DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Summary

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

Abstract

Epigenetik DNA dizisi bağımsız olarak meydana gelen kalıtsal gen fonksiyonunda değişiklikler açıklanmaktadır. Epigenetik gen düzenlemenin moleküler temeli karmaşık, ama aslında yapılan değişiklikler DNA kendisi veya DNA iştirakçi proteinler içerir. Memeli genomların DNA baskın epigenetik modifikasyon sitozin nükleotidler metilasyon (5-MEC). DNA metilasyon nerede ve gen ifade edilmelidir gen ekspresyonu makine talimat sağlar. Memeliler DNA metilasyon için birincil hedef dizisi 5'-CpG-3 'dinükleotidleri (Şekil 1). CpG dinükleotidleri genom boyunca eşit dağıtılmış değil, ancak tekrarlayan genomik dizileri ve gen rehberleri (Şekil 1) ile ilgili CpG "adalar" bölgelerinde yoğunlaşmıştır. DNA metilasyon desen doku belirli bir farklılaşma sırasında modülasyonlu, erken gelişim kurulan ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık durumlarında bozulması. Understand hassas insan hastalığı, yöntemleri, verimli ve tekrarlanabilir DNA metilasyon ve rolünü biyolojik rolü 5-MeCs bireysel saptamak ve ölçmek için gereklidir.

Bu protokol, bisülfit dönüşüm için DNA metilasyon analizi için "altın standart" ve tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon tanımlanması ve ölçülmesi kolaylaştırır. Sodyum bisülfit sitozin deaminasyon kimya, üç adım (Şekil 2) içerir. (1) sülfonasyon: urasil-bisülfit türevi (3) Alkali Desulphonation vermek için ortaya çıkan sitozin-bisülfit türev hidrolitik deaminasyon:: sitozin (2) Hidrolik Deaminasyon 5-6 çift bağ için bisülfit Ayrıca sülfonat Kaldırma alkali uygulaması ile grup, urasil vermek. Bisülfit tercihen, 5-MEC ise, tek sarmallı DNA urasil sitozin deaminates bisülfit-aracılı deaminasyon dirençli. PCR üzerine, urasil yükseltilir5-MEC artıkları cytosines olarak kalırken, metil CpG'ler sıralama sırasında bir sitozin "C" karşı timin "T" kalıntı varlığı unmethylated CpG'ler ayırt edilmesi için izin timin gibi.

Bisülfit dönüşüm tarafından DNA modifikasyonu, DNA metilasyon analizi pek çok yöntem için istismar edilebilir köklü bir protokoldür. Bisülfit dönüşüm 5-MEC algılama ilk Frommer et al ¹ ve Clark ve ark. ^2, DNA metilasyon yeni veri çoğunluğu için genomik DNA hesap bisülfit dönüşüm etrafında dayalı yöntemler gösterildi. Özgüllük ve gerekli metilasyon çözünürlük derecesine bağlı olarak, yazılan PCR analizi için farklı yöntemler kullanılabilir. Klonlama ve DNA molekülü üzerinde metilasyon için tek nükleotid çözünürlük verebileceğiniz en hazır yöntem.

Protocol

Bisülfit dönüşüm protokolü

Genomik DNA 2 mikrogram dönüşüm için standart bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Genomik DNA (100 pg-200 mg) daha küçük veya büyük miktarda, aynı zamanda başarılı bir şekilde tedavi bisülfit olabilir. Bu tepkime koşulları hemen hemen her hedef DNA dizisi ³ tam dönüşüm (% 99,5-99,7) sonuçlanır.

1. DNA hazırlığı

37 ° C Not 1 saat için 18 ul toplam hacim bisülfit DNA Lizis Buffer (2 mg t RNA 280 ng / ul Proteinaz K,% 1 SDS) ile genomik DNA kuluçka örnekleri hazırlayın: Bunu başarmak için önemlidir. özellikle hala DNA ile ilişkili protein olabilir klinik örneklerden izole edilen DNA ile maksimal bisülfit dönüşüm .

2. DNA denatürasyonu

1. Son c taze hazırlanmış 3M NaOH 2 ul ekleyerek 20 ul bir ses doğasını 2 mg DNA0.3M, oncentration.
2. 37 ° örnekleri inkübe ° C su banyosunda 15 dakika süreyle bir ısı bloğu içinde 2 dakika süreyle 90 ° C'de inkübasyon izledi. Hemen 5 dakika boyunca buz üzerinde tüplerin yerleştirin.
3. 4 ° C, 10 s 10.000 g sağlamak için DNA tüpün dibinde tüplerin santrifüjleyin.

3. Bisülfit Deaminasyon

Sülfonasyon & Hidrolitik Deaminasyon

1. 10 mM Quinol ve doymuş sodyum metabisülfit pH 5.0 (464 ul 10 M NaOH ile 7.6 g Na ₂ S ₂ O _5, 15 ml su ile yapılmış) taze çözümler hazırlayın. Doymuş sodyum bisülfit çözüm asgari karıştırma ve havalandırma ile, yavaşça tersine reaktif / H ₂ O karışımı ile elde edilir. Gerekirse, metabisülfit Not tam olarak kapatılması için 10 M NaOH ile pH ayarı: doymuş bir çözüm olduğu için, küçük topaklar hala çözünmeden kalır .
2. 208 ekle2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0 nihai konsantrasyonu 240 ul nihai hacmi doymuş metabisülfit ve denatüre DNA (20 ul) 10mM Quinol 12 ul ul. Damlacıkları tüpün alt kısmında sağlamak için 10 sn için tüm reaktifler ve santrifüj yavaşça karıştırın.
3. 200 ul madeni yağ numuneleri Overlay. Numuneler 55 ° C su banyosu, 4-16 saat inkübe edin. Bisülfit tedavi süresini dönüştürülecek DNA miktarı ve kalitesi bağlıdır. Kalitesiz ya da bozulmuş DNA DNA, 4 saat inkübasyon süresi sınırı Not: inkübasyondan önce folyo tüpler mümkün şal değildir eğer öyleyse, bu bisülfit dönüşüm oksidasyon önlemek için karanlık yer aldığı önemlidir. .
4. Uygun inkübasyon süresi sonunda, tüm sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için bir mikrosantrifüj kısaca tüpler döndürmek.
5. Bisülfit tedavi DNA Kurtardikkatle herhangi bir mineral yağ almadan, tüpün dibinden DNA çözüm pipetleme yağ tabakasının altında.

Tuzsuzlaştırma

5. Tuzsuzlaştırma sütun geçerek, 50 mili-Q suyu _{(MQH 2} O) ul salınımlı herhangi bir ücretsiz bisülfit iyonlarının çıkarın . Genomik DNA'nın miktarı ve kalitesi üzerinde ve nasıl hazırlanır bağlı olarak, farklı tuzsuzlaştırma sütun kullanılabilir. Biz rutin olarak bu sütunların SDS dönüşüm için önce DNA hazırlanmasında kullanılan kaldırmak için uygun Promega Sihirbazı, sütunlar temizleyin kullanın.

Alkali Desulphonation

6. Bisülfit adduct desulphonation urasil halka çıkarılır. Desulphonate 0.3M bir son konsantrasyonu 5.5 ul taze hazırlanmış 3M NaOH ekleyerek, örnekleri daha sonra 37 ° C'de 15 dakika süreyle kuluçkaya yatmaktadır.
7. Kısaca Santrifüj ve t RNA (10 mg / ml) 1 ul ekleyin.
<li> amonyum asetat 33 ul (NH ₄ O Ac), 3M nihai konsantrasyonu pH 7.0 ilavesi ile çözüm nötralize.
8. Buz gibi% 100 etanol 330 ul ekleyerek Etanol çökelti DNA tersine çevirerek iyice karıştırın. -20μC gecede 1 saat bırakın. 15 dakika 14.000 g Santrifüj 4 ° C Süpernatant ve hava tüm izlerini ~ 20 min çöktürülmüş DNA kuru çıkarın.
9. 0.1 TE (10mM Tris-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) veya H ₂ O 50 ul / mg DNA pelet yeniden askıya Yaklaşık 2 saat oda sıcaklığında bekletin. DNA sağlamak Bazen vorteks tüpleri, ardından hızlı bir santrifüj, çözünmüş.
10. DNA miktar ve kalitesine bağlı olarak 1-10 yıl boyunca -20 ° C'de PCR veya mağaza için hemen kullanın.

4. PCR Amplifikasyon

Primer Tasarım

1. PCR bisülfit dönüşüm spesifik primerler Etkin tasarım crucial DNA'nın tamamen dönüştürülen bu verimli, tarafsız amplifikasyon sağlamak için oluşur. Aşağıdaki yönergeler, astar tasarım yardım için kullanılacak.

Primer Tasarım Kuralları

Thermocyling

2. Orantılı metillenmiş ve unmethylated DNA PCR testi için, bir metil 50:50 / Unmethylated tam bisülfit dönüştürülür kontrol örneği kullanın ve optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları (Şekil 3) altında bisülfit dönüşüm spesifik primerler ile amplifiye. 50:50 metil: Unmethylated kontrolü, in vitro SssI metillenmiş DNA ve ya tüm genom (WGA) amplifiye DNA veya tam kan DNA kullanın. Bazı genlerin doğal kan metil ve bu nedenle bu gibi durumlarda sadece "Unmethylated" kontrol WGA DNA kullanmak en iyisi olacaktır ki farkında olun.
3. 100 & m PCR reaksiyon karışımları hazırlayınu; l 2 ul dönüştürülür bisülfit genomik DNA, 200 mcM dNTP, 1 mcM primerler, 1.5 mM MgCl _2, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8.3 ve 0.15 ul Taq polimeraz içeren alikotları.
4. 3 ° C üzerinden astar tahmin Tm 10 tüp, bir sıcaklık degrade PCR degrade çalıştırmak reaksiyon + /

5. Metillenmiş ve unmethylated amplikonlarının orantılı olarak amplifiye olduğunu test etmek için, Amplikon metillenmiş DNA sindirimi Taq 1 (TCGA) gibi bilgilendirici bir restriksiyon enzimi, sindirilmiş, ancak kısıtlama enzim sitesi unmethylated DNA sindirimi olmaz TTGA için bisülfit dönüşüm sonra değiştirdi. Sindirim ölçüde agaroz jel elektroforezi (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir. Alternatif olarak, PCR reaksiyonu SYBRGreen (0.2 1:1000 dilüsyon ul) eklenir ve olabilirmetilasyon ölçüde bir real-time PCR PCR (Şekil 3B) ısı disosiasyon araziler yaparak değerlendirilebilir.
6. MgCl ₂ konsantrasyonu ve thermocycling koşulları da dahil olmak üzere PCR Reaksiyon karışımı PCR verimliliğini artırmak veya metil ve unmethylated PCR parçaları orantılı PCR sağlamak için ayarlanması gerekebilir.
7. PCR koşulları optimize sonra, PCR bisülfit dönüştürülen numuneler üzerinde yapılacaktır Not: Bir kez Tm sıcaklık degrade PCR kullanılabilir gerekmez optimize edilmiştir .

