Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

Published: October 5, 2011 doi: 10.3791/3172
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Division of Hematology/Oncology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

Abstract

היכולת דיפרנציאלי תווית תאים בודדים יש השלכות חשובות בביולוגיה התפתחותית. למשל, לקבוע כיצד היווצרות הדם, הלימפה, כלי הדם שושלות להתעורר עוברים לפתח מחייב מיפוי גורל השושלת העתקה של תאים מבשר מובחן. לאחרונה, חלבונים photoactivatable הכוללים: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, קאךה 4-7, pKindling 8, KikGR 9, 10 קיבלו אינטרס רחב כמו בדיקות מעקב התא. ספקטרום הקרינה של החלבונים האלה רגישים ניתן להמיר בקלות עם עירור UV, המאפשר אוכלוסייה של תאים כדי להבחין בין אלה סמוכים. עם זאת, photoefficiency של החלבון הפעיל עלול להגביל בטווח הארוך מעקב תא 11. כחלופה חלבונים photoactivatable, בכלוב והעמסת-dextran כבר בשימוש נרחב במודל מערכות העובר 7, 12-14. באופן מסורתי, כדי uncage והעמסת-dextran, עירור UV מבית המנורה הקרינה או לייזר יחיד UV פוטון נעשה שימוש, אולם מקורות כגון להגביל את הרזולוציה המרחבית של photoactivation. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפת גורל, זכר השושלת, וכדי לזהות תאים תווית אחת. תאים יחיד בעוברים הזריקו בכלוב והעמסת-dextran הם photoactivated עם קרוב אינפרא אדום פעימות לייזר המופק לייזר femtosecond טיטניום ספיר. לייזר זה נהוג בכל שני הפוטונים מיקרוסקופים confocal כמו מיקרוסקופ 510 LSM NLO META בשימוש בנייר זה. מאז רקמות ביולוגיות שקופה קרינה אינפרא אדום הקרוב 15, קטניות הלייזר יכול להיות ממוקד עמוק ללא משחררות רפרוף תאים מעל או מתחת למישור המוקד נבחרים בתוך העובר. לכן, שאינו ליניארי שני הפוטונים קליטה מושרה רק במוקד גיאומטריים uncage והעמסת-dextran בתא בודד. כדי לזהות את התא המכיל שברחה מכלוב והעמסת-dextran, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אימונוהיסטוכימיה 16 במהירות כדי להמחיש את התא הפעיל. פרוטוקול הפעלה וזיהוי המוצג במאמר זה הוא צדדי יכול להיות מיושם על כל מערכת מודל.

הערה: חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלה המצורפת בסוף המאמר.

Protocol

1. סינתזה של בכלוב והעמסת-dextran (עיבוד Ref. 14)

  1. הכן פתרון 0.1 M של נתרן borate מדולל DDH 2 O.
  2. מדוד 4 מ"ג 10 kDa aminodextran ולהוסיף אותו צינור והעמסת CMNB-בכלוב.
  3. הוספת 500 μL של הפתרון נתרן מוכן borate (שלב 1.1) על הצינור והעמסת CMNB-בכלוב. שווי הצינור ואת מערבולת למשך 30 שניות כדי לפזר את התערובת.
  4. אפשר התערובת להגיב על לילה nutator בטמפרטורת החדר. מכסים את הצינור עם רדיד מתכת כדי למנוע חשיפה של התערובת אל אור הסביבה.
  5. השג טור desalt זבה ספין ולסובב את הפקק התחתון. סמן נקודה על הטור, אשר ישמשו כדי לכוון את הטור כאשר centrifuging. מניחים את העמודה צינור 15 מ"ל פלקון חרוטי. הערה: הפתרון בעמודה ספין היא חיץ העמודה.
  6. שחרר את המכסה העליון על עמודת ספין desalt. מניחים את 15 מ"ל חרוטי צינור פלקון כי הבתים טור ספין desalt בצנטריפוגה. המזרח טור ספין עם נקודה המסומן (שלב 1.4) מול מרכז הרוטור צנטריפוגות. צנטריפוגה התחתית XG 1000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העמודה ספין desalt מהצינור פלקון. מחק גם את הזרימה שנאספו דרך צינור חרוטי 15 מ"ל. השג חדש 15 מ"ל צינור חרוטי פלקון, והמקום טור ספין desalt בצינור פלקון חדש. הערה: לאחר centrifuging, המיטה שרף טור אמור להופיע נדחס. השתמש בעמודה מיד.
  8. השג את תערובת הגיב (בכלוב והעמסת-dextran) בשלב 1.3. הסר את מכסה מהעמודה ספין לשאוב את התערובת הגיב ולהחיל אותו לאט למרכז הטור ספין desalt. לאחר החלת תערובת הגיבו, להחליף את הכובע על העמוד ספין.
  9. מניחים את הצינור פלקון כי הבתים טור ספין desalt בצנטריפוגה. נעשה כמו 1.5 צעד, לכוון את הטור ספין עם נקודה המסומן מול מרכז הרוטור צנטריפוגות. צנטריפוגה התחתית XG 1000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. לאחר צנטריפוגה, תערובת צהוב (בכלוב והעמסת-dextran) ייאספו (כ 400 μL) של צינור פלקון 15 מ"ל. העברת בכלוב והעמסת-dextran התערובת צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
  11. מיד לכסות את התחתית ברדיד מתכת כדי למנוע חשיפה של התערובת אל אור הסביבה. Lyophilize בכלוב והעמסת-dextran התערובת speedvac. Lyophilization של 350 μL צריך לקחת כ 4 שעות.
  12. לאחר lyophilization מלאה, resuspend את האבקה (כ 3 מ"ג) ב DDH 2 O ריכוז סופי של כ 1% w / v. מערבבים על ידי לחיצה קצרה vortexing להשעות את האבקה.
  13. Aliquot בכלוב והעמסת-dextran לתוך נפרד לסכל צינורות מתכת מכוסה, ולאחסן אותם ב -20 ° C.

2. קציר של עוברים microinjection בכלוב של והעמסת-dextran

* נוהל זה משתמש דג הזברה כמערכת מודל של בעלי חיים.

  1. יום לפני זריקות, להגדיר חוצה דג הזברה או 01:01 זכר אל נקבה או זכר 02:01 ל-הרבייה הנשית טנקים עם חוצצים.
  2. למחרת בבוקר, לשנות את מיכל מים הרבייה להסיר את המחיצות. מיד להכין 5 פתרון μL 1 / 10 של עובד בדילול בכלוב והעמסת-dextran באחת 1 X Danieau התקשורת (ראו הכנת פתרונות) או DDH 2 O. מכסים את הצינור פתרון לעבוד עם רדיד מתכת כדי למנוע חשיפה לאור.
  3. פיפטה הכינו בכלוב והעמסת-dextran פתרון (שלב 2.2) לתוך המחט. לפני חיתוך קצה מחט לגודל המתאים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, במקום חתיכת מסנן צהוב שקוף מול מקור אור לבן. מסנן צהוב שימנע משחררות רפרוף ספונטנית של והעמסת-dextran במהלך זריקות. כאשר מחפשים דרך היצירה עין עיניים, מקור האור אמור להופיע צהוב.
  4. איסוף עוברים פיפטה אותם לתוך מגש עובש microinjection. קבע את הזמן microinjection לספק 3-4 NL בכלוב של והעמסת-dextran. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לכוון את העוברים עם מלקחיים להזריק (3-4 NL) בכלוב והעמסת-dextran לבסיס של תאים blastomere (blastomere-חלמון ממשק). השלