Summary
Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.
Abstract
La capacité de l'étiquette de façon différentielle des cellules individuelles a des implications importantes en biologie du développement. Par exemple, pour déterminer comment hématopoïétiques, les lignages vaisseau lymphatique et sanguin surviennent dans les embryons en développement nécessite la cartographie destin et la lignée de traçage des cellules précurseurs indifférenciés. Récemment, des protéines photoactivables qui comprennent: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 et 9 KikGR, 10 ont reçu un grand intérêt en tant que sondes de cellules de traçage. Le spectre de fluorescence de ces protéines photosensibles peuvent être facilement convertis avec excitation UV, permettant une population de cellules doit être distinguée de celles adjacentes. Cependant, le photoefficiency de la protéine activée peut limiter à long terme de cellules de suivi 11. Comme alternative aux protéines photoactivables, cage fluorescéine-dextran a été largement utilisé dans des systèmes modèles embryon 7, 12-14. Traditionnellement, pour uncage fluorescéine-dextran, l'excitation UV d'une lampe maison de fluorescence ou d'un laser seul photon UV a été utilisé, cependant, de telles sources de limiter la résolution spatiale de photoactivation. Nous rapportons ici un protocole de cartographier le destin, trace la lignée, et de détecter les simples cellules marquées. Les cellules individuelles dans les embryons injectés avec cage fluorescéine-dextran sont photoactivé avec des impulsions laser dans le proche infrarouge produite par un laser femtoseconde titane saphir. Ce laser est de coutume dans tous les microscopes à deux photons confocale tels que le microscope LSM 510 META RNL utilisées dans ce document. Depuis les tissus biologiques est transparent pour l'infrarouge proche d'irradiation 15, les impulsions laser peut être focalisé en profondeur au sein de l'embryon sans uncaging cellules au-dessus ou en dessous du plan sélectionné focale. Par conséquent, non-linéaire d'absorption à deux photons est induit seulement au foyer géométrique pour uncage fluorescéine-dextran dans une seule cellule. Pour détecter la cellule contenant Uncaged fluorescéine-dextran, nous décrivons un protocole d'immunohistochimie simples de 16 à visualiser rapidement la cellule activée. Le protocole d'activation et de détection présenté dans cet article est polyvalent et peut être appliquée à tout système modèle.
Remarque: Les réactifs utilisés dans ce protocole peut être trouvée dans le tableau annexé à la fin de l'article.
Protocol
1. Synthèse de la cage de fluorescéine-dextran (adapté de réf. 14)
- Préparer une solution 0,1 M de borate de sodium dilué dans ddH 2 O.
- Mesure 4 mg de 10 kDa aminodextrane et l'ajouter au tube CMNB-cage fluorescéine.
- Ajouter 500 ul de la solution de borate de sodium préparée (étape 1.1) pour le tube CMNB-cage fluorescéine. Boucher le tube et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le mélange.
- Laisser le mélange réagir toute la nuit sur un nutator à température ambiante. Couvrez le tube avec une feuille de métal pour empêcher l'exposition du mélange à la lumière ambiante.
- Obtenir une colonne Zeba tour dessaler et enlevez le bouchon du bas. Marquer un point sur la colonne, qui sera utilisé pour orienter la colonne lors de la centrifugation. Placer la colonne dans un tube 15 ml coniques Falcon. Remarque: La solution dans la colonne de spin est tampon de colonne.
- Desserrez le capuchon sur la colonne de centrifugation dessaler. Placer 15 ml de la forme conique du tube Falcon qui abrite la colonne de centrifugation dessaler dans une centrifugeuse. Orienter la colonne de spin avec le point marqué (étape 1.4) face au centre de l'rotor de la centrifugeuse. Centrifuger le tube à 1000 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
- Après centrifugation, enlever la colonne de centrifugation dessaler du tube Falcon. Jeter la fois le débit recueillies dans le cadre et le tube 15 ml conique. Obtenir un nouveau 15 ml conique tube Falcon, et placer la colonne de centrifugation dessaler dans le nouveau tube Falcon. Remarque: Après centrifugation, le lit de résine colonne devrait apparaître compacté. Utilisez la colonne immédiatement.
