Summary
Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.
Abstract
Die Fähigkeit, differenziert label Einzelzellen hat wichtige Auswirkungen in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel bestimmen, wie hämatopoetischen, lymphatischen und Blutgefäß-Linien in sich entwickelnden Embryonen entstehen erfordert Schicksal Mapping und Abstammung Verfolgung von undifferenzierten Vorläuferzellen. Kürzlich photoaktivierbaren Proteine, die zählen: haben Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 und KikGR 9, 10 breites Interesse als Zell-Tracing-Sonden aufgenommen. Das Fluoreszenzspektrum von diesen lichtempfindlichen Proteine lassen sich mit UV-Anregung umgewandelt werden, so dass eine Population von Zellen aus benachbarten unterscheiden. Allerdings kann die photoefficiency des aktivierten Protein Grenze langfristige Zelltracking 11. Als Alternative zu photoaktivierbaren Proteine hat caged Fluorescein-Dextran weithin in Embryo-Modell Systeme 7, 12-14 verwendet. Traditionell zu Uncage Fluorescein-Dextran, UV-Anregung aus einem Fluoreszenz-Lampe Haus oder ein einzelnes Photon UV-Laser verwendet wurde, jedoch begrenzen solchen Quellen die räumliche Auflösung der Photoaktivierung. Hier berichten wir über ein Protokoll, das Schicksal Karte, Linie zu verfolgen und erkennen einzigen markierten Zellen. Einzelne Zellen in Embryonen mit caged Fluorescein-Dextran injiziert werden mit Nahinfrarot-Laser-Pulsen aus einem Titan-Saphir-Femtosekundenlaser erzeugt photoaktivierte. Dieser Laser ist in allen Zwei-Photonen konfokalen Mikroskopen wie dem LSM 510 META NLO-Mikroskop in diesem Dokument verwendet üblich. Da biologisches Gewebe ist transparent für Nah-Infrarot-Bestrahlung 15 kann die Laserpulse tief im Inneren des Embryos ausgerichtet sein, ohne Uncaging Zellen oberhalb oder unterhalb der ausgewählten Bildebene. Daher ist nicht-lineare Zwei-Photonen-Absorption nur im geometrischen Mittelpunkt bewogen, Fluorescein-Dextran in einer einzigen Zelle Uncage. Zum Nachweis der Zelle mit uncaged Fluorescein-Dextran, beschreiben wir eine einfache immunhistochemischen 16 bis schnell visualisieren activated cell. Die Aktivierung und Detektion Protokoll in diesem Beitrag vorgestellte ist vielseitig und kann zu jedem Modell aufgebracht werden.
Hinweis: Die Reagenzien werden in diesem Protokoll kann in der Tabelle am Ende des Artikels angehängt gefunden werden.
Protocol
1. Synthese von caged Fluorescein-Dextran (nach Lit.. 14)
- Bereiten Sie eine 0,1 M Lösung von Natrium-Borat in ddH 2 O verdünnt
- Maßnahme 4 mg von 10 kDa Aminodextran und fügen Sie es dem CMNB-caged Fluorescein Röhre.
- Add 500 mL der vorbereiteten Natriumboratlösung (Schritt 1,1), die CMNB-caged Fluorescein Röhre. Verschließen Sie die Tube und Wirbel für 30 Sekunden, um die Mischung zu lösen.
- Lassen Sie die Mischung über Nacht reagieren auf Kolbenpendel bei Raumtemperatur. Decken Sie die Röhrchen mit Metallfolie, um die Exposition der Mischung auf das Umgebungslicht zu verhindern.
- Besorgen Sie sich einen Zeba entsalzen Spin-Säule und drehen Sie die untere Kappe. Markieren Sie einen Punkt auf der Säule, die zur Orientierung verwendet werden, wenn die Säule zentrifugiert. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml konischen Falcon-Röhrchen. Hinweis: Die Lösung in der Spin-Säule ist Säulenpuffer.