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Bisülfit PCR optimizasyonu bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Optimal PCR amplifikasyon koşulları oran ve önyargısız, metil ve unmethylated amplikonlarının yükseltilmesi gerekir. Şekil 3A% 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili ile bir agaroz jel gösterir. The PCR amplikonlarının metillenmiş sindirimi bir kısıtlama enzim, Taq 1 (TCGA), (M) DNA ile tedavi edilmiştir ancak TTGA için bisülfit dönüşüm restriksiyon enzimi sitesi tarafından değiştirilmiş olarak (U) DNA unmethylated sindiremez. Kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü eşit miktarda metil ve unmethylated DNA orantılı olarak yükseltilir bekleniyor. -Önyargı olmayan amplifikasyonu için optimal thermocyling koşulları 56.1 olduğunu, bu jel üzerinde görülebileceği ° C (T). Bisülfit DNA komple dönüşüm sitozin-sitesi hpa III (CCGG) gibi spesifik bir enzim ile sindirime de analiz edilebilir. Dönüştürme başarısız oldu hpa III sadece kısıtlama sitesi muhafaza edilecektir sindirir. Dönüştürme işlemi tamamlandığında ise kısıtlama site TCGG veya DNA metilasyon durumu bağlı TTGG dönüştürülmüş olacak. Komple bisülfit DNA dönüşüm Şekil 3A (H) görülebilir.

Şekil 3B gerçek zamanlı bir ayrılma arsa gösterirfarklı moleküller ayrıştırmaları hangi sıcaklık dayalı herhangi bir amplifikasyon önyargı var olup olmadığını belirlemek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu şekilde PCR 82.1μC az ayrıştırmaları tamamen metillenmiş ve unmethylated DNA amplifikasyon kontrol ile karşılaştırıldığında,% 50 metillenmiş ve unmethylated DNA karışımı oranında metil amplifiye (M) ve (U) unmethylated DNA olduğunu görülebileceği sırasıyla 78.9μC.

Thermocyling ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu sonra bisülfit tedavi örnekleri tek bir ya da yarı nested PCR reaksiyon ya iplikçik bisülfit özel ve spesifik primerler ile amplifiye edilebilir. Çıkan PCR parçaları agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir (Şekil 4A) ya doğrudan ya da klonlama ve sıralama sıralı olabilir. Klonlama ve bireysel moleküllerinin metilasyon devlet sıralama heterojen görselleştirmek için bisülfit bir harita (Şekil 4B), cetvel sonrametilasyon.

Yüksek verim kantitatif metilasyon analizi gibi Sequenom EpiTYPER yöntemi tarafından kullanılan teknoloji kullanılarak preformed olabilir. Bu yöntemi kullanarak, bisülfit dönüştürülür DNA bisülfit spesifik PCR primerleri ile amplifiye ve bir proprietry bölünme süreci izledi. Çıkan parçaları metil cytosines (Şekil 5A) varlığına bağlı özel spektrum MALDI-TOF kütle spektrometresi tarafından quantitated. Metilasyon oranları örnek bir özetini sonra bir özdeyişinin (Şekil 5B) veya metilasyon arsa (Şekil 5C) şeklinde çıkarım olabilir.

Şekil 1. (Gri) gen bedenlerinizde CpG siteleri seyrek ve genellikle metil (kırmızı) ise normal hücre, organizatörü ile ilişkili CpG adalar ağırlıklı metil CpG şematik. Unmethylated. Sağdaki panel, moleküler yapısı genişletirbireysel bir CpG yerinde DNA ure ve sitozin 5 karbon CH3 molekülü ile metilasyon gösterir.

Şekil 2. Denatürasyon, bisülfit dönüşüm, PCR ve analizi; Kimyasal dönüşüm şematik analizi, DNA metilasyon gösterildiği gibi dört ana aşama içerir . Sağ panelde, sitozin molekülünün bisülfit dönüşüm sırasında meydana gelen değişiklikler tasvir edilmektedir.

Şekil 3. PCR A. Optimizasyonu % 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili agaroz jel elektroforez. Fragments sırasıyla metillenmiş DNA ve olmayan bisülfit dönüştürülür DNA sindirimi Taq1 (T) veya HpaIII (H) ya da sindirilmiş edilmiştir. B. Isı dissosiyasyon eğrisi analizi denklemleri gösterirmetillenmiş ve unmethylated DNA (kırmızı çizgi 50/50 mix) l oranı kontrolü tamamen metillenmiş amplifikasyon (pembe çizgi, M) ve ° C ve 78.9 ° C sırasıyla 82.1 ayrıştırmaları unmethylated DNA (yeşil hat, U).