- Obtenir le mélange ayant réagi (en cage fluorescéine-dextran) dans l'étape 1.3. Enlever le capuchon de la colonne de centrifugation et aspirer le mélange a réagi et l'appliquer lentement vers le centre de la colonne de centrifugation dessaler. Après avoir appliqué le mélange ayant réagi, replacez le bouchon sur la colonne.
- Placer le tube Falcon qui abrite la colonne de centrifugation dessaler dans une centrifugeuse. Comme fait à l'étape 1.5, d'orienter la colonne de spin avec le point marqué face au centre de l'rotor de la centrifugeuse. Centrifuger le tube à 1000 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
- Après centrifugation, un mélange jaune (fluorescéine-dextran en cage) seront collectées (environ 400 pi) dans le tube de 15 ml Falcon. Transférer la cage fluorescéine-dextran mélange dans un tube de 1,5 ml.
- Recouvrir immédiatement le tube avec une feuille de métal pour empêcher l'exposition du mélange à la lumière ambiante. Lyophiliser l'cage fluorescéine-dextran mélange dans un speedvac. La lyophilisation de 350 uL devrait prendre environ 4 heures.
- Après lyophilisation complète, resuspendre la poudre (environ 3 mg) dans le trou DDH 2 O à une concentration finale d'environ 1% p / v. Mélanger par vortex de suspendre brièvement la poudre.
- Aliquoter la cage fluorescéine-dextran dans les tubes séparés feuille métallique couvert, et de les stocker à -20 ° C.
2. La récolte des embryons et la microinjection de cage fluorescéine-dextran
* Cette procédure utilise le poisson zèbre comme modèle animal.
- Le jour avant les injections, mis en place des croix zebrafish soit 1h01 mâle-femelle ou mâle 02h01-femmes dans l'élevage des réservoirs avec des intercalaires.
- Le lendemain matin de changer l'eau du réservoir d'élevage et de supprimer les diviseurs. Immédiatement préparer un 5 uL dixième solution diluée de travail de cage fluorescéine-dextran soit dans une des médias X Danieau (voir Préparation des solutions) ou ddH 2 O. Couvrir le tube solution de travail avec une feuille de métal pour éviter l'exposition à la lumière.
- Pipeter l'préparées en cage fluorescéine-dextran solution (étape 2.2) dans l'aiguille. Avant de couper le bout de l'aiguille à une taille appropriée sous le microscope de dissection, placez un morceau de filtre transparent jaune en face de la source de lumière blanche. Le filtre jaune préviendra uncaging spontanée de la fluorescéine-dextran lors des injections. Lorsque regardant à travers l'oculaire oculaire, la source de lumière devrait apparaître jaune.
- Recueillir les embryons et les pipettes dans un bac de moisissures microinjection. Réglez le temps de livrer la microinjection de 3 à 4 nL de cage fluorescéine-dextran. Sous le microscope de dissection, d'orienter les embryons avec une pince et d'injecter (3 à 4 NL) en cage fluorescéine-dextran dans la base des cellules blastomères (blastomère-jaune de l'interface). Le stade de l'embryon pour l'injection doit être de 1 - à 2 cellules-scène.
- Après l'injection, éliminer les embryons du bac moule microinjection et les placer dans un plat propre de Pétri contenant les poissons d'eau douce. Le bleu de méthylène peut être ajouté à l'eau du poisson pour prévenir la croissance fongique à une concentration finale de 0,02% p / v. Couvrir le plat de Pétri avec une feuille de métal pour empêcher uncaging de l'injection de fluorescéine-dextran en cage.
