместите животное на грелку на низком уровне. Ректального датчика, если он еще не вставлены может быть вставлен в это время. Используйте маленькую каплю парафиновое масло для смазки.
  2. Использование microstimulation, определить концы пучка в мышцах. Ткните на 21 иглой на сайт как происхождение и вставки мышц.
  3. Слайд sonometric кристалл в отверстие, сделанное иглой, и печать с ветеринаром-связи хирургического клея. Используйте очень маленькую каплю клея, убедитесь, что она находится прямо над кристаллом. Применение клея на листе бумаги разрез с острого угла помогает в нанесении клея точно. Мы размещения одной дополнительной кристалла при вставке пучке, что было определено microstimulation.

[ПРОДОЛЖИТЬ]

9. Установите в аппарат (см. Рисунок 1)

  1. Поместите крысу на миографа базы, с большеберцовой кости зонд ориентированы на рычаг. Поместите датчик в держатель, чтобы зафиксировать ногу.
  2. Потяните кожу вверх по сторонам, чтобы сформировать контейнер и закрепите резинкой.
  3. Установите сверло (1/16-й дюйм) в бедренной кости, используя пилотныеотверстие, которое было создано во время хирургической подготовки. Убедитесь, что вы поддерживаете бедренной кости на передней части, как вы разместите сверло (в контактный заместитель), как поломка может привести к бедренной кости, прекращения эксперимента преждевременно. Прикрепите вице-контактный к перекладине для иммобилизации бедра.
  4. Поместите дистальной культи седалищного нерва через нервные стимулирующие манжеты (катода к мышце) и живота назад близко к происхождению мышц. Подключите стимулятором этих проводов.
  5. Прикрепить ахиллова сухожилия к рычагу, который имеет тензометрических датчиков на нем. Галстук ожидающий, но оставить некоторое пространство для последующего регулирования. Будьте уверены, что выравнивание мышцы перпендикулярно с рычагом.
  6. Заполните контейнер образуется в коже с подогретой нефти парафином.
  7. Включите лампу, тепло-и позиция экраны из фольги над головой животного, и датчик силы. Дополнительная щиты фольги могут быть необходимы для обеспечения внутренней температуры животное не Exceред 38 ° C. Длина мышцы могут быть скорректированы, пока провисание струны удалены из связи между медиальной икроножной мышцы и датчиком силы.

10. Установить максимальное напряжение и длина ссылки

  1. В то время как мышцы прогревается, настроить и протестировать стимулятор стимуляция напряжения. Важно, чтобы убедиться, что стимуляция установлена ​​в очень краткие длительность импульса. Мы используем 50 мкс. Максимальное напряжение должно быть не менее 1 В. начиная с 0,5 В, напряжение увеличится до дергаться амплитуда не увеличивается. Максимальное напряжение низкого напряжения, который активизирует все моторные единицы. Мы обычно стимулируют в двойном максимальное напряжение, или 3 в зависимости от того, выше.
  2. Как правило, эксперимент начнется с мышц в длину, что дает крупнейших дергаться сокращения. Подергивание получается с одного стимулирующего импульса. Длина мышцы увеличивается примерно на 1 мм для другого дергаться. Это повторяется до тех пор, подергивание амплитудыувеличивается. После дергаться амплитуда уменьшается, длина будет возвращена к той, что дала наибольшую амплитуду дергаться.
  3. После этой начальной настройки длины, мы тестируем систему с тем, что мы называем "кондиционирование тетаническое сокращения". Стимулятор установлен для доставки импульсы частотой 200 Гц в течение 500 мс. Доставка этого стимуляция приведет к полностью слиты тетаническое сокращения. Сила, порожденная мышцы будут затяните все соединения, в том числе узлов на мышцы. После соответствующего остальное для отвода потенцирование 4 ссылка длина мышцы сброса (см. п. 9.2). Как правило, сокращение кондиционирования тетаническое будет разрешено некоторое сокращение длины пучка, поэтому мышцы должны быть растянут немного, чтобы вернуться в длину, что дает крупнейших сокращение амплитуды дергаться.

11. Начать эксперимент

  1. Типичный эксперимент будет включать в себя длину регных и / или стимуляция различных форм стимуляции. Сбор данных может включать в себя только сила, или сила, длина, вып длину и электромиограммы.

[Необязательный]

12. Силы частотой отношения 2

  1. Установить продолжительность поезд достаточно долго, чтобы достичь плато силы на любой частоте интерес. Максимальная изометрическая сила достигается в медиальной икроножной мышцы при 200 Гц. Поезд продолжительность должна быть не менее 200 мс; дольше лучше для более низких частот, но приведет к некоторой усталости, если несколько сокращений используется для определения полного спектра силу частотой отношения. Обычно мы используем сокращений на 0, 20, 40, 60, 80, 100 и 200 Гц. Этот диапазон частот позволит полный спектр силу частотой отношения должны быть описаны. Подходящий отдыха между сокращениями должно быть позволено, чтобы избежать усталости (1-10 мин).