- Lösen Sie die Abdeckkappe auf der entsalzen Spin-Säule. Legen Sie die 15 ml konischen Falcon-Röhrchen, dass die Spin-Säule entsalzt Häuser in einer Zentrifuge. Richten Sie die Spin-Säule mit dem markierten Punkt (Schritt 1,4) vor der Mitte des Zentrifugenrotor. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
- Nach dem Zentrifugieren, entfernen Sie die entsalzen Spin-Säule aus dem Falcon-Röhrchen. Entsorgen Sie sowohl die gesammelten Durchströmung und die 15 ml konischen Röhrchen. Fordern Sie ein neues 15 ml konischen Falcon-Röhrchen, und platzieren Sie den entsalzen Spin-Säule in den neuen Falcon-Röhrchen. Hinweis: Nach dem Zentrifugieren der Säule Harzbett sollte verdichtet erscheinen. Verwenden Sie die Spalte sofort.
- Besorgen Sie sich die umgesetzte Gemisch (caged Fluorescein-Dextran) in Schritt 1.3. Entfernen Sie die Schutzkappe von der Spin-Säule und saugen Sie den Reaktionsaustrag und wenden Sie es langsam auf die Mitte des entsalzen Spin-Säule. Nach dem Auftragen der Reaktionsaustrag, ersetzen Sie die Kappe auf dem Spin-Säule.
- Legen Sie die Falcon-Röhrchen, dass die Spin-Säule entsalzt Häuser in einer Zentrifuge. Wie in Schritt 1,5, orientieren die Spin-Säule mit dem markierten Punkt vor der Mitte des Zentrifugenrotor getan. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
- Nach der Zentrifugation wird eine gelbe Mischung (caged Fluorescein-Dextran) gesammelt (etwa 400 ul) in der 15 ml-Falcon-Röhrchen werden. Übertragen Sie die caged Fluorescein-Dextran-Gemisch in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß.
- Unmittelbar Deckel des Röhrchens mit Metallfolie, um die Exposition der Mischung auf das Umgebungslicht zu verhindern. Lyophilisieren den Käfig Fluorescein-Dextran-Gemisch in einer Speedvac. Gefriertrocknung von 350 ul dauert etwa 4 Stunden.
- Nach vollständiger Gefriertrocknung, resuspendieren das Pulver (ca. 3 mg) in ddH 2 O, um eine endgültige Konzentration von etwa 1% w / v. Mix durch kurzes Vortexen, um das Pulver zu suspendieren.
- Aliquot der Käfig Fluorescein-Dextran in separate Metallfolie abgedeckt Rohre, und lagern Sie sie bei -20 ° C.
2. Die Ernte von Embryonen und die Mikroinjektion von caged Fluorescein-Dextran
* Bei diesem Verfahren wird der Zebrafisch als Tiermodell-System.
- Am Tag vor Injektionen, bis Zebrafisch Kreuze entweder 1:1 Mann-zu-Frau-oder 2:1 Mann-zu-Frau-in Zuchtbecken mit Teilern gesetzt.
- Am nächsten Morgen ändern Aufzuchtbecken Wasser und entfernen Sie den Teilern. Unmittelbar bereiten ein 5 ul 1 / 10 verdünnt funktionierende Lösung von caged Fluorescein-Dextran in entweder 1 X Danieau Medien (siehe Herstellung von Lösungen) oder ddH 2 O. Decken Sie die funktionierende Lösung Rohr mit Metallfolie Lichteinfall zu verhindern.
- Pipette den vorbereiteten Käfig Fluorescein-Dextran-Lösung (Schritt 2,2) in die Nadel. Vor dem Schneiden der Nadelspitze auf eine geeignete Größe unter den Dissektionsmikroskop, ein Stück aus transparentem Gelbfilter vor der weißen Lichtquelle. Der gelbe Filter spontane Uncaging der Fluorescein-Dextran während Injektionen zu vermeiden. Beim Blick durch das Okular Okular, sollte die Lichtquelle gelb erscheinen.
- Sammeln Embryonen und Pipette sie in eine Mikroinjektion Schimmel Fach. Stellen Sie die Mikroinjektion Zeit von 3 bis 4 nL liefern von caged Fluorescein-Dextran. Unter dem Dissektionsmikroskop, orientieren die Embryonen mit einer Pinzette und injizieren (3 bis 4 nL) Fluorescein-Dextran in die Basis der Blastomere Zellen (Blastomeren-Eigelb-Schnittstelle) eingesperrt. Der Embryo Bühne für die Injektion sollte 1 - bis 2-Zell-Stadium.