- Levez les embryons injectés à un stade où les cellules d'intérêt doivent être photoactivé. Pour photoactivation, préparer un faible point de fusion de 0,6% dans la solution d'agarose ddH 2 O. Selon le stade d'embryon, tricaïne (MS222) peut être ajouté à la basse température de fusion d'agarose. Pour ce faire, diluer 0,02% de tricaïne basse température de fusion d'agarose à une concentration finale de 0,0014%.
- Dès que les embryons atteignent le stade de développement approprié, dechorionate les embryons dans une des médias X Danieau avec une pince. Lorsque dechorionating, assurez-vous qu'un filtre jaune transparent est placé dans le chemin de la source de lumière blanche (voir étape 2.3).
- Faites chauffer l'0,6% point de fusion bas solution d'agarose à 37 ° C. Pipeter 1 mL de fusion bas agarose dans le puits d'une lame de LabTek lamelle chambrée. Soigneusement monter de 3 à 4 embryons en basse température de fusion d'agarose et de les orienter avec une pince avec les cellules d'être confrontés à la baisse photoactivé contre la lamelle inférieure.
- Laisser l'agarose se solidifier. Après solidification, une pipette de 1 mL de 1 média X Danieau sur l'agarose.
- Répétez les étapes 2.8 à 2.9 pour plus d'embryons.
3. Deux photons d'activation de cage fluorescéine-dextran
* Cette procédure suppose que l'embryon exprime la GFP journaliste. L'embryon est visualisé en utilisant l'ion d'argon (488 nm) source laser attachés à la loupe LSM 510 META ONL. Une cellule GFP positif unique est sélectionné et photoactivé utilisant le Mai Tai au laser (laser femtoseconde) couplé à la LSM 510. La procédure est la même pour les non-fluorescente embryons. Alternativement, la lumière blanche peut être utilisée pour trouver la cellule pour être activé, suivie de l'activation à l'aide de la source laser Mai Tai.
- Chargez le logiciel LSM 510. Placer un filtre jaune transparent dans le faisceau de lumière blanche.
- Sélectionnez Numériser nouvelle image et cliquez sur Démarrer Mode Expert.
- Sélectionnez l'onglet laser. Allumez l'ion d'argon (488 nm) et de Mai Tai (femtoseconde) des sources laser.
- Réglez le Mai Tai longueur d'onde de 740 nm.
- Sélectionnez l'onglet de configuration. Définir la configuration du chemin optique de l'ion argon et de Mai Tai laser.
- Sélectionnez l'onglet Numérisation. Changer l'objectif de 20X/0.8.
- Réglez la vitesse de balayage max en cliquant Max.
- Set Mode, Mode, et le numéro de ligne, moyenne, et 1.
- Sous l'onglet Canaux désélectionner toutes les sources laser, à l'exception du Mai Tai.
- Placez un mètre de puissance dans le faisceau optique.
- Sélectionnez le bouton pour activer Cont balayage continu.
- Réglez le% de transmission jusqu'à ce que le wattmètre indique une puissance laser moyenne de 47 mW.
- Arrêter le scan en sélectionnant le bouton Stop.
- Sous l'onglet Canaux désélectionner le Mai Tai source laser et sélectionner les ions argon (488 nm).
- Sélectionnez le bouton XY rapide. Sous l'onglet Canaux ajuster le sténopé, gain du détecteur, un amplificateur de compensation, et de gain de l'amplificateur pour le laser à ions argon pour atteindre la meilleure qualité d'image.
- Utilisation du contrôleur stade, trouver et se concentrer sur la cellule pour l'activer.
- Cliquez sur le bouton Stop.
- Utilisation de l'outil de zoom, zoom sur la cellule activée jusqu'à ce que le facteur de zoom dans l'onglet Mode affiche 50 à 70.
- Arrêter le scan en sélectionnant le bouton Stop.
- Sous l'onglet Canaux désélectionner l'laser à ions argon (488 nm) et sélectionnez le Mai Tai laser.
