Summary
Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.
Abstract
De mogelijkheid om differentiële label enkele cellen heeft belangrijke gevolgen in de ontwikkelingsbiologie. Bijvoorbeeld, het bepalen van hoe hematopoëtische, lymfe-en bloedvaten lineages ontstaan in de ontwikkeling van embryo's nodig lot in kaart brengen en lineage tracing van ongedifferentieerde voorloper cellen. Onlangs fotoactiveerbare eiwitten die onder andere: hebben Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 en KikGR 9, 10 ontvangen brede interesse als cel tracing sondes. De fluorescentie spectrum van deze lichtgevoelige eiwitten kunnen eenvoudig worden omgebouwd met UV-excitatie, waardoor een populatie van cellen te onderscheiden van degenen naast. Echter, de photoefficiency van de geactiveerde eiwit limiet op lange termijn cell tracking 11. Als alternatief voor fotoactiveerbare eiwitten, heeft gekooid fluoresceïne-dextran grote schaal gebruikt in embryo modelsystemen 7, 12-14. Traditioneel, te bevrijden fluoresceïne-dextran, UV-excitatie van een fluorescentie lamp huis of een enkel foton UV-laser is gebruikt, maar dergelijke bronnen beperken de ruimtelijke resolutie van fotoactivatie. Hier hebben we melding van een protocol om het lot kaart, afkomst te traceren en te detecteren single gelabelde cellen. Individuele cellen in embryo's geïnjecteerd met gekooide fluoresceïne-dextran zijn gefotoactiveerd met nabij-infrarood laserpulsen uit een titaan-saffier femtoseconde laser. Deze laser is gebruikelijk in alle twee-foton confocale microscopen, zoals de LSM 510 META NLO microscoop gebruikt in deze krant. Omdat biologisch weefsel is transparant voor nabij-infrarood bestraling 15, kan de laser pulsen diep worden geconcentreerd binnen het embryo, zonder uncaging cellen boven of onder de geselecteerde focal plane. Daarom is niet-lineair twee-foton absorptie veroorzaakt alleen bij de geometrische focus fluoresceïne-dextran vrij maken in een enkele cel. Voor het detecteren van de cel met Uncaged fluoresceïne-dextran, beschrijven we een eenvoudig protocol 16 immunohistochemie om snel te visualiseren de geactiveerde cel. De activering en detectie protocol gepresenteerd in dit artikel is veelzijdig en kan worden toegepast op elk model systeem.
Opmerking: De gebruikte reagentia in dit protocol is te vinden in de tabel toegevoegd aan het eind van het artikel.
Protocol
1. Synthese van gekooide fluoresceïne-dextran (overgenomen van Ref. 14)
- Bereid een 0,1 M oplossing van natriumboraat verdund in DDH 2 O.
- Maatregel 4 mg van 10 kDa aminodextran en voeg deze toe aan de CMNB-kooien fluoresceïne buis.
- Voeg 500 ul van de bereide natriumboraatoplossing (stap 1.1) naar de CMNB-kooien fluoresceïne buis. Cap de buis en vortex gedurende 30 seconden om het mengsel te ontbinden.
- Laat het mengsel een nacht reageren op een nutator bij kamertemperatuur. Bedek de buis met metaalfolie om de blootstelling van het mengsel aan het omgevingslicht te voorkomen.
- Verkrijgen van een Zeba ontzouten spin-kolom en draai de onderste dop. Markeer een stip op de kolom, die zal worden gebruikt te oriënteren in de kolom bij het centrifugeren. Plaats de kolom in een 15 ml conische Falcon buis. Opmerking: De oplossing in de spin kolom is kolom buffer.