Şekil 4. Doğrudan sıralama örneği ve bisülfit haritası A. Sıra iz sarı vurgulanır CpG siteleri ile üç farklı hücre hatları. Hücre hattı X hücre hatları Y ve Z G / A sinyaller üst üste görüldüğü gibi metilasyon değişik derecelerde ise her üç CpG siteleri% 100 metilasyon gösterir. B., bireysel klonların doğrudan sıralama belirlenir, bireysel CpG siteleri metilasyon (kırmızı noktalar) yoğunluğu gösteren Temsilcisi bisülfit harita.

Şekil 5. Sequenom A. kullanarak yüksek verim DNA metilasyon analizi Sequenom epiTYPER teknolojisini kullanarak Spektrum görünümü. DNA parçalarının DNA metilasyon mevcut miktarına bağlı olarak, belirli spektrumları gösterir. B. DNA metilasyon yüzde CpG dört farklı hücre hatları için her yerinde özdeyişinin özeti. C. Metilasyon arsa özeti Sequenom özdeyişinin türetilmiştir.

Discussion

DNA metilasyon analizi bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon belirlenmesi ve miktar kolaylaştıran bir köklü ve çok yönlü bir yöntemdir. Ancak, bisülfit dönüşüm ve sonraki analiz DNA tam her unmethylated sitozin urasil deaminated ve sadece metil cytosines un-reaktif kalan dönüştürülmüş olduğunu önermesine dayanır. Dönüştürülmemiş unmethylated cytosines dönüşüm eksik ise yanlış metil cytosines olarak yorumlanabilir bu yana, sorunların analizi ile ortaya çıkabilir. Bisülfit dönüşüm dönüşüm oranını en üst düzeye çıkarmak için çeşitli aşamalarında optimize edilebilir. DNA tam olarak dönüştürülebilir için sitozin kalıntılarının bisülfit iyonlarının maruz böylece ilk telli tek olmalıdır. Ilk adım, DNA denatürasyon, kritik ve DNA tam denatüre değilse eksik dönüşüm kaynağı olabilir. Sağlamak içinDNA tam denatüre olduğunu, ilgili tüm protein kaldırılması, uygun tuz konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve saati de dahil olmak üzere reaksiyon parametreleri, tek sarmallı konformasyon DNA korumak için uygun olması önemlidir. Taze 3M NaOH kullanmak ve uygun inkübasyon süresi izin için önemlidir. DNA denatürasyon direnen ise, inkübasyon süresi 30 dakikaya kadar uzanan veya denatürasyon için önce DNA parçalanan protokol de dahil olmak üzere bazı değişiklikler DNA'nın denatürasyon kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, tek sarmallı DNA (ssDNA) bisülfit dönüşüm reaksiyon sırasında çift sarmallı DNA (dsDNA) yeniden tavlama olabilir. Ya periyodik veya sürekli bisülfit reaksiyon sırasında daha yüksek bir sıcaklık (90-95 ° C) reaksiyonu Taşıma ssDNA bakım yardımcı olabilir. Ancak, DNA'nın bozulması, bu yüksek sıcaklıklarda büyük ölçüde hızlandırılmış olduğunu farkında olmak önemlidir. Çeşitli reaktifler th yeniden tavlama bozabilir eklenebilire DNA ipliklerini, üre gibi.