- Sous l'onglet Mode de régler la vitesse de balayage à 31,46 sec.
- Sélectionnez le bouton Simple pour lancer le scan des deux photons d'activation de cage fluorescéine-dextran de la cellule sélectionnée.
- Après activation, décochez la case Mai Tai laser sous l'onglet Canaux, et resélectionner le laser à ions argon (488 nm).
- Régler le facteur de zoom dans le mode à 1, puis cliquez sur le bouton Max sous la rubrique de vitesse pour régler la vitesse la plus rapide de balayage.
- Sélectionnez xy rapide pour examiner la région photoactivé. Vérifiez que la région n'est pas photoactivé laser ablation. Pour plus d'informations sur l'ablation laser, s'il vous plaît se référer à la section de discussion.
- Répétez les étapes ci-dessus pour d'autres embryons.
4. Immunodétection de Uncaged fluorescéine-dextran (adapté de réf. 16)
- Après photoativation, placer un filtre transparent jaune en face de la source de lumière blanche et supprimer manuellement chaque embryon de basse température de fusion d'agarose en utilisant une pince forte. Placez tous les embryons supprimés dans un nouveau plat de Pétri contenant fraîche 1 X Danieau médias. Couvrir le plat de Pétri avec une feuille de métal pour éviter l'exposition des embryons à la lumière.
- Si nécessaire, l'arrière des embryons jusqu'au stade désiré de développement. En attendant, préparer une solution de paraformaldéhyde à 4% (voir Préparation des solutions). Aliquoter 1,5 ml de paraformaldéhyde préparé dans un tube à centrifuger.
- Après les embryons ont atteint le stade de développement d'intérêt, une pipette les embryons dans le tube à centrifuger (de l'étape 4.2). Couvrez le tube avec une feuille de métal pour éviter l'exposition à la lumière.
- Nutate le tube nuit à 4 ° C. Pour préparer le lendemain classés éthanol (EtOH) des solutions dans un tampon phosphate salin (PBS) et ddH 2 O, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: DDH 2 O, et 100% EtOH.
- Le lendemain, retirez les embryons à partir de 4 ° C. Retirez la feuille de métal recouvrant le tube d'aspiration et rapidement hors paraformaldehye (laisser un petit volume qui est suffisant pour couvrir les embryons). Pipeter 1,5 ml de 30% EtOH: PBS dans le tube. Re-couvrir le tube avec une feuille métallique. Nutate le tube à température ambiante pendant 10 min.
- Répétez l'étape 4.5 utilisant 50, 70 et 100% nivelées solutions EtOH. Après le lavage 100% EtOH, rincez à nouveau les embryons dans EtOH 100% pendant 10 minutes.
- Après les lavages, de stocker les embryons nuit à -20 ° C. Pour le lendemain de préparer un tampon phosphate Tween (PBT, voir Préparation des solutions), 5 tampons X blocage (voir le protocole du fabricant pour la préparation), l'acide maléique (protocole de préparation peut être trouvé dans le protocole de tampon de blocage), 10 mg / ml de protéinase K, et une solution d'anticorps 10 X (anti-fluorescéine-AP, voir Préparation des solutions).
- Préparez aussi 2% de sérum d'agneau (LS, voir Préparation des solutions) dilué dans PBT. Magasin de l'anticorps à 4 ° C pendant la nuit secouer sur un nutator. Le LS 2% peuvent être conservés à 4 ° C.
- Le lendemain enlever les embryons de -20 ° C. Retirez la feuille de métal recouvrant le tube d'aspiration et rapidement hors EtOH 100%. Ajouter 1,5 ml de EtOH à 70%: DDH 2 O pour le tube. Re-couvrir le tube avec une feuille métallique. Nutate le tube à température ambiante pendant 10 min.
- Répétez l'étape 4.8 utilisant 50 et 30% classés solutions EtOH, et 100% de PBT. Après le lavage 100% PBT, rincez les embryons fois 3 plus de 100% PBT pendant 10 minutes.