- Nach der Injektion entfernen die Embryonen aus der Mikroinjektion Schimmel Fach und legen Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fisch Wasser. Methylenblau kann, um die Fische Wasser hinzugefügt werden, um Pilzwachstum zu einer Endkonzentration von verhindern bei 0,02% w / v. Deckel der Petrischale mit Metallfolie zu verhindern Uncaging der injizierten caged Fluorescein-Dextran.
- Heben Sie den injizierten Embryonen zu einem Stadium, wenn die Zellen von Interesse photoaktivierte werden müssen. Für Photoaktivierung, bereiten Sie einen 0,6% niedrig schmelzender Agarose-Lösung in ddH 2 O. Je nach Embryonalstadium, Tricaine (MS222) kann auf der niedrig schmelzenden Agarose hinzugefügt werden. Um dies zu tun, verdünnte 0,02% Tricaine in niedrig schmelzender Agarose in einer Endkonzentration von 0,0014%.
- Sobald die Embryonen der entsprechenden Entwicklungsstufe, dechorionate die Embryonen in 1 X Danieau Medien mit einer Pinzette zu erreichen. Wenn dechorionating, stellen Sie sicher, dass eine transparente Gelbfilter in den Weg der weißen Lichtquelle platziert wird (siehe Schritt 2.3).
- Erhitzen Sie die 0,6% niedrig schmelzender Agarose-Lösung auf 37 ° C. Je 1 mL der niedrig schmelzenden Agarose in die Vertiefung einer LabTek chambered Deckglas gleiten. Vorsichtig aufsetzen 3 bis 4 Embryonen in niedrig schmelzender Agarose und orientieren sie mit einer Pinzette in den Zellen, photoaktivierte nach unten gegen den Boden Deckglas werden.
- Lassen Sie die Agarose zu verfestigen. Nach dem Erstarren Pipette 1 ml 1 X Danieau Medien über die Agarose.
- Wiederholen Sie die Schritte von 2,8 bis 2,9 für mehr Embryonen.
3. Zwei-Photonen-Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran
* Dieses Verfahren setzt voraus, dass der Embryo Reporter GFP zum Ausdruck bringt. Der Embryo wird eine Anzeige mit dem Argon-Ionen-(488 nm) Laserquelle an der LSM 510 META NLO-Mikroskop. Ein einzelner GFP positive Zellen ausgewählt und photoaktivierte mit dem Mai Tai Laser (Femtosekundenlaser) gekoppelt, um die LSM 510. Das Verfahren ist das gleiche für nicht-fluoreszierenden Embryonen. Alternativ kann weißes Licht verwendet, um die Zelle aktiviert werden, durch die Aktivierung mit dem Mai Tai Laserquelle gefolgt zu finden.
- Laden Sie das LSM 510 Software. Legen Sie ein transparentes Gelb-Filter in das weiße Licht Strahlengang.
- Wählen Sie Neues Bild scannen und klicken Sie auf Start Expert Mode.
- Wählen Sie die Registerkarte Laser. Schalten Sie den Argon-Ionen-(488 nm) und Mai Tai (Femtosekunden) Laserquellen.
- Stellen Sie die Mai Tai Wellenlänge von 740 nm auf.
- Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration. Setzen Sie den Lichtweg-Konfiguration für den Argon-Ionen und Mai Tai-Laser.
- Wählen Sie die Registerkarte Scannen. Ändern Sie das Ziel, 20X/0.8.
- Stellen Sie die max Scan-Geschwindigkeit, indem Sie max.
- Set Mode, Methode und Anzahl an Line, Mean, und 1.
- Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie alle Laserquellen mit Ausnahme des Mai Tai.
- Legen Sie eine Power-Meter in den optischen Strahlengang.
- Wählen Sie das Cont-Taste, um kontinuierliche Abtastung aktivieren.
- Passen Sie die Übertragung% bis zum Power-Meter liest eine mittlere Laserleistung von 47 mW.
- Stoppen Sie den Scan, indem Sie die Stopp-Taste.
- Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie das Mai Tai Laserquelle und wählen Sie die Argon-Ionen-(488 nm).
- Wählen Sie die Schnelle xy-Taste. Unter der Registerkarte Kanäle Einstellung der Lochkamera, Detektor Gain, Verstärker-Offset und Verstärkung des Verstärkers für die Argon-Ionen-Laser, um die beste Bildqualität zu erzielen.
