Метилирования ДНК: Модификация бисульфита и анализа

Summary

Золотым стандартом для анализа ДНК метилирования геномной последовательности бисульфита преобразованы ДНК. Этот метод использует преимущества повышенной чувствительности цитозина по сравнению с 5-метилцитозин (5-MEC), чтобы бисульфита дезаминирования в кислой среде. Неметилированный цитозина можно отличить от метилированных цитозина после ПЦР-амплификации геномной ДНК мишени.

Protocol

Бисульфита преобразования протоколов

Стандартный протокол для преобразования 2 мкг геномной ДНК описана ниже. Меньшие или большие количества геномной ДНК (100 пг-200 мкг) также может быть бисульфита успешно лечатся. Эти условия реакции приводит к полной конверсии (99.5-99.7%) почти в каждой последовательности ДНК-мишени ^3.

1. Подготовка ДНК

Подготовка образцов путем инкубации геномной ДНК с бисульфита буфера Лизис ДНК (2 мкг т РНК, 280 нг / мкл протеиназы К, 1% SDS) в общем объеме 18 мкл в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Примечание: Это важно для достижения максимальная конверсия бисульфит, особенно с ДНК, выделенной из клинических образцов, где все еще ​​может быть белка, связанного с ДНК.

2. ДНК Денатурация

1. Денатурировать 2 мкг ДНК в объеме 20 мкл путем добавления 2 мкл свежеприготовленного 3М NaOH до конечной сoncentration 0,3 М.
2. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 15 мин на водяной бане, затем инкубации при 90 ° С в течение 2 мин в тепло блоку. Сразу же месте трубы на льду в течение 5 мин.
3. Центрифуги трубы при температуре 4 ° С в течение 10 с при 10000 г, для обеспечения ДНК в нижней части трубы.

3. Бисульфита дезаминирования

Сульфирования и гидролизного дезаминирования

1. Подготовка свежие решения 10 мМ хинол и насыщенных метабисульфит натрия рН 5,0 (7,6 г Na ₂ S ₂ O ₅ с 464 мкл 10 М NaOH, доливают до 15 мл воды). Решение насыщенных бисульфит натрия достигается путем мягкого обращения реагента / H ₂ O смеси, с минимальным перемешиванием и аэрацией. Если необходимо, отрегулируйте рН с 10 М NaOH, для полного растворения метабисульфит. Примечание: Поскольку это насыщенный раствор, небольшие комочки могут остаться нерастворимые.
2. Добавить 208мкл насыщенного метабисульфит и 12 мкл 10 мМ хинол к денатурированной ДНК (20 мкл), в конечном объеме 240 мкл до конечной концентрации 2.31M bisulphite/0.5mM хинол, рН 5,0. Аккуратно перемешайте все реагенты и центрифуги в течение 10 сек, чтобы обеспечить все капли в нижней части трубы.
3. Наложение образцов с 200 мкл минерального масла. Инкубируйте образцы при 55 ° С на водяной бане, за 4-16 часов. Длина бисульфита лечения зависит от количества и качества ДНК, чтобы быть преобразованы. Для ДНК плохого качества или деградации ДНК, лимит времени инкубации до 4 часов. Примечание: важно, что бисульфит превращение происходит в темноте, чтобы избежать окисления, поэтому, если это не представляется возможным обернуть трубы в фольгу перед инкубацией .
4. В конце подходящее время инкубации, спина труб кратко в микроцентрифужных, чтобы обеспечить все жидкости в нижней части трубы.
5. Восстановление бисульфита рассматривать ДНКиз-под слоем масла, тщательно пипетки из раствора ДНК из нижней части трубки, не занимая при этом какой-либо из минерального масла.

Обессоливание

5. Удалите все свободные бисульфита ионов, проходящих через обессоливания колонки и элюирования в 50 мкл милли-Q воды (MQH ₂ O). В зависимости от количества и качества геномной ДНК и как она готова, различные обессоливания колонн могут быть использованы. Мы регулярно использовать Promega мастер Очистка колонны, как эти колонки подходят для удаления SDS, используемых в подготовке ДНК до преобразования.

Щелочные Desulphonation

6. Бисульфита аддукт удаляется из урацил кольцо desulphonation. Desulphonate путем добавления 5,5 мкл свежеприготовленного 3М NaOH до конечной концентрации 0,3 М, то инкубировать образцов при 37 ° С в течение 15 мин.
7. Центрифуга кратко и добавить 1 мкл т РНК (10 мг / мл).
<LI> Нейтрализовать раствор путем добавления 33 мкл ацетата аммония (NH ₄ O Ас), рН 7,0 до конечной концентрации 3М.
8. Этанол-осадок ДНК путем добавления 330 мкл ледяного 100% этилового спирта, хорошо перемешать путем инверсии. Оставьте как-20μC в течение 1 часа, чтобы за одну ночь. Центрифуга при 14000 г в течение 15 мин при 4 ° C. Удалите все следы супернатанта и сухого воздуха осаждаются ДНК в течение ~ 20 мин.
9. Повторное приостановить ДНК гранул в 50 мкл / 0,1 мкг TE (10 мМ Трис-HCl, 0,1 мм ЭДТА, рН 8,0) или H ₂ O. Оставить при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часа. Иногда вихревой трубы для обеспечения ДНК растворяется, а затем быстро центрифуги.
10. Используйте сразу для ПЦР-амплификации, или хранить при температуре -20 ° С в течение 1-10 лет в зависимости от количества и качества ДНК.

