Summary
利用荧光的发展和成像技术，简单的方法，设计可视化早期病毒与细胞之间的相互作用的病毒，登革热的Alexa Fluor标签的进步。
Abstract
感染的结果，在病毒与细胞之间的相互作用的早期事件，可以有深远的影响。确定这种相互作用的影响因素可能会导致改善对疾病发病机理的认识，从而影响疫苗或治疗方案设计。因此，发展的方法来探测这种互动将是有益的的。在荧光团的发展1-3和成像技术，4最新进展，可以被利用来提高我们现有的知识对登革热的发病机制，从而铺平了道路，以减少每年发生登革热感染数以百万计的。
笼罩登革热病毒有一个外部的脚手架90包膜糖蛋白（e）保护核衣壳外壳的二聚体，其中包含一个正链RNA基因组的5组成。病毒表面上的相同的蛋白质亚基，从而可以与胺反应染料标记，并通过免疫荧光显微镜观察。在这里，我们提出了一个标签的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯染料直接溶解，取得了高度可行的病毒后，标签中的碳酸氢钠缓冲登革热病毒的简单方法。没有标准化程序的活病毒和现有的制造商的协议，对蛋白质的标签，通常需要染料在二甲基亚砜重组标签。二甲基亚砜的存在，即使在微量，可以阻止生产的病毒感染，也能诱导细胞的细胞毒作用 6 。排除使用在本议定书中的二甲基亚砜，从而降低了这种可能性。的Alexa Fluor染料具有优异的耐光性和低于常见的染料，如荧光素和罗丹明2，pH敏感，使他们的病毒对细胞的吸收和内体运输研究的理想。的Alexa Fluor染料的共轭不影响病毒特异性抗体，并在宿主细胞内 7公认的受体的识别标记的登革热病毒。这种方法可以在病毒学研究中的有用的应用程序。
Protocol
1。登革热病毒的Alexa Fluor标签
- 标记反应之前，净化与蔗糖垫层登革热病毒，并准备必要的试剂和设备，在协议中表示。
- 准备新鲜0.2M碳酸氢钠缓冲液，pH值8.5（标签缓冲区），1.5M羟胺缓冲液，pH 8.3（停试剂），之前的标签和过滤0.2μm的注射器过滤器消毒。
- 淡化约3X10 8斑形成单位（PFU）登革热病毒的纯化标签在2毫升管的缓冲1毫升。这可缩放比例为一批病毒标签。
- 重组冻干的Alexa Fluor 594标记缓冲液立即标记反应前的琥珀酰亚胺酯（AF594）到1mm。根据人的需要，可以使用的Alexa Fluor染料系列荧光。尽量减少暴露在光线下这一步起。
- 枪头轻轻的搅拌，添加1MM AF594染料100μL稀释病毒。
- 在室温下孵育标签在黑暗中反应1小时组合。由每15分钟的温和的倒置混合。
- 在台式离心机旋转管简单，枪头轻轻的搅拌，添加停止试剂100μL反应混合物。
- 在室温下孵育在黑暗中增加一小时。由每15分钟的温和的倒置混合。
2。净化的Alexa Fluor标记的登革热病毒
- 与此同时，平衡与选择的缓冲区纯化柱。在这个实验中，PD - 10柱25毫升HNE缓冲区（5MM HEPES，150mm的氯化钠，EDTA的0.1MM），pH值7.4，在使用前平衡。
- 应用标记的病毒列的顶部，并开始收集流量通过标记的病毒一旦进入矩阵。 HNE缓冲区的填充柱，所有标记的病毒一旦进入矩阵。弃流过的第一个2.5毫升和收集的旁边标有“病毒的一小部分2毫升。
- 分装和存储AF594标记登革热病毒纯化-80 ° C，远离光源。
- 解冻之一等份，并确定使用前一批标有病毒斑块检测滴度病毒的标记。
- 种子5X10 4 Vero细胞每口井的M - 199生长的培养基中生长，在盖玻片上以及感染前一天的底部的4孔板。
- 删除培养上清100μL卷（中的M - 199维持液稀释）标记病毒的多重感染1感染的细胞10min后在37 ° C。
- 删除的接种，并两次在1xPBS洗盖玻片。
- 在30分钟的3％paraformalydehyde的修复细胞。
- 洗净1xPBS盖玻片3次。
- 通透通透的解决方案的细胞含有皂甙0.1％，并在30分钟1xPBS的5％BSA。
- 孵育的细胞与未稀释的离心澄清3H5单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清在潮湿室1小时，避光。
- 在洗涤缓冲液清洗盖玻片3次（1xPBS含1mm的氯化钙，1毫米氯化镁和0.1％皂素）。
- 孵育细胞与AF488抗鼠IgG抗体，1:100稀释，在通透的解决方案，避光45分钟，在潮湿的室内。
- 在洗涤缓冲液清洗盖玻片3次，并在去离子水冲洗一次。