- Draai de dop op de ontzouten spin-kolom. Plaats de 15 ml conische Falcon buis die het ontzouten spin-kolom huizen in een centrifuge. Orient de spin kolom met de gemarkeerde stip (stap 1.4) naar het midden van de centrifuge rotor. Centrifugeer de buis bij 1000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Na het centrifugeren, verwijder het ontzouten spin-kolom uit de Falcon buis. Gooi zowel de verzamelde doorstroming en de 15 ml conische buis. Verkrijgen van een nieuwe 15 ml conische Falcon tube, en plaats het ontzouten spin-kolom in de nieuwe Falcon buis. Opmerking: Na het centrifugeren, de kolom harsbed moeten verschijnen verdicht. Direct gebruik van de kolom.
- Verkrijgen van de gereageerde mengsel (gekooid fluoresceïne-dextran) in stap 1.3. Verwijder de dop van de spin kolom en zuig de gereageerde mengsel en langzaam toe te passen op het midden van het ontzouten spin-kolom. Na het aanbrengen van de gereageerde mengsel, vervang dan de dop op de spin kolom.
- Plaats de Falcon buis die het ontzouten spin-kolom huizen in een centrifuge. Zoals gedaan in stap 1.5, oriënteren de spin kolom met de gemarkeerde stip naar het midden van de centrifuge rotor. Centrifugeer de buis bij 1000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Na het centrifugeren, zal een geel mengsel (gekooid fluoresceïne-dextran) worden verzameld (ongeveer 400 pi) in de 15 ml Falcon buis. Breng de gekooide fluoresceïne-dextran mengsel aan een 1,5 mL microcentrifugebuis.
- Direct betrekking hebben op de buis met metaalfolie om de blootstelling van het mengsel aan het omgevingslicht te voorkomen. Lyophilize de gekooide fluoresceïne-dextran mengsel in een speedvac. Vriesdroging van 350 pi duurt ongeveer 4 uur.
- Na volledige vriesdrogen, resuspendeer de poeder (ongeveer 3 mg) in DDH 2 O tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1% w / v. Meng door kort vortexen om het poeder op te schorten.
- Aliquot de gekooide fluoresceïne-dextran in afzonderlijke metalen folie bedekt buizen, en bewaar ze bij -20 ° C.
2. Het oogsten van embryo's en micro-injectie van gekooide fluoresceïne-dextran
* Deze procedure maakt gebruik van de zebravis als het dier modelsysteem.
- Op de dag voor injecties, opgericht zebravis kruis ofwel 01u01 man-naar-vrouw of 2:1 man-naar-vrouw in kweekbakken met verdeelschotten.
- De volgende morgen veranderen de kweekbak water en verwijder de verdelers. Onmiddellijk voor te bereiden een 5 il 1 / 10 verdunde oplossing van gekooide fluoresceïne-dextran in een van beide een X Danieau media (zie Voorbereiding van Solutions), of DDH 2 O. Bedek de werkoplossing buis met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Pipetteer de voorbereide gekooide fluoresceïne-dextran-oplossing (stap 2.2) in de naald. Voor het snijden van de naald tip om een passende omvang onder de dissectie microscoop, een stukje doorzichtig geel filter voor het witte lichtbron. De gele filter voorkomt dat spontane uncaging van de fluoresceïne-dextran tijdens de injecties. Als je door het oculair oculair, moet de lichtbron verschijnen geel.
- Verzamel embryo's en pipet ze in een micro-injectie mal lade. Stel de micro-injectie tijd om nL te leveren 3 tot 4 van gekooide fluoresceïne-dextran. Onder de dissectie microscoop, oriënteren de embryo's met een pincet en injecteer (3 tot 4 nL) gekooid fluoresceïne-dextran in de basis van de blastomeer cellen (blastomeer-dooier-interface). Het embryo podium voor injectie dient te worden 1 - tot 2-cellig stadium.
- Na de injectie, verwijder de embryo's uit de micro-injectie vorm lade en plaats ze in een schone petrischaaltje met verse vis water. Methyleenblauw kunnen worden toegevoegd aan de vis water om schimmelgroei te voorkomen dat bij een uiteindelijke concentratie van ten 0,02% w / v. Dek de petrischaal met metalen folie om te voorkomen dat uncaging van de geïnjecteerde gekooide fluoresceïne-dextran.