- Si les embryons sont plus vieux que 24 heures, la protéinase K de les traiter. Si non, passez à l'étape 4.13. Pour ce faire, diluer le prêt protéinase K (étape 4.7) 1:1000 dans PBT. Incuber les embryons dans la protéinase K pendant 10 minutes, ou plus si les embryons sont plus âgés. Gardez les embryons recouverts d'une feuille de métal pour éviter l'exposition à la lumière.
- Après la protéinase K traitement, se laver les embryons 5 fois en PBT pour 10 min. Après le lavage, fixer les embryons dans du paraformaldéhyde 4% pendant 30 min à température ambiante sur une nutator. Ensuite, lavez immédiatement les embryons 5 fois en PBT pour 10 min. Gardez les embryons recouverts d'une feuille de métal pour éviter l'exposition à la lumière.
- Faire tampon de blocage en diluant tampon 5 X bloque dans le tampon d'acide maléique à 1 X. Retirez les embryons de PBT et de les placer dans une mémoire tampon X blocage. Couvrir les embryons avec une feuille de métal et les nutate à température ambiante pendant 5 à 6 heures.
- Après 5 à 6 heures du choc thermique de blocage, les embryons à 65 ° C pendant 15 à 20 min.
- Obtenir la solution d'anticorps et le LS 2% préparée la veille. Centrifuger la solution d'anticorps au régime maxi. Transférer la phase aqueuse dans le tube LS 2%. Inverser le tube pour mélanger.
- Transfert des embryons à partir du tampon de blocage au mélange LS-anticorps. Gardez les embryons recouverts d'une feuille de métal pour éviter l'exposition à la lumière. Nutate les embryons à 4 ° C pendant la nuit.
- Le lendemain laver les embryons à la température ambiante 6 fois pendant 15 minutes dans le PBT. Préparer tampon AP (voir Préparation des solutions).
- Laver les embryons à température ambiante 2 fois pendant 10 minutes dans le tampon de l'AP. Préparer NBT / BCIP solution de développement (voir Préparation des solutions).
- Transfert des embryons au NBT / BCIP. Laissez la tache se développer dans l'obscurité.
- Arrêtez le développement par le lavage des embryons 3 fois en PBT pour 5 mn chacun.
- Pour l'acquisition des images monter les embryons de 0,6% point de fusion bas agarose ou méthylcellulose 3%, et d'acquérir des images à l'aide d'un microscope inversé composé ou debout.
- Échantillons photoactivé peut être conservé pour analyse future (coloration reste stable) en les déshydratant dans un lave-gradué EtOH. Suivez les étapes 4.4 à 4.7 pour la déshydratation des échantillons.
5. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Photoactivation de cage fluorescéine-dextran. (A, B) clair et image de fluorescence d'un embryon de poisson zèbre vue latérale au stade 13/14-somite avant photoactivation. (C, D) L'embryon a été photoactivé au stade the13/14-somite dans l'un des somites (flèche) avec une longueur d'onde de 740 nm, temps de cycle de 31 secondes, et une puissance laser moyenne de 47 mW. Post-activation, (d) la fluorescence de la fluorescéine-dextran Uncaged est observée. Orientation: dorsale (à droite), ventrale (à gauche). La barre d'échelle 100 um.
Figure 2. Immunodétection de cage fluorescéine-dextran. La figure 2 illustre l'immunomarquage d'Uncaged fluorescéine-dextran dans un embryon de poisson zèbre 18/19 HPF. Au stade 10 somites une petite région de l'embryon a été activé dans le mésoderme de la plaque latérale en utilisant les paramètres du laser même déclaré à la figure 1. En utilisant la procédure immunodétection, la flèche identifie la région activée avec la coloration de fond minimal. Orientation: dorsale (haut), ventrale (en bas). La barre d'échelle 100 um.