- Mit dem Stufen-Regler, finden und sich auf die Zelle zu aktivieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Stop.
- Mit dem Zoom-Werkzeug, zoomen Sie auf die aktivierte Zelle, bis Sie den Zoomfaktor unter der Registerkarte Modus zeigt von 50 bis 70.
- Stoppen Sie den Scan, indem Sie die Stopp-Taste.
- Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie die Argon-Ionen-Laser (488 nm) und wählen Sie die Mai Tai-Laser.
- Unter der Registerkarte Modus stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 31,46 sek.
- Wählen Sie die Ein-Knopf, um die Suche nach Zwei-Photonen-Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran der ausgewählten Zelle zu beginnen.
- Nach der Aktivierung, deaktivieren Sie das Mai Tai Laser unter der Registerkarte Kanäle, und wählen Sie erneut die Argon-Ionen-Laser (488 nm).
- Stellen Sie den Zoom-Faktor unter-Modus auf 1, und klicken Sie auf den Max-Taste unter dem Speed-Überschrift zu den schnellsten Scan-Geschwindigkeit eingestellt.
- Wählen Sie Fast-xy, die photoaktivierte Region zu überprüfen. Prüfen Sie, ob die photoaktivierte Region nicht Lasers abgetragen. Für weitere Informationen über Laser-Ablation, entnehmen Sie bitte dem Abschnitt Diskussion.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für andere Embryonen.
4. Immundetektion von uncaged Fluorescein-Dextran (nach Lit. 16).
- Nach photoativation, legen Sie ein transparentes Gelb-Filter vor der weißen Lichtquelle und manuell entfernen jedem Embryo aus niedrig schmelzender Agarose mit scharfen Zangen. Legen Sie alle entfernt Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem 1 X Danieau Medien. Deckel der Petrischale mit Metallfolie, um die Exposition von Embryonen, um Licht zu verhindern.
- Falls erforderlich, hinten die Embryonen, um die gewünschte Entwicklungsstadium. In der Zwischenzeit bereiten 4% Paraformaldehyd-Lösung (siehe Herstellung von Lösungen). Aliquot von 1,5 ml der vorbereiteten Paraformaldehyd in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Nach den Embryonen der Entwicklungsphase von Interesse erreicht haben, Pipette die Embryonen in die Mikrozentrifugenröhrchen (aus Schritt 4.2). Decken Sie die Röhrchen mit Metallfolie, um Lichteinwirkung zu verhindern.
- Nutation das Rohr über Nacht bei 4 ° C. Für den nächsten Tag vorzubereiten Ethanol (EtOH)-Lösungen in Phosphatpuffer (PBS) und ddH 2 O benotet, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: ddH 2 O und 100% EtOH.
- Am nächsten Tag, entfernen Sie den Embryonen von 4 ° C. Entfernen Sie die Metallfolie für die Röhre und schnell absaugen Abs.formaldehye (hinterlässt ein kleines Volumen, das genug, um die Embryonen Abdeckung). Pipette 1,5 ml 30% EtOH: PBS in die Röhre. Re-Cover das Rohr mit einer Metallfolie. Nutation der Röhre bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Wiederholen Sie Schritt 4.5 mit 50, 70 und 100% eingestuft EtOH-Lösungen. Nach der 100% EtOH waschen, spülen die Embryonen wieder in 100% EtOH für 10 min.
- Nach dem Waschen, speichern Sie die Embryonen über Nacht bei -20 ° C. Für den nächsten Tag vorzubereiten phosphatgepufferte zwischen (PBT, siehe Herstellung von Lösungen), 5 X Blocking-Puffer (siehe Herstellerangaben Protokoll für Vorbereitung), Maleinsäure (Protokoll für die Herstellung in den Blocking-Puffer-Protokoll gefunden werden), 10 mg / ml Proteinase K und 10 X-Antikörper-Lösung (Anti-Fluorescein-AP, siehe Herstellung von Lösungen).