- Verhoog de geïnjecteerde embryo's om een stadium waarin de cellen van belang moeten worden gefotoactiveerd. Voor fotoactivatie, bereiden een 0,6% laagsmeltende agarose oplossing in DDH 2 O. Afhankelijk van het embryo podium, tricaïne (MS222) kunnen worden toegevoegd aan de lage smeltpunt agarose. Om dit te doen, verdunnen 0.02% tricaïne in laagsmeltende agarose tot een uiteindelijke concentratie van 0,0014%.
- Zodra de embryo's het juiste ontwikkelingsstadium, dechorionate de embryo's in 1 X Danieau media met een pincet te bereiken. Wanneer dechorionating, zorg ervoor dat een transparant geel filter wordt geplaatst in het pad van de witte lichtbron (zie stap 2.3).
- Verwarm de 0,6% laagsmeltende agarose-oplossing tot 37 ° C. Pipetteer 1 ml van laagsmeltende agarose in de put van een LabTek chambered dekglaasje dia. Monteer 3-4 embryo's in laag smeltpunt agarose en oriënteren ze met een pincet met de cellen te gefotoactiveerd naar beneden gericht tegen de onderkant dekglaasje aan.
- Laat de agarose te stollen. Na het stollen, pipet 1 mL van een X Danieau media over de agarose.
- Herhaal de stappen 2,8 tot 2,9 voor meer embryo's.
3. Twee-foton activering van gekooide fluoresceïne-dextran
* Deze procedure wordt ervan uitgegaan dat het embryo verslaggever GFP uitdrukt. Het embryo wordt bekeken met behulp van de argon-ion (488 nm) laser bron verbonden aan de LSM 510 META NLO microscoop. Een enkele GFP positieve cel wordt geselecteerd en gefotoactiveerd het gebruik van de Mai Tai laser (femtoseconde laser) gekoppeld aan de LSM 510. De procedure is hetzelfde voor niet-fluorescerende embryo's. Als alternatief kan wit licht worden gebruikt om de cel te worden geactiveerd, gevolgd door activering van het gebruik van de Mai Tai laser bron te vinden.
- Laad de LSM 510 software. Plaats een transparant geel filter in het witte licht stralengang.
- Selecteer Scannen Nieuwe afbeelding en klik op Start Expert-modus.
- Selecteer het tabblad Laser. Zet de argon-ion (488 nm) en Mai Tai (femtoseconde) laser bronnen.
- Stel de Mai Tai golflengte tot 740 nm.
- Selecteer het tabblad config. Stel het optische pad configuratie voor de argon-ion-en Mai Tai laser.
- Selecteer het tabblad Scannen. Wijzig de doelstelling om 20X/0.8.
- Stel de maximale scansnelheid door te klikken op Max.
- Set Mode, Method, en nummer Line, Mean, en 1.
- Onder het tabblad Channels deselecteer alle laser-bronnen, behalve voor de Mai Tai.
- Plaats een power meter in de optische stralengang.
- Selecteer de Cont-knop om continu scannen te activeren.
- Pas de transmissie% tot de macht meter leest een gemiddeld laservermogen van 47 mW.
- Stop de scan door het selecteren van de knop Stop.
- Onder het tabblad Channels schakelt u het Mai Tai laserbron en selecteer de argon-ion (488 nm).
- Selecteer de Fast xy-knop. Onder het tabblad Kanalen aanpassen van de pinhole, detector te krijgen, versterker offset, en de versterker te krijgen voor de argon-ion-laser om de beste beeldkwaliteit te bereiken.
- Met behulp van de stage controller, te vinden en zich richten op de cel te activeren.
- Klik op de knop Stop.
- Met behulp van de zoom-tool, zoom in op de geactiveerde cel tot aan de zoom-factor onder de Mode tabblad 50 naar 70.
- Stop de scan door het selecteren van de knop Stop.