4. ПЦР-амплификации

Грунтовка дизайн

1. Эффектный дизайн ПЦР бисульфита преобразования конкретных грунтовок cruciaл для обеспечения эффективного, беспристрастного усиления полностью превращается ДНК происходит. Следующие рекомендации используются для помощи грунтовки дизайна.

Руководство Primer дизайн

Thermocyling

2. Для проверки пропорциональной ПЦР-амплификации метилированной и неметилированный ДНК, использование 50:50 Метилированный / неметилированный полностью бисульфита преобразованы контрольной пробы и усилить с бисульфита конверсионных специфических праймеров под оптимизированы условия реакции ПЦР (рис. 3). Для Метилированный 50:50: неметилированный управления, используйте в пробирке УОНИ метилированной ДНК и либо весь геном усиливается (WGA) ДНК или целые ДНК крови. Помните, что некоторые гены будут естественно метилированных в крови и, следовательно, в этих случаях лучше всего использовать только WGA ДНК как "неметилированный" контроля.
3. Подготовка ПЦР смеси усиление реакции в 100-мщ л аликвоты, содержащие 2 мкл бисульфита преобразованы геномной ДНК, 200 мкМ дНТФ, в 1 мкМ праймеров, 1,5 мМ MgCl _2, 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3 и 0,15 мкл Taq-полимеразы.
4. В амплификаторе градиента температуры, установить запустить реакцию в градиент + / - 3 ° С от предсказанных т грунта в 10 труб

5. Чтобы проверить, что метилированные и неметилированный ампликонов излагаются в пропорции, ампликона могут быть переварены с информативным фермент ограничения, например, Taq-1 (TCGA), которые будут переваривать метилированной ДНК, но не переварить неметилированный ДНК, когда сайт рестрикции фермента изменены после бисульфита преобразования в TTGA. Степень пищеварения могут быть визуализированы в агарозном гель-электрофореза (рис. 3А). Кроме того, SYBRGreen (0,2 мкл 1:1000 разбавления) могут быть добавлены в реакции ПЦР истепень метилирования могут быть оценены путем проведения тепла диссоциации участков в ПЦР в реальном времени амплификаторе (рис. 3В).
6. ПЦР реакционную смесь в том числе MgCl ₂ концентрации и термоциклирования условия могут нуждаться в корректировке увеличить эффективность ПЦР или для обеспечения пропорционального ПЦР-амплификации метилированной и неметилированный ПЦР фрагментов.
7. После ПЦР условия оптимизированы, ПЦР-амплификации могут быть выполнены на бисульфита преобразованы образцы. Примечание: После Tm оптимизирован температурный градиент ПЦР не должны быть использованы.

5. Представитель Результаты:

Примером бисульфита оптимизации ПЦР показано на рисунке 3. Оптимальное ПЦР-амплификации условия должны усиливать метилированных и неметилированный ампликонов пропорционально и без предвзятости. На рис.3 показана агарозном геле с градиентом температуры ПЦР-амплификации профиля из смеси 50% метилированных и неметилированный ДНК. Thэлектронной ПЦР ампликонов были обработаны рестрикции, Taq-1 (TCGA), которые будут переваривать метилированных (М) ДНК, но не переварить неметилированный (U) ДНК как сайт рестрикции изменяется при бисульфита преобразования в TTGA. Равное количество вырезать и необработанных продуктов ПЦР, как ожидается, если метилированных и неметилированный ДНК усиливается пропорционально. Это можно увидеть на этом гель, который оптимальные условия thermocyling для не-предвзятость усиление на 56,1 ° С (Т). Полное преобразование бисульфита ДНК также могут быть проанализированы при переваривании цитозин-сайт определенного фермента, таких как Хпа III (КСДУ). Хпа III будет только переварить, если преобразование не удалось, так как сайт рестрикции будет сохранена. Если завершение конверсии сайт рестрикции будут преобразованы в TCGG или TTGG в зависимости от состояния метилирования ДНК. Полное бисульфита преобразование ДНК может быть показано на рисунке 3А (H).

Рис 3B показывает реальный сюжет диссоциации время,может также использоваться как инструмент, чтобы определить, есть ли усиление смещения в зависимости от температуры, при которой различные молекулы диссоциируют. На этом рисунке видно, что ПЦР усилилась метилированных (М) и неметилированный (U) ДНК в пропорции из смеси 50% метилированных и неметилированный ДНК по сравнению с контролем усиления полностью метилированных и неметилированный ДНК, которые диссоциируют при 82.1μC и 78.9μC соответственно.

После оптимизации thermocyling и условий реакции бисульфита обработанные образцы могут быть усилены с прядь конкретных и специфических праймеров бисульфита либо одного или частично вложенных реакции ПЦР. В результате ПЦР фрагменты могут быть визуализированы с помощью электрофореза в агарозном геле и последовательности либо непосредственно (рис. 4а) или путем клонирования и секвенирования. После клонирования и секвенирования метилирования состояния отдельных молекул могут быть таблицы, в бисульфита карте (рисунок 4B), визуализировать неоднородностиметилирования.

Высокая пропускная способность количественного анализа метилирования может быть предварительно с использованием технологии как, например, используются метод EpiTYPER Sequenom. Используя этот метод, бисульфит преобразованы ДНК усиливается с бисульфит ПЦР праймеры и последовал процесс расщепления proprietry. Полученные фрагменты являются количественно MALDI-TOF масс-спектрометрии с конкретным спектром зависит от наличия метилированных цитозина (рис. 5А). Резюме метилирования соотношение в образце могут быть экстраполированы в виде Эпиграмма (рис. 5Б), либо метилирования участка (рис. 5С).

Рисунок 1. Метилированный CpG схеме. В нормальной клетке, промоутер связанных CpG островов в основном неметилированный (серый), тогда как CpG сайтов в пределах гена органов редки и, как правило метилированных (красный). На правой панели расширяет молекулярной структурыЮр ДНК в отдельных CpG сайтов и показывает метилирования CH3 молекулы углерода на 5 цитозина.

Рисунок 2. . Химические преобразования схемы анализа метилирования ДНК включает в себя четыре основных этапа, как показано на рисунке; ​​денатурации, бисульфит преобразования, ПЦР-амплификации и анализа. В правой панели, изменения цитозин молекулы, которые происходят во время преобразования бисульфита изображены.

Рисунок 3. Оптимизация ПЦР-амплификации. A. Агарозном гель-электрофорез с температурным градиентом ПЦР-амплификации профиля из смеси 50% метилированных и неметилированный ДНК. Фрагменты были переваривают либо Taq1 (Т) или HpaIII (H), которые переваривают метилированной ДНК и не бисульфита преобразованы ДНК соответственно. Б. Тепло кривой диссоциации анализ показывает, уравнениел доля метилированных и неметилированный ДНК (красная линия соотношении 50/50) по сравнению с контролем усиления полностью метилированный (розовая линия, М) и неметилированный ДНК (зеленая линия, U), которые диссоциируют при 82,1 ° С и 78,9 ° С соответственно.

Рисунок 4. Пример прямого секвенирования и бисульфит карте. A. Последовательность след от трех различных клеточных линий с CpG сайтов выделены желтым цветом. Сотовые линии X отображает 100% метилирования на всех трех CpG сайтов, а с клеточных линий Y и Z показывают различную степень метилирования с точки зрения перекрытия G / сигналы. Б. представитель бисульфита карта с указанием плотности метилирования (красные точки) на отдельных CpG сайтов, как это определено прямого секвенирования отдельных клонов.

Рисунок 5. Высокая пропускная способность метилирования ДНК анализа с использованием Sequenom. A. Спектр просматривать с помощью Sequenom epiTYPER технологии. Фрагменты ДНК отображения определенных спектров, в зависимости от количества ДНК, присутствующей метилирования. Б. Эпиграмма резюме процент метилирования ДНК в каждом CpG сайт для четырех различных клеточных линий. С. метилирования участка резюме основе Эпиграмма Sequenom.

Discussion

Метилирования ДНК анализ геномной последовательности бисульфита преобразованы ДНК является хорошо организованной и универсальный метод, который облегчает идентификацию и количественное определение метилирования ДНК в одиночных нуклеотидных разрешения. Тем не менее, бисульфит преобразования и последующий анализ основан на той посылке, что ДНК была полностью преобразована с каждым неметилированный цитозин быть дезаминироваться в урацил и только метилированных цитозина оставшиеся не-реактивным. Если преобразование является неполным, проблемы могут возникнуть с анализа, так как необращенных неметилированный цитозина могут быть неправильно интерпретированы как метилированных цитозина. Бисульфита преобразования могут быть оптимизированы на различных этапах, чтобы максимизировать процент конверсии. Для ДНК, чтобы быть полностью преобразовал его в первую очередь должны быть одноцепочечной, так что цитозин остатки подвергаются бисульфита ионов. Первый шаг, ДНК денатурации, является критическим и может быть источником неполного преобразования, если ДНК не полностью денатурированный. Для обеспечениячто ДНК полностью денатурированным важно, чтобы реакция параметров, включая удаление всех связанных с белком, соответствующей концентрации соли, температуры инкубации и время подходит для сохранения ДНК в одноцепочечной конформации. Важно использовать свежие 3М NaOH и обеспечивать достаточное время инкубации. Если ДНК сопротивляется денатурации, некоторые изменения в протокол включая расширение инкубационный период до 30 минут или фрагментации ДНК до денатурации ДНК может способствовать денатурации. Кроме того, одноцепочечной ДНК (оцДНК) может повторно отжига в двухцепочечной ДНК (дц) во время бисульфит реакции конверсии. Проведение реакции при высокой температуре (90-95 ° С), либо периодически, либо непрерывно в течение бисульфит реакции может помочь поддержанию оцДНК. Тем не менее, важно помнить, что ДНК деградации значительно ускоряется при таких высоких температурах. Различные реагенты могут быть также добавлены сорвать повторного отжига йэлектронных цепей ДНК, такие как мочевина.

Концентрация ДНК и ее качество также может влиять на эффективность бисульфит реакции и конечная доходность ПЦР. ДНК деградация ограничение бисульфита преобразования протоколов. Химической обработки ДНК знакомит с различными разрывов ДНК в оцДНК и некоторые из суровых условий, необходимых для полного преобразования бисульфита в том числе высокой концентрацией бисульфит, долгое время инкубации может ускорить деградацию ДНК. При стандартных условиях реакции описаны, ДНК деградация не является общей проблемой, однако, если протокол изменения вводятся, например, для последовательности, которые поддаются преобразования, для ДНК-шаблоны, которые разлагаются или низкого качества, такие как FFPE образцы, то деградация ДНК может стать существенным ограничением.

Фиксированные в формалине, парафин (FFPE) и деградированных образцов ДНК может быть эффективно преобразовано бисульфита и усиливаются с помощью этого протоколаОднако изменения для того, чтобы ДНК не является дальнейшее деградированных рекомендуется. Использование носителя РНК, такие как трет РНК рекомендуется. Также гликогена может быть добавлен в качестве носителя, когда ДНК низкой концентрации (<200 нг). Поскольку ДНК, выделенной из тканей FFPE уже фрагментированы и дальнейшей фрагментации происходит во время дезаминирования, необходимо позаботиться, чтобы минимизировать дальнейшей деградации. Не фрагмента ДНК дальнейшее до денатурации и ограничить время инкубации для бисульфит реакции до 4 часов. Дизайн ампликонов не больше, чем на 300 б.п. за счет фрагментированной ДНК.

Другим фактором, который может влиять на ПЦР-амплификации, что бисульфит преобразования неметилированный цитозина уменьшает сложность ДНК. Следующий протокол дизайн грунтовки, изложенным в разделе 4.1, увеличение длины праймеров и ПЦР все это может способствовать увеличению специфичности ПЦР и доходности.

Наконец, поскольку ДНК-шаблон меняется в течение bisulphITE преобразования, усиления смещения может быть проблемой. Убедитесь, что пропорциональная ПЦР-амплификации метилированной и неметилированный шаблонов проверяется с контролем 50/50 M / U смесь ДНК, как указано в протоколе, см. рис 3. Также убедитесь, что усиление только преобразуется Шаблоны происходит HpaIII использованием ферментов рестрикции и гель-электрофореза (рис. 3). Условия ПЦР, возможно, должны быть оптимизированы путем изменения температуры и / или магния, концентрация или удлинение расширение времени. Некоторые шаблоны кажутся особенно проблематичным и грунтовки позиции, возможно, должны быть скорректированы или вырожденные праймеры, возможно, должны быть использованы.

Следующая методы секвенирования поколения стремительно развивается, чтобы достичь аналогичной резолюции в бисульфит геномной последовательности, и третье поколение одной последовательности молекулы имеет потенциал, чтобы обеспечить анализ как первичного, так и метилирования ДНК без необходимости бисульфита секвенирования. Тем не менее, широкую доступность и спецификацииificity из этих методов остается какое-то время далеко. Бисульфита секвенирования генома является золотым стандартом в метилирования анализа и надежный протокол. Метод прогрессировала до такой степени, общие проблемы и ограничения были решены, и приложения расширили отдельных анализ гена высокой пропускной способности и весь анализ генома описывается Clark и соавт. 2006 ^4. Поиск и устранение неисправностей руководящие принципы и дополнительные рекомендации приведены в Таблице 1. Предполагается, что оптимальный подход заключается в изначально следовать стандартным протоколом, и только ввести модификации, если и когда возникает проблема.

Таблица 1. Устранение неполадок Руководство

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.