- 民建联对纸巾排出多余的水分和8μlMowiol 4-88含2.5％的DABCO安装在载玻片，盖玻片边缘。
- 允许使用蔡司共聚焦显微镜才能浏览安装的解决方案，定于4℃过夜。连续并购应进行激动人心的荧光基团，在时间和随之而来的探测器之间切换。
- 图像，然后分析了合作本地化发送蛋白质与标记病毒的抗体，使用蔡司LSM的禅宗软件估计的标签程度的染色。
3。代表性的成果
AF594染料标记的登革热病毒产量的一个例子是如图2所示。通常情况下，不到10倍，从最初的滴度下降，应遵守以下成功的标签。但是，应该指出的是，所有的缓冲区必须做好准备新鲜的标签获得成功的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯应该用于重建后立即，因为他们在8水溶液中发生反应的游离酸水解。
下一步要检查之前，在实验中使用足够的荧光标记病毒。做一个简单的免疫荧光法在Vero细胞和一定程度的标签，可以从病毒的标记与抗- E蛋白抗体染色的合作定位估计。断绝AL细胞进行了检查，在图3所示是一个典型的共聚焦图像。共定位分析证明重叠系数从0.65到0.8不等的LSM的禅宗软件的使用，这表明约65％至80％的病毒粒子与染料标记的图像。
图1.Overall计划描绘登革热病毒程序的Alexa Fluor染料标签 ，首先，有关缓冲区和登革热病毒纯化准备。重组的Alexa Fluor染料和添加标记缓冲液稀释到登革热病毒。反应，然后停止1个小时后，除了停止试剂。随后，纯化标记的病毒是通过体积排阻列删除免费染料。最后，标记的病毒重新滴定斑块的检测和荧光测试。
图2。 AF594标记的登革热病毒等分解冻，重新滴定斑块的检测和它通常小于10倍下降至平均斑块检测前后AF594标签上确定的可行的病毒粒子（PFU / ml）的数量。开始滴度。误差线表示标准偏差的重复。
图3。成长上盖玻片前一天AF594标签在Vero细胞与登革病毒E蛋白的共定位 。细胞与感染登革热AF594标记在教学语言为10分钟1在37 ° C 。随后的细胞固定和抗E抗体标记，和E蛋白（绿色）和AF594标签（红色）的共定位研究。下63X放大倍率，使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜观察荧光信号。比例尺为10μm。黄色表示的共定位等领域，如插图所示。
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Discussion
虽然本报告中使用AF594染料，荧光团的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯系列广泛提供类似的标签化学。这可能会延长超越成像标签的应用。作为替代估计可兴奋和流式细胞仪机检测荧光团的标签程度的共聚焦显微镜，流式细胞仪可用于。
的Alexa Fluor染料小分子的反应，与游离氨基酸组，主要是精氨酸和赖氨酸9，一般向外面临的蛋白质残留。在我们的实验室，100μm的登革热病毒的Alexa Fluor 594染料的共轭成像提供足够的亮度与病毒滴度的损失降到最低。不同亮度，可实现不同浓度的染料。然而，染料浓度的增加可以减少病毒的生存能力 7,10 。一个可能的限制是在受体结合，由于封锁的荧光团访问干扰。因此，根据实际应用，标签的最佳水平来确定，以确保标签和功能abrogation10的程度之间的平衡。千万注意，浓度也被包装后的反应性影响的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯8。
与这里介绍的Alexa Fluor染料登革热病毒的直接标记不要求任何额外的标签步骤，以可视化的病毒，从而消除了间接抗病毒抗体的非特异性染色的可能性。它还可以进行实时跟踪在活细胞成像的内化后的事件。这种方法比较简单，因为共轭是稳定的，它可以用来反对lipophillic荧光染料，如长链carbocyanine1 ,1 -双十八烷基- 3，3，生产和储存多个实验批次标记病毒， 3,3 - tetramethylindodicarbocyanine（DID）或苯乙烯基染料，不能在寒冷的存放超过3天。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作已经由国家医学研究理事会，新加坡的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