- Onder het tabblad Channels schakelt u het argon-ion-laser (488 nm) en selecteer de Mai Tai laser.
- Onder het tabblad Modus stel de scansnelheid tot 31.46 sec.
- Selecteer de Single-knop om het scannen op twee-foton activering van gekooide fluoresceïne-dextran van de geselecteerde cel te starten.
- Na activering, schakelt u de Mai Tai laser onder het tabblad Channels, en opnieuw de argon-ion-laser (488 nm).
- Stel de zoomfactor in Mode 1 en klik op de Max-knop onder de Speed op weg naar de snelste scansnelheid in te stellen.
- Selecteer Snel xy om de gefotoactiveerd regio herzien. Controleer of de gefotoactiveerd regio niet is laser geablateerd. Voor meer informatie over laser ablatie, verwijzen wij u naar de discussie sectie.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor de andere embryo's.
4. Immunodetectie van Uncaged fluoresceïne-dextran (overgenomen van Ref. 16)
- Na photoativation, een transparant geel filter voor het witte lichtbron en handmatig te verwijderen uit elk embryo laagsmeltende agarosegel met behulp van scherpe tang. Plaats alle verwijderde embryo's in een nieuwe petrischaaltje met verse 1 X Danieau media. Dek de petrischaal met metaalfolie om de blootstelling van embryo's aan het licht te voorkomen.
- Indien nodig, achter de embryo's om de gewenste ontwikkelingsstadium. In de tussentijd bereiden een 4% paraformaldehyde oplossing (zie bereiding van oplossingen). Aliquot 1,5 ml van de bereide paraformaldehyde in een microcentrifugebuis.
- Nadat de embryo's hebben bereikt het ontwikkelingsstadium van belang, pipet de embryo's in de microcentrifugebuis (vanaf stap 4.2). Bedek de buis met metalen folie om de blootstelling aan licht te voorkomen.
- 'S nachts Nutate de buis bij 4 ° C. Voor de volgende dag voor te bereiden ethanolreeks (EtOH) oplossingen in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en DDH 2 O, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: DDH 2 O, en 100% EtOH.
- De volgende dag, verwijdert u de embryo's van 4 ° C. Verwijder de metalen folie voor de buis en snel aspireren uit paraformaldehye (achter een klein volume dat is genoeg om de embryo's te dekken). Pipetteer 1,5 ml 30% EtOH: PBS in de buis. Re-cover van de buis met metaalfolie. Nutate de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Herhaal stap 4.5 met 50, 70, en 100% gesorteerd EtOH oplossingen. Na de 100% EtOH wassen, weer spoelen de embryo's in 100% EtOH voor 10 minuten.
- Na het wassen, 's nachts op te slaan van de embryo's bij -20 ° C. Voor de volgende dag voor te bereiden fosfaatgebufferde tussen (PBT, zie Voorbereiding van de Solutions), 5 X blokkerende buffer (zie fabrikant protocol voor voorbereiding), maleïnezuur (protocol voor de voorbereiding kan worden gevonden in het blokkeren van buffer-protocol), 10 mg / ml proteinase K, en een 10 X antilichaam-oplossing (Anti-fluoresceïne-AP, zie bereiding van oplossingen).
- Ook voorbereiden 2% lam serum (LS, zie bereiding van oplossingen) verdund in PBT. Bewaar het antilichaam bij 4 ° C gedurende de nacht schudden op een nutator. De 2% LS kan worden bewaard bij 4 ° C.
- De volgende dag te verwijderen van de embryo's van -20 ° C. Verwijder de metalen folie voor de buis en snel aspireer uit 100% EtOH. Voeg 1,5 ml 70% EtOH: DDH 2 O aan de buis. Re-cover van de buis met metaalfolie. Nutate de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Herhaal stap 4.8 met behulp van 50 en 30% gesorteerd EtOH-oplossingen, en 100% PBT. Na de 100% PBT te wassen, drie keer spoelen de embryo's in 100% PBT voor 10 minuten.