Discussion
Ce document décrit une méthode polyvalente pour la cartographie de la cellule destin unique basé sur la photoactivation de cage fluorescéine-dextran. Uncaging des cages fluorescéine-dextran dans des cellules individuelles est réalisé en utilisant absorption à deux photons d'un laser femtoseconde Maï Taï couplé au microscope Zeiss LSM 510 META confocale. Uncaged fluorescéine-dextran dans les cellules photoactivé est rapidement visualisées en utilisant une technique immunohistochimique simple.
Dans ce protocole la longueur d'onde d'absorption à deux photons pour photoactivation de cage fluorescéine-dextran est de 740 nm. Cette longueur d'onde a été déterminée expérimentalement par photoactivating cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté. La longueur d'onde d'excitation laser a été variée de 600 à 800 nm, et la présence ou l'absence de fluorescence de la fluorescéine après activation était qualitativement déterminé. Nous avons constaté que 740 nm produite l'activation du signal le plus fort fluorescéine suivants. Idéalement, 740 nm devrait fonctionner pour tous les systèmes de modèle, mais nous vous conseillons de tester un éventail de longueurs d'onde pour déterminer la longueur d'onde d'excitation optimale à deux photons pour votre échantillon.
En cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté, pour chaque longueur d'onde d'excitation à deux photons testé nous avons également fait varier la puissance du laser en moyenne. Pour une longueur d'onde d'excitation de 740 nm, une puissance laser moyenne de 47 mW produit un signal fort à la fluorescéine région activée en comparaison à la baisse des puissances laser moyenne. Supérieur puissances laser moyen n'a pas de produire des signaux de fluorescéine plus fort, mais l'ablation des tissus induits. Depuis impulsions laser femtoseconde sont efficaces à l'ablation de tissus biologiques 15, nous recommandons de déterminer la puissance du laser seuil moyen pour la photoactivation qui évite l'ablation des tissus.
Absorption à deux photons se produit dans un volume faible interaction. Pour assurer l'activation correcte de cage fluorescéine-dextran, la cellule doit être mis en évidence appropriée. Dans le protocole ci-dessus, cellules GFP-positives ont été simultanément imagé sous la lumière blanche pour confirmer l'accent cellule. Par conséquent, l'acquisition de lumière blanche en plus d'autres canaux est conseillé. Après avoir confirmé l'accent cellulaire, notre protocole suggère grossissant la cellule activée. Un facteur de zoom de 50 à 70 est suggéré, toutefois, cette valeur dépend de la taille de la cellule choisie. Accroître le zoom isole les cellules activées par les cellules adjacentes, et les limites de la zone de numérisation pour les deux photons d'activation. Idéalement, la zone de numérisation devrait couvrir une grande surface de la cellule.
Détection de simples cellules activées exige que le bruit de fond minime. Dans le protocole ci-dessus immunodétection, il est important que l'échantillon est bloqué en tampon de blocage pendant 5 à 6 heures (étape 4.13). Lors du développement avec le NBT / BCIP, Uncaged fluorescéine-dextran devrait devenir visible dans 10 à 20 minutes. Si la coloration de fond est solide, nous proposons un temps plus long blocage et lavages supplémentaires pour retirer l'anticorps (étape 4.17).