13. Силы длиной СВЯЗЬIP 6

  1. С оценкам, оптимальная длина установлено ранее, сила, длина отношений может быть определен путем систематического регулировки длины мышцы от -4 до +4 мм мм с помощью серво-двигательного аппарата. Это должно быть сделано с помощью максимальной стимуляции (200 Гц), но мы обнаружили, что очень краткое сокращение приведет к тому же истинная оптимальная длина 7. Субмаксимальной сокращений, как дергается, может быть использован, но это даст разной длины зависимость силы 8.
  2. Важным аспектом определения силы длиной отношений является необходимость оценки пассивной силы в пучке длиной, при котором измеряется сила происходит. Активная сила рассчитывается как разница между общей силы и соответствующие пассивные силы. С параллельной упругих конструкций несут пассивную силу, и они в серии с серией упругой структуры, пассивный вклад силой суммарная сила должна уменьшаться по мере серия ELAЦНТИ структуры растягивается во время сокращения 3. После того, пассивная сила известна всем соответствующим длине мышцы, соответствующие пассивная сила может быть оценена с непрерывным измерением длины с использованием пучка ультразвуковая микрометрия, либо путем оценки соответствия системы измерения и в серии структуры мышц и сухожилий устройства. Если этого не сделать, то оптимальная длина подготовке и пик силы, недооценены.

14. Силы скорости отношений 9

  1. Если вы хотите, чтобы определить силу скорости отношений, необходимо приложить силу преобразователей к системе, которая позволяет управлять либо нагрузка или скорость изменения длины. Самый простой и экономичный способ заключается в использовании атмосферного давления ограничить сокращение к контролируемой нагрузкой. В нашей системе, мышца крепится к рычагу по одну сторону от точки опоры и давление воздуха затрудняет изменение длины на другую сторону. Длина датчика перед быть заняты, так что вы в состоянии обнаружить изменения длины мышцы во время изотонических сокращений. Такое расположение позволяет afterloaded сокращений с пневматическим сопротивление. Двойной танки могут позволить изометрическое сокращение с выходом на изотоническом нагрузки. В общей сложности 15-20 сокращений должна быть получена, с нагрузками от почти без нагрузки максимальной изометрической силы. При установке данных в уравнение, нагрузка выше 90% изометрической не должны использоваться 9.

15. Представитель Результаты:

Примеры сокращений представлена ​​на рисунке 2. Эти сокращения были получены для иллюстрации силы частотой отношения. Расчет пик активной силы из этих сокращений, и построения активной силы в отношении частоты, дает рисунок 3; сила частотой отношения. Данные, представленные на рисунке 2, может быть пригодным к уравнению: AF = с / (1 + е ((AF) / б) + D); AF является активной силой, F является частота и, B, C и D являются постоянными.

Для крыс медиальная икроножной мышцы, половину максимальной частоты стимуляции, как правило, 50-60 Гц в не усталость мышц 2. Результаты будут подходить близко к линии, описываемой уравнением выше.

Рисунок 1
Рисунок 1 аппарат и мышцы настройки. Пневматические установки показана слева, изометрические справа. Рычажной системы показано на рисунке слева крепится к столу, когда перевод динамические схватки желаемого (адаптировано из 13). Шаговый двигатель управляется с помощью компьютера (адаптировано из 14).

Рисунок 2
На рис. 2 Наложенные изометрических сокращений: 20, 40, 60, 80, 100 и 200 Гц. Амплитуда 200 Гц сжатие 8,13 N.

les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/>
На рис. 3 Force-частота отношений: Активная сила сокращений на рисунке 2 приведены и линия представляет собой линию наилучшего.

Discussion

Хорошее качество сократительной результаты могут быть получены при помощи хирургического подготовки, надежного крепления в аппарате и хорошее качество электроники. Когда студент учится этой операции, некоторые общие промахи включают: растяжение седалищного нерва, нарушение кровотока, и чрезмерное кровотечение. Нервы должны быть обработаны с осторожностью, чтобы не повредить. Вы знаете, что вы повредили нерв, если максимальная сила тетаническое при оптимальной длине существенно меньше, чем показано на рисунке 3, или если стимуляция напряжения, необходимого для максимальной активации всех двигательных единиц больше 5 вольт. Это сравнительно легко избежать кровеносных сосудов выступающей этой мышцы во время операции. Нарушение этих судов может произойти, когда сверло в настоящее время размещены в хвостовой поверхности бедра. Если направляющее отверстие не на плоской поверхности бедра, сверло может соскользнуть. Когда это происходит, есть вероятность, что подколенные сосуды получить нарушена. Есликровь бассейнов вокруг мышц после установки, это знак того, что вы нарушили эти сосуды. Обильное кровотечение может возникнуть, если крупные вены режут и не привязаны. Большие вены, чтобы не упустить те, вокруг лодыжки.

