通过Alexa Fluor标记技术可视化登革热病毒

摘要

利用荧光染料开发和成像技术的进步，我们设计了一种简单的Alexa Fluor标记登革病毒的方法，以观察病毒与细胞之间的早期相互作用。

摘要

病毒与细胞相互作用的早期事件可能对感染结局产生深远影响。确定影响这种相互作用的因素，有助于更深入地理解疾病的发病机制，从而影响疫苗或治疗方案的设计。因此，开发用于探究这种相互作用的方法将具有重要意义。近年来荧光染料的开发^1-3和成像技术的进步⁴可被加以利用，以增进我们对登革热发病机制的认识，进而为减少每年发生的数百万例登革热感染铺平道路。

登革热病毒具有包膜，其外部支架由90个包膜糖蛋白（E）二聚体组成，用于保护含有单股正链RNA基因组的核衣壳壳层⁵。因此，病毒表面相同的蛋白亚基可用胺反应性染料进行标记，并通过免疫荧光显微镜观察。本文介绍一种简便的标记方法，即将Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯染料直接溶解于碳酸氢钠缓冲液中，用于登革热病毒的标记，标记后病毒仍保持高度活性。目前尚无针对活病毒标记的标准化操作流程，现有染料生产商提供的蛋白标记方案通常要求将染料重悬于二甲基亚砜中。然而，即使微量的二甲基亚砜也可能抑制病毒的有效感染，并诱导细胞毒性⁶。本方案避免使用二甲基亚砜，从而降低了上述风险。与荧光素和罗丹明等常用染料相比，Alexa Fluor染料具有更高的光稳定性和更低的pH敏感性²，因此非常适合用于研究病毒的细胞摄取及内涵体运输过程。Alexa Fluor染料的偶联并不影响病毒特异性抗体及其在宿主细胞中假定受体对标记后登革热病毒的识别⁷。该方法在病毒学研究中具有广泛的应用价值。

方案

1. 登革病毒的Alexa Fluor标记

1. 在标记反应前，使用蔗糖垫纯化登革病毒，并按照方案准备所需的试剂和设备。
2. 在标记前即刻配制新鲜的 0.2 M 碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5，标记缓冲液）和 1.5 M 盐酸羟胺缓冲液（pH 8.3，终止试剂），并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤除菌。
3. 在 2 ml 离心管中，将约 3×10⁸ 斑块形成单位（pfu）的纯化登革病毒溶于 1 ml 标记缓冲液中。可根据需要按比例放大以进行批量病毒标记。
4. 在标记反应前立即用标记缓冲液将冻干的 Alexa Fluor 594（AF594）琥珀酰亚胺酯重悬至 1 mM。根据需要也可选用 Alexa Fluor 染料系列中的其他荧光染料。从该步骤开始应尽量避免光照。
5. 在轻轻用移液枪头搅拌的同时，向稀释后的病毒中加入 100 μl 的 1 mM AF594 染料溶液。
6. 将标记反应混合物在室温下避光孵育 1 小时，每 15 分钟轻柔颠倒混匀一次。
7. 将离心管在台式离心机中短暂离心，然后在轻轻搅拌的同时向反应混合物中加入 100 μl 终止试剂。
8. 继续在室温下避光孵育 1 小时，每 15 分钟轻柔颠倒混匀一次。

2. 纯化Alexa Fluor标记的登革病毒

1. 在此期间，用选定的缓冲液....

讨论

尽管本报告中使用了AF594染料，但Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯系列中还有多种具有类似标记化学性质的荧光染料可供选择。这可以将标记应用扩展到成像以外的领域。对于可被流式细胞仪（FACS）激发并检测的荧光染料，可采用流式细胞术作为共聚焦显微镜的替代方法来评估标记程度。

Alexa Fluor 染料是可与游离氨基（主要为精氨酸和赖氨酸）发生反应的小分子⁹，通常为蛋白质的外向残基。在本实验室中，将登革病毒与100μM Alexa Fluor 594染料偶联，可在病毒滴度损失最小的情况下提供足够的荧光亮度用于成像。通过调整所用染料的浓度，可获得不同的荧光强度。然而，提高染料浓度可能会降低病毒的活性^7,10一个可能的局限性是荧光染料可能阻碍受体结合，从而干扰其结合能力。因此，根据具体应用，应确定最佳标记程度，以在标记效率与功能活性丧失之间取得平衡10。请注意，Alexa Fluor 琥珀酰亚胺酯在包装后的反应性也可能影响其浓度⁸.

本文所述的登革病毒直接标记方法使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297
羟胺	Sigma-Aldrich	159417
氢氧化钠	Merck & Co., Inc.	106498
AF594 琥珀酰亚胺酯	Molecular Probes, Life Technologies	A20004
PD-10 柱	GE Healthcare	17-0851-01
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
FBS	Hyclone	SH30070.03
4 孔板	Nalge Nunc international	176740
盖玻片	Einst	0111520
显微镜载玻片	Sail Brand	7105
3H5 杂交瘤	ATCC	HB46
10x PBS		BUF-2040-10X1L	1st Base
皂苷	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
氯化钙	Sigma-Aldrich	C3306
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Sigma-Aldrich	D27802
台式离心机	Eppendorf	5424
共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
配制 M-199 培养基：向 500 ml M-199 中加入 50 ml FBS、5 ml 丙酮酸钠和 5 ml 非必需氨基酸，经无菌滤器过滤。
配制 M-199 维持培养基：向 500 ml M-199 中加入 15 ml FBS、5 ml 丙酮酸钠和 5 ml 非必需氨基酸，经无菌滤器过滤。