- Auch für das 2% Lamm Serum (LS, siehe Herstellung von Lösungen) in PBT verdünnt. Shop der Antikörper bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln auf einer Kolbenpendel. Die 2% LS kann bei 4 ° C aufbewahrt werden
- Am nächsten Tag nehmen Sie die Embryonen von -20 ° C. Entfernen Sie die Metallfolie für die Röhre und schnell absaugen 100% EtOH. Fügen Sie 1,5 ml 70% EtOH: ddH 2 O, um das Rohr. Re-Cover das Rohr mit einer Metallfolie. Nutation der Röhre bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Wiederholen Sie Schritt 4.8 Verwendung 50 und 30% eingestuft EtOH-Lösungen, und 100% PBT. Nach der 100% PBT waschen, spülen die Embryonen noch 3 mal in 100% PBT für 10 Minuten.
- Wenn die Embryonen älter als 24 Stunden sind, behandeln Proteinase K ihnen. Wenn nicht, fahren auf 4,13 Schritt. Um dies zu tun, verdünnte die vorbereitete Proteinase K (Schritt 4.7) 1:1000 in PBT. Inkubieren Sie die Embryonen in Proteinase K für 10 Minuten oder länger, wenn die Embryonen älter sind. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern.
- Nach Proteinase K-Behandlung, waschen Sie die Embryonen 5 Mal in PBT für 10 Minuten. Nach dem Waschen, fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel. Danach sofort abwaschen die Embryonen 5 Mal in PBT für 10 Minuten. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern.
- Machen Blockierungspuffer durch Verdünnen von 5 X Blockierungspuffer in Maleinsäure-Puffer auf 1 X. Nehmen Sie den Embryonen aus PBT und legen Sie sie in 1 X Blockpuffer. Decken Sie die Embryonen mit Metallfolie und Nutation sie bei Raumtemperatur für 5 bis 6 Stunden.
- Nach 5 bis 6 Stunden blockiert, Hitzeschockprotein die Embryonen bei 65 ° C für 15 bis 20 Minuten.
- Besorgen Sie sich die Antikörper-Lösung und die 2%-LS vorbereitet vom Vortag. Centrifuge der Antikörper-Lösung bei maximaler Drehzahl. Übertragen Sie die wässrige Phase, die 2% LS Röhre. Das Röhrchen zu mischen.
- Übertragen Sie die Embryonen aus Blocking-Puffer in die LS-Antikörper-Gemisch. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern. Nutation die Embryonen bei 4 ° C über Nacht.
- Am nächsten Tag waschen die Embryonen bei Raumtemperatur 6 mal für 15 Minuten in PBT. Bereiten Sie AP-Puffer (siehe Herstellung von Lösungen).
- Waschen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur 2 mal für 10 Minuten in AP-Puffer. Bereiten NBT / BCIP entwickelt Lösung (siehe Herstellung von Lösungen).
- Übertragen Sie die Embryonen NBT / BCIP. Lassen Sie den Fleck in der Dunkelheit zu entwickeln.
- Stoppen Sie die Entwicklung durch das Waschen der Embryonen 3 mal in PBT für je 5 min.
- Für Bildaufnahme montieren die Embryonen in 0,6% niedrig schmelzender Agarose oder 3% Methylcellulose, und Bilder aufzunehmen, mit einem umgekehrten oder aufrechten zusammengesetzte Mikroskop.
- Photoactivated Proben können zur späteren Analyse (Färbung stabil bleibt) durch Dehydratisierung von ihnen in einer abgestuften EtOH waschen gespeichert werden. Folgen Sie den Schritten 4,4 bis 4.7 zur Dehydratisierung der Proben.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran. (A, B) Hellfeld-und Fluoreszenz-Bild einer Seitenansicht Zebrafisch Embryo im Stadium vor 13/14-somite Photoaktivierung. (C, D) Der Embryo bei the13/14-somite Bühne war in einer der Somiten (Pfeil) mit einer Wellenlänge von 740 nm photoaktivierte, Scan-Zeit von 31 Sekunden beendet, und eine mittlere Laserleistung von 47 mW. Post-Aktivierung, (d) Fluoreszenz von uncaged Fluorescein-Dextran beobachtet wird. Orientierung: Dorsal (rechts), Ventral (links). Maßstabsbalken 100 um.
Abbildung 2. Immundetektion von Fluorescein-Dextran Käfig. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung uncaged Fluorescein-Dextran in einem 18/19 hpf Zebrafischembryo. An der 10-Somiten-Stadium eine kleine Region des Embryos wurde in den seitlichen Mesoderm mit dem gleichen Laser-Parameter in Abbildung 1 angegeben aktiviert. Mit dem Verfahren Immundetektion, identifiziert den Pfeil der aktivierten Region mit minimaler Hintergrundfärbung. Orientierung: Dorsal (oben), Ventral (unten). Maßstabsbalken 100 um.