- Als de embryo's ouder zijn dan 24 uur, proteinase K behandelen. Zo niet, ga dan naar stap 4.13. Om dit te doen, verdunnen de voorbereide proteinase K (stap 4.7) 1:1000 in PBT. Incubeer de embryo's in proteinase K voor 10 minuten, of langer indien de embryo's ouder zijn. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Na de proteinase K behandeling, was de embryo's vijf keer in PBT voor 10 minuten. Na het wassen, herstellen de embryo's in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een nutator. Daarna onmiddellijk wassen de embryo's vijf keer in PBT voor 10 minuten. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Maak blokkerende buffer door verdunning van 5 X blokkerende buffer in maleïnezuur buffer om een X. de embryo's Verwijderen uit PBT en leg ze in 1 X blokkeert buffer. Bedek de embryo's met metaalfolie en nutate bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 6 uur.
- Na 5 tot 6 uur blokkeren, heat shock de embryo's bij 65 ° C gedurende 15 tot 20 minuten.
- Verkrijgen van het antilichaam oplossing en de 2% LS bereid de vorige dag. Centrifugeer het antilichaam oplossing op max toeren per minuut. Breng de waterige fase naar de 2% LS buis. Keer de buis om te mengen.
- Overdracht van de embryo's uit het blokkeren van buffer naar de LS-antilichaam mengsel. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Nutate de embryo's bij 4 ° C gedurende de nacht.
- De volgende dag was de embryo's bij kamertemperatuur zes keer voor 15 minuten in PBT. Bereid AP buffer (zie bereiding van oplossingen).
- Was de embryo's bij kamertemperatuur 2 keer voor 10 minuten in de AP-buffer. Bereid NBT / BCIP het ontwikkelen van oplossing (zie bereiding van oplossingen).
- Overdracht van de embryo's te NBT / BCIP. Laat de vlek te ontwikkelen in het donker.
- Stoppen met de ontwikkeling door het wassen van de embryo's drie keer in PBT voor 5 minuten per stuk.
- Voor het imago van acquisitie Monteer de embryo's in 0,6% laag smeltpunt agarose of 3% methylcellulose, en het verwerven van beelden met behulp van een omgekeerde of rechtop samengestelde microscoop.
- Gefotoactiveerd monsters kunnen worden opgeslagen voor toekomstige analyse (vlekken blijft stabiel) door het dehydrateren van hen in een gegradeerde EtOH wassen. Volg de stappen 4.4 tot en met 4.7 voor het drogen van de monsters.
5. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Fotoactivatie van gekooide fluoresceïne-dextran. (A, B) helderveld en fluorescentie beeld van een zijaanzicht zebravis embryo in het stadium vóór 13/14-somite fotoactivatie. (C, D) De embryo werd gefotoactiveerd in the13/14-somite stadium in een van de somieten (pijl) met een golflengte van 740 nm, scantijd van 31 seconden, en een gemiddelde laservermogen van 47 mW. Post-activering, (d) fluorescentie van Uncaged fluoresceïne-dextran wordt waargenomen. Oriëntatie: Dorsale (rechts), buik (links). Schaalbalk 100 micrometer.
Figuur 2. Immunodetectie van gekooide fluoresceïne-dextran. Figuur 2 geeft de immunokleuring van Uncaged fluoresceïne-dextran in een 18/19 hpf zebravis embryo. Bij de 10-somiet stadium een klein gebied van het embryo werd geactiveerd in de laterale plaat mesoderm met behulp van dezelfde laser parameters vermeld in figuur 1. Met behulp van de immunodetectie procedure, de pijl geeft de geactiveerde regio met een minimale achtergrondkleuring. Oriëntatie: Dorsale (boven), Ventraal (onder). Schaalbalk 100 micrometer.
Discussion
Dit artikel beschrijft een veelzijdige methode voor single lot van de cel in kaart brengen op basis van de fotoactivering van gekooide fluoresceïne-dextran. Uncaging van gekooide fluoresceïne-dextran in enkele cellen wordt bereikt met behulp van twee-foton absorptie van een Mai Tai femtoseconde laser gekoppeld aan de Zeiss LSM 510 META confocale microscoop. Uncaged fluoresceïne-dextran in gefotoactiveerd cellen snel gevisualiseerd met behulp van een eenvoudige immunohistochemie procedure.
In dit protocol de twee-foton absorptie golflengte voor fotoactivering van gekooide fluoresceïne-dextran is 740 nm. Deze golflengte werd experimenteel bepaald door photoactivating gekooid fluoresceïne-dextran geïnjecteerd wildtype embryo's. De laser excitatie golflengte werd gevarieerd 600 tot 800 nm, en de aanwezigheid of afwezigheid van fluoresceïne fluorescentie post-activatie was kwalitatief bepaald. Wij vonden dat 740 nm het sterkste signaal fluoresceïne na activering geproduceerd. Idealiter zou 740 nm werk voor alle model-systemen, maar wij adviseren het testen van een reeks van golflengten om het optimale twee-foton excitatie golflengte te bepalen voor uw monster.
In gekooid fluoresceïne-dextran geïnjecteerd wildtype embryo's, voor elke twee-foton excitatie golflengte getest we ook de gemiddelde laservermogen gevarieerd. Voor een excitatie golflengte van 740 nm, een gemiddeld laser vermogen van 47 mW produceerde een sterker fluoresceïne signaal op de geactiveerde regio in vergelijking met de gemiddelde laser bevoegdheden lager. Hogere gemiddelde laser bevoegdheden leverden geen sterker fluoresceïne signalen, maar veroorzaakte ablatie van het weefsel. Sinds femtoseconde laser pulsen worden efficiënt in het wegnemen van biologisch weefsel 15, raden wij aan het bepalen van de drempel gemiddelde laservermogen voor fotoactivatie dat weefsel ablatie vermijdt.
Twee-foton absorptie plaatsvindt binnen een klein interactie volume. Voor een goede activering van gekooide fluoresceïne-dextran, moet de cel worden gebracht in de juiste focus. In het bovenstaande protocol werden de GFP-positieve cellen tegelijk afgebeeld onder wit licht naar cel zich te bevestigen. Daarom, wit licht overname in aanvulling op andere kanalen aan te raden. Na het bevestigen cel focus, ons protocol suggereert het uitvergroten van de geactiveerde cel. Een zoomfactor van 50 tot 70 wordt voorgesteld, echter, deze waarde is afhankelijk van de grootte van de gekozen cel. Het verhogen van de zoom isoleert de geactiveerde cel van aangrenzende cellen, en beperkt het scangebied voor twee-foton activering. Idealiter zou de scan gebied bestrijken een groot gebied van de cel.
Detectie van een geactiveerde cellen vereist dat de achtergrondkleuring minimaal zijn. In het bovenstaande immunodetectie protocol is het belangrijk dat de steekproef is geblokkeerd in het blokkeren van buffer voor 5 tot 6 uur (stap 4.13). Bij de ontwikkeling van met NBT / BCIP, Uncaged fluoresceïne-dextran moeten zichtbaar in 10 tot 20 minuten. Als achtergrondkleuring sterk is, stellen we voor een langere tijd te blokkeren en extra wast aan het antilichaam (stap 4.17) te verwijderen.