Les figures 1 et 2 fournissent des résultats représentatifs de la photoactivation et immunodétection. Dans la figure 1, au début 1 - 2 cellules embryons au stade de type sauvage ont été injectés avec cage fluorescéine-dextran. Les embryons ont été soulevées à la mi somitogenèse et monté à faible fondre agarose dans l'orientation latérale. La figure 1 (a, b) dépeignent clair et des images fluorescentes de l'embryon avant photoactivation. Preuve que l'embryon est resté Uncaged est démontré par l'absence de fluorescéine fluorescence dans la figure 1 (b). Une petite région au sein d'un somite a été activé avec une longueur d'onde de 740 nm pendant 31 secondes en utilisant un laser de puissance moyenne de 47 mW, la figure 1 (c; flèche). Post-activation, à deux photons de la fluorescéine uncaging-dextrane produit comme indiqué par la fluorescence de la zone est activée, la figure 1 (d; flèche). L'activation n'a pas été accompagnée par ablation laser, comme le tissu somitique est restée intacte, la figure 1 (c). La figure 2 montre l'immunodétection de Uncaged fluorescéine-dextran. Une petite région dans le mésoderme de la plaque latérale d'un embryon au stade 10 somites a été photoactivé utilisant les paramètres du laser mêmes que ceux mentionnés dans la figure 1. L'embryon a été soulevée et traitées en utilisant les étapes 4.1 à 4.20. La flèche de la figure 2 localise la région activée, comme indiqué par l'accumulation de précipité bleu. Seul l'emplacement est clairement détecté activé sans interférer coloration de fond.
Préparation des solutions:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g de BSA
10 ml de Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g de KCl
6,1 g de Na 2 HPO 4
1,9 g de KH 2 PO 4
ddH 2 O à 1 L
pH à 7,3
Paraformaldéhyde à 4% (160 ml)
Paraformaldéhyde 32% (deux flacons de 10 ml)
8 ml 20 X PBS
132 ml ddH 2 O
1 ml de NaCl 5 M
2,5 ml à 1 M MgCl 2
5 ml Tris 1 M pH 9,5
250 uL de Tween 20%
41,25 mL ddH 2 O
Solution d'anticorps (pour 1 échantillon)
5,5 uL poudre acétonique
40 ul PBT
0.8 LS uL
0,1 uL anti-fluorescéine-AP d'anticorps
LS 2% (360 ul pour 1 échantillon)
7.2 LS uL à 100%
352,8 uL PBT
1 X Danieau médias (1 L) ‡
11,6 ml 5 M de NaCl
700 uL 1 M KCl
400 pi 1 M MgSO 4
600 pi 1 M Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
ddH 2 O à 1 L
pH 7,6 à s'adapter à
‡ Danieau est une solution idéale de sel pour l'élevage des embryons de poisson zèbre dechorionated. D'autres médias peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient correctement avec des solutions isotoniques osmolarité (~ 300 mOsm pour le poisson zèbre)
NBT Stock (1 ml)
50 mg Nitro Bleu de tétrazolium
0,7 ml d'anhydride diméthyl formamide
0,3 ml ddH 2 O
BCIP stock (1 ml)
50 mg de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
1 ml d'anhydride diméthyl formamide
NBT / BCIP solution de développement
1 ml tampon AP
4,5 stock de NBT uL
3.5 Stock BCIP uL
Poudre acétonique
- Sélectionnez 20 poissons adultes et les congeler dans l'azote liquide.
- Broyer les poissons congelés avec un mortier et un pilon pour obtenir une poudre.
- Transférer la poudre de poisson dans un tube conique de 50 ml.
- Remplir le tube conique avec 100% d'acétone. Vortexer le tube.
- Spin le tube au régime maxi pendant 10 minutes. Jeter le surnageant.
- Laver le culot encore 3 fois dans de l'acétone à 100% et de spin le tube au régime maxi pendant 10 minutes. Par le dernier lavage du surnageant doit être limpide.
- Ajouter 100% d'acétone à la pastille à nouveau et laisser le tube à température ambiante. Les particules plus denses se déposent, tandis que les particules plus fines restent en suspension.
- Décanter les particules fines dans un nouveau tube. Aliquoter la solution de poudre dans des tubes séparés et de les stocker à -20 ° C.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions J. Chen pour fournir le protocole de synthèse en cage fluorescéine-dextran. Cette recherche a été soutenue par le Mars de la sentence Dimes 5-FY09-78, l'American Heart Association Award 09BGIA2090075, et le prix du NIH / NHLBI R01-01 à HL107369 SS Un merci spécial à C. Closson pour son aide microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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