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine vielseitige Methode für einzelne Zelle Schicksal Zuordnung auf dem Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran basiert. Uncaging von caged Fluorescein-Dextran in einzelnen Zellen erfolgt mittels Zwei-Photonen-Absorption aus einem Mai Tai Femtosekundenlaser gekoppelt an die Zeiss LSM 510 META konfokalen Mikroskop. Uncaged Fluorescein-Dextran in photoaktivierte Zellen schnell visualisiert mit Hilfe eines einfachen Verfahrens Immunhistochemie.
In diesem Protokoll werden die Zwei-Photonen-Absorption Wellenlänge für Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran 740 nm. Diese Wellenlänge wurde experimentell durch photoaktivierenden caged Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen bestimmt. Die Anregungswellenlänge des Lasers wurde von 600 bis 800 nm variiert, und das Vorhandensein oder Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz post-Aktivierung wurde qualitativ bestimmt. Wir fanden, dass 740 nm am stärksten Fluorescein-Signal nach der Aktivierung erzeugt. Idealerweise sollte 740 nm für alle Modell-Systemen arbeiten, aber wir raten Testen einer Bandbreite von Wellenlängen, um die optimale Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge für Ihre Probe zu bestimmen.
In Käfigen Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen, für jeden Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge testeten wir auch variiert die durchschnittliche Laserleistung. Für eine Anregungswellenlänge von 740 nm, eine mittlere Laserleistung von 47 mW erzeugt eine stärkere Fluorescein-Signal an der aktivierten Region im Vergleich zur durchschnittlichen Laserleistungen zu senken. Höhere durchschnittliche Laserleistungen nicht produzieren stärkere Fluorescein-Signale, sondern induzierte Ablation des Gewebes. Da Femtosekunden-Laserpulsen bei Ablation von biologischem Gewebe 15 sind effiziente, empfehlen wir die Bestimmung der Schwelle mittlerer Laserleistung für Photoaktivierung, dass Gewebeablation vermeidet.
Zwei-Photonen-Absorption liegt in einem kleinen Volumen Interaktion. Um eine ordnungsgemäße Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran, muss die Zelle in die richtige Fokus gebracht werden. In dem obigen Protokoll wurden GFP-positiven Zellen gleichzeitig unter weißem Licht abgebildet, um Zell-Fokus zu bestätigen. Daher ist weißes Licht Übernahme zusätzlich zu den anderen Kanälen sinnvoll. Nach der Bestätigung Zelle zu konzentrieren, schlägt unser Protokoll Vergrößerungsglas der aktivierten Zelle. Ein Zoomfaktor von 50 bis 70 vorgeschlagen wird, hängt jedoch von diesem Wert auf die Größe der ausgewählten Zelle. Die Erhöhung der Zoom-Isolate der aktivierten Zelle von benachbarten Zellen, und die Grenzen der Scan-Bereich für Zwei-Photonen-Aktivierung. Idealerweise sollte der Scan-Bereich decken einen großen Bereich der Zelle.
Detektion von einzelnen aktivierten Zellen erfordert, dass die Hintergrundfärbung minimal sein. In der oben Immundetektion Protokoll ist es wichtig, dass die Probe in Blocking-Puffer für 5 bis 6 Stunden (Schritt 4,13) blockiert ist. Bei der Entwicklung mit NBT / BCIP, uncaged Fluorescein-Dextran sollte sichtbar in 10 bis 20 Minuten. Wenn Hintergrundfärbung stark ist, schlagen wir vor, eine längere Sperrzeit und zusätzliche Wäschen an den Antikörper (Schritt 4,17) zu entfernen.
Abbildungen 1 und 2 liefern repräsentative Ergebnisse Photoaktivierung und Immundetektion. In Abbildung 1, Anfang der 1 - bis 2-Zell-Stadium Wildtyp Embryonen wurden mit caged Fluorescein-Dextran injiziert. Die Embryonen wurden bis Mitte Somitogenese angehoben und montiert in niedrig schmelzender Agarose in die seitliche Ausrichtung. Abbildung 1 (a, b) zeigen Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos vor Photoaktivierung. Der Nachweis, dass der Embryo uncaged geblieben ist, ist durch das Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz in Abbildung 1 (b) gezeigt. Eine kleine Region innerhalb eines Somiten wurde mit einer Wellenlänge von 740 nm für 31 Sekunden mit einer mittleren Laserleistung von 47 mW, Abbildung 1 (, Pfeil c) aktiviert. Post-Aktivierung, Zwei-Photonen-Uncaging von Fluorescein-Dextran aufgetreten, als durch die Fluoreszenz von den aktivierten Bereich, Abbildung 1 (d; Pfeil). Die Aktivierung war nicht durch Laserablation begleitet, da die somitic Gewebe intakt geblieben, Abbildung 1 (c). Abbildung 2 zeigt die Immundetektion von uncaged Fluorescein-Dextran. Eine kleine Region im lateralen Mesoderm eines 10-Somiten-Stadium Embryo photoaktivierte mit dem gleichen Laser-Parameter wie in Abbildung 1 erwähnt. Der Embryo wurde erhoben und verarbeitet unter Verwendung der Schritte 4.1 bis 4.20. Der Pfeil in Abbildung 2 lokalisiert die Region aktiviert, da durch die Ansammlung von blauen Niederschlages angezeigt. Nur die aktivierten Lage ist klar, ohne störende Hintergrundfärbung erkannt.
Herstellung von Lösungen:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 ml 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
ddH 2 O auf 1 L
pH auf 7,3
4% Paraformaldehyd (160 ml)
32% Paraformaldehyd (zwei 10-ml-Fläschchen)
8 mL 20 X PBS
132 ml ddH 2 O
1 mL 5 M NaCl
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 ul 20% Tween
41,25 mL ddH 2 O
Antikörper-Lösung (für 1 Probe)
5,5 ul Aceton Pulver
40 ul PBT
0,8 ul LS
0,1 ul Anti-Fluorescein-AP-Antikörper
2% LS (360 ul für 1 Probe)
7,2 ul 100% LS
352,8 ul PBT
1 X Danieau Medien (1 L) ‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 ul 1 M KCl
400 ul 1 M MgSO 4
600 ul 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
ddH 2 O auf 1 L
pH auf 7,6 einstellen
‡ Danieau ist eine ideale Salzlösung für die Aufzucht dechorionated Zebrabärblinge. Andere Medien verwendet werden können, vorausgesetzt, sie sind isotonische Lösungen mit richtig Osmolarität (~ 300 mOsm für Zebrafisch)
NBT Lager (1 ml)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 ml Dimethylformamid Anhydrid
0,3 ml ddH 2 O
BCIP Lager (1 ml)
50 mg 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat
1 mL Dimethylformamid Anhydrid
NBT / BCIP Entwicklerlösung
1 mL AP-Puffer
4,5 ul NBT Lager
3,5 ul BCIP Lager
Acetonpulver
- Wählen Sie 20 ausgewachsene Fische und frieren sie in flüssigem Stickstoff.
- Grind der gefrorenen Fisch mit einem Mörser und Stößel, um ein Pulver.
- Übertragen Sie die Fische Pulver in ein 50 ml konischen Röhrchen.
- Füllen Sie den konischen Rohr mit 100% Aceton. Vortex die Röhre.
- Drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Überstand verwerfen.
- Waschen des Pellets noch 3-mal in 100% Aceton und drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Mit dem letzten Waschgang der Überstand sollte klar.
- Add 100% Aceton, das Pellet wieder und lassen das Rohr bei Raumtemperatur stehen gelassen. Je dichter Teilchen entscheiden wird, während die feineren Partikel in der Schwebe bleiben.
- Dekantieren die feinen Partikel in eine neue Röhre. Aliquot des Pulvers Lösung in getrennten Röhren und lagern Sie sie bei -20 ° C.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken J. Chen für die Bereitstellung der Käfig Fluorescein-Dextran-Synthese-Protokoll. Diese Arbeit wurde von der March of Dimes Auszeichnung 5-FY09-78, die American Heart Association Award 09BGIA2090075 unterstützt, und die NIH / NHLBI Auszeichnung R01 HL107369-01 bis SS Ein besonderes Dankeschön an C. Closson für seine Mikroskopie Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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