Figuren 1 en 2 geven representatieve resultaten van fotoactivatie en immunodetectie. In Figuur 1, vroege 1 - tot 2-cellig stadium wildtype embryo's werden ingespoten met gekooide fluoresceïne-dextran. De embryo's werden verhoogd tot midden somitogenesis en gemonteerd in een laag smeltende agarose in de laterale richting. Figuur 1 (a, b) tot uitdrukking komen helderveld en fluorescerende beelden van het embryo voordat fotoactivatie. Het bewijs dat het embryo nog Uncaged wordt aangetoond door de afwezigheid van fluoresceïne fluorescentie in Figuur 1 (b). Een kleine regio binnen een somiet werd geactiveerd met een golflengte van 740 nm voor 31 seconden basis van een gemiddelde laservermogen van 47 mW, figuur 1 (c, pijl). Post-activering, twee-foton uncaging van fluoresceïne-dextran voorgedaan zoals blijkt uit de fluorescentie van de geactiveerde gebied, figuur 1 (d, pijl). Activatie ging niet gepaard met laser ablatie, zoals de somitic weefsel intact gebleven, figuur 1 (c). Figuur 2 toont de immunodetectie van Uncaged fluoresceïne-dextran. Een kleine regio in het laterale plaat mesoderm van een 10-somiet stadium embryo was gefotoactiveerd met behulp van dezelfde laser parameters zoals vermeld in figuur 1. Het embryo werd opgeheven en verwerkt met behulp van de stappen 4.1 tot 4.20. De pijl in figuur 2 plaatst de regio actief is, zoals aangegeven door de accumulatie van blauwe neerslag. Alleen de geactiveerde locatie duidelijk gedetecteerd zonder storende achtergrond kleuring.
Voorbereiding van de oplossingen:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 ml 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
DDH 2 O tot en met 1 L
pH naar 7,3
4% Paraformaldehyde (160 ml)
32% Paraformaldehyde (twee 10 ml flacons)
8 ml 20 X PBS
132 ml DDH 2 O
1 ml 5 M NaCl
2,5 mL 1 M MgCl 2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 ui 20% Tween
41,25 mL DDH 2 O
Antilichaam-oplossing (voor een voorbeeld)
5,5 pi Aceton poeder
40 uL PBT
0,8 pi LS
0,1 pi Anti-fluoresceïne-AP antilichaam
2% LS (360 il voor 1 monster)
7,2 pi 100% LS
352,8 pi PBT
1 X Danieau media (een L) ‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 pi 1 M KCl
400 pi 1 M MgSO 4
600 pi 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
DDH 2 O tot en met 1 L
pH tot 7,6
‡ Danieau is een ideale zoutoplossing voor het kweken van dechorionated zebravis embryo's. Andere media worden gebruikt, op voorwaarde dat ze isotone oplossingen met de juiste osmolariteit (~ 300 mOsm voor zebravis)
NBT voorraad (1 ml)
50 mg Nitro Blue tetrazolium
0,7 ml dimethyl formamide anhydride
0,3 mL DDH 2 O
BCIP voorraad (1 ml)
50 mg 5-broom-4-chloor-3-fosfaat indolyl
1 ml dimethyl formamide anhydride
NBT / BCIP ontwikkeloplossing
1 mL buffer AP
4,5 pi NBT voorraad
3,5 pi BCIP voorraad
Aceton poeder
- Selecteer 20 volwassen vissen en vries ze in vloeibare stikstof.
- Maal de bevroren vis met een mortier en een stamper tot een poeder.
- Breng de vis poeder in een 50 ml conische buis.
- Vul de conische buis met 100% aceton. Vortex de buis.
- Spin de buis op max. rpm gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
- Was de pellet nog 3 keer in 100% aceton en draai de buis op max. rpm gedurende 10 minuten. Door de laatste was het supernatant moet helder.
- Voeg 100% aceton om de pellet weer en laat de buis staan bij kamertemperatuur. Hoe meer dichte deeltjes zullen vestigen, terwijl de fijnere deeltjes blijven in suspensie.
- Schenk de fijne deeltjes in een nieuwe buis. Aliquot het poeder oplossing in aparte buizen en bewaar ze bij -20 ° C.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken J. Chen voor het verstrekken van de gekooide fluoresceïne-dextran synthese-protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de March of Dimes award 5-FY09-78, de American Heart Association Award 09BGIA2090075, en de NIH / NHLBI award R01 HL107369-01 naar SS Een speciale dank aan C. Closson voor zijn microscopie hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