DNA ve kalitesini konsantrasyonu da bisülfit reaksiyon verimliliğini ve nihai PCR verimi etkileyebilir. DNA'nın bozulması, bisülfit dönüşüm protokolü bir sınırlama yoktur. DNA'nın kimyasal arıtma çeşitli iplikçik ssDNA sonları ve bazı yüksek bisülfit konsantrasyonu, uzun kuluçka süreleri DNA düşüşü hızlandırabilir de dahil olmak üzere tam bisülfit dönüşüm için gerekli olan sert koşullar tanıtır. Açıklanan standart reaksiyon şartları altında, protokol değişiklikler tanıtıldı, DNA'nın bozulması, bozulmuş ya da FFPE örnekleri gibi kalitesiz DNA şablonları için, bu tür dönüşüm dirençli dizileri için, ancak DNA bozulması ortak bir sorun değildir önemli bir sınırlama olabilir.

Formalin sabit, parafin (FFPE) ve bozulmuş DNA örnekleri, bu protokolü etkin kullanılarak dönüştürülür ve amplifiye bisülfit olabilirAncak DNA daha da bozulmuş olmadığından emin olun değişiklikler tavsiye edilir. T RNA gibi bir taşıyıcı RNA kullanılması tavsiye edilir. DNA konsantrasyonu düşük (<200 ng) Ayrıca glikojen bir taşıyıcı olarak eklenebilir. FFPE dokulardan izole DNA zaten parçalanmış ve daha fazla parçalanma deaminasyon sırasında yer aldığından daha fazla bozulmasını en aza indirmek için, bakım alınmalıdır. Parçası DNA denatürasyon önce başka etmeyin ve bisülfit reaksiyon için 4 saat inkübasyon süresi sınırı. Tasarım parçalanmış DNA nedeniyle 300 bp daha büyük amplikonlarının.

PCR, unmethylated cytosines bisülfit dönüşüm DNA örneğinin karmaşıklığı azaltır etkileyebilecek bir diğer faktördür. Bölüm 4.1, artan astar uzunluğu ve nested PCR ana hatlarıyla aşağıdaki astar tasarım protokolü özgüllük ve PCR verimi artırmak için yardımcı olabilir.

Son olarak, DNA örneğinin beri bisulph sırasında değişmişite dönüşüm, amplifikasyon yanlılık bir sorun olabilir. Bkz. Şekil 3, metil ve unmethylated şablonları bu orantılı PCR protokolde belirtildiği gibi, bir kontrol 50/50 M / U DNA karışımı ile işaretli olduğundan emin olun. Ayrıca sadece dönüştürülen şablonları bu amplifikasyon sağlamak HpaIII kısıtlama enzim ve jel elektroforezi (Şekil 3) ile meydana geliyor. PCR koşulları, sıcaklık ve / veya magnezyum konsantrasyonu farklı veya uzatma süresi uzatma optimize edilmesi gerekebilir. Bazı şablonlar, özellikle problemli gibi görünen ve astar konumu ayarlanması gerekebilir veya primerler dejenere kullanılmak üzere gerekebilir.

Yeni nesil sıralama teknikleri genomik sıralama bisülfit benzer bir çözünürlük elde etmek için hızla gelişmektedir ve üçüncü nesil tek molekül sıralama bisülfit sıralaması için gerek kalmadan hem de birincil DNA ve metilasyon analizi için izin potansiyeline sahiptir. Ancak, yaygın kullanılabilirliği ve specbu tekniklerin ificity uzakta bir süre kalır. Bisülfit genomik sıralama metilasyon analizi altın standarttır ve sağlam bir protokoldür. Bu yöntem, sık karşılaşılan sorunlar ve sınırlamalar çözüldü noktasına kadar ilerledi ve uygulamaları, yüksek verimlilik ve Clark ve ark tarafından tanımlanan tüm genom analizi, bireysel gen ^analizleri genişlettik. 2006 4. Sorun Giderme kılavuzlar ve ek öneriler Tablo 1'de özetlenmiştir. Başlangıçta standart bir protokol takip ve sadece eğer modifikasyon ve ne zaman bir problem ortaya tanıtmak için en uygun yaklaşım olduğu ileri sürülmektedir.

Tablo 1 Sorun Giderme Rehberi

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.