На месте подготовки мышц является ценным подходом к изучению мышечной сократительных свойств. Отдельные блоки двигателей может быть активировано 10, но обычно все двигательные единицы активизируются синхронно. Это является недостатком по сравнению с нормальными активации асинхронного что происходит на добровольной вербовки блока двигателя, так что представляет собой ограничение. Тем не менее, на положительной стороне, синхронное активации позволяет количественного средний отклик всех двигательных единиц.

Существуют два подхода, которые были использованы, чтобы избежать синхронной активации. Один заключается в использовании электродов манжеты с несколькими парами стимулирующие провода. Это позволяет активацию часть двигательных единиц с каждой парой,и стимуляция может поворачиваться на пары для достижения асинхронных активации. Этот метод активации могут быть объединены с анодного блока 11, чтобы попытаться активизировать двигательные единицы в соответствующей последовательности в соответствии с принципом 12 размера. При таком подходе все моторные единицы активируются с проксимальной пары электродов и блоков накладывается с постоянным током возбуждения. Амплитуда стимула для блока может быть адаптировано с ингибировать моторных единиц, для которых активация не требуется. Видимо блока влияет на больших аксонов на самом низком напряжении, и постепенно влияет на более мелкие единицы.

На месте подготовке икроножной мышцы крыс является ценным физиологическим подходом к изучению скелетных мышц и биохимические свойства в отношении здоровья и болезни.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Исследования поддерживаются естествознания и техники исследовательского совета Канады.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clippers Good quality pet clippers
Surgical lamp Dyna-Lume Any of several will do
Myograph Custom built
Stimulator Grass Technologies S-88 Any of several will do
Strain gauge amplifier CWE, Inc. PM-1000
Telethermometer YSI YSI-400
Robotic platform Arrick Robotics MD-2
Sonometric amplifier Sonometrics Sonolab
Computer and data collection PC with NI board Custom software (labview)
Block heater Labline Instruments Multi-block
Nerve cuff Custom made
Microstimulator Custom made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacIntosh, B. R., Gardiner, P. F. Posttetanic potentiation and skeletal muscle fatigue: interactions with caffeine. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 65, 260-268 (1987).
  2. Dormer, G. N., Teskey, G. C., MacIntosh, B. R. Force-frequency and force-length properties in skeletal muscle following unilateral focal ischeaemic insult in a rat model. Acta. Physiol. (Oxf.). 197, 227-239 (2009).
  3. MacIntosh, B. R., MacNaughton, M. B. The length dependence of muscle active force: considerations for parallel elastic properties. J. Appl. Physiol. 98, 1666-1673 (2005).
  4. Tubman, L. A., MacIntosh, B. R., Rassier, D. E. Absence of myosin light chain phosphorylation and twitch potentiation in atrophied skeletal muscle. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74, 723-728 (1996).
  5. MacNaughton, M. B., MacIntosh, B. R. Impact of length during repetitive contractions on fatigue in rat skeletal muscle. Pflugers. Arch. 455, 359-366 (2007).
  6. MacNaughton, M. B., MacIntosh, B. R. Reports of the Length Dependence of Fatigue are Greatly Exaggerated. J. Appl. Physiol. 101, 23-29 (2006).
  7. Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Length-dependent twitch contractile characteristics of skeletal muscle. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 80, 993-1000 (2002).
  8. Rack, P. M. H., Westbury, D. R. The effects of length and stimulus rate on tension in the isometric cat soleus muscle. Journal of Physiology. 204, 443-460 (1969).
  9. Devrome, A. N., MacIntosh, B. R. The biphasic force-velocity relationship in whole rat skeletal muscle in situ. J. Appl. Physiol. 102, 2294-2300 (2007).
  10. Drzymala-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of motor unit forces in rat medial gastrocnemius muscle. J Electromyogr. Kinesiol. 20, 599-607 (2010).
  11. Petrofsky, J. S. Control of the recruitment and firing frequencies of motor units in electrically stimulated muscles in the cat. Medical & Biological Engineering & Computers. 16, 302-308 (1978).
  12. Bawa, P., Binder, M. D., Ruenzel, P., Henneman, E. Recruitment order of motoneurons in stretch reflexes is highly correlated with their axonal conduction velocity. Journal of Neurophysiology. 52, 410-420 (1984).
  13. Dormer, G. N. Fundamental Contractil Properties of Skeletal Muscle Following a stroke in a Rat Model. Master's Thesis. University of Calgary. (2008).
  14. MacNaughton, M. B. The Length dependence of Fatigue and of Repetitive Contractions. Master's Thesis. University of Calgary. (2005).
Процедуры для Крысы<em&gt; На месте</em&gt; Скелетных мышц сократительные свойства
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties. J. Vis. Exp. (56), e3167, doi:10.3791/3167 (2011).More

MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties. J. Vis. Exp. (56), e3167, doi:10.3791/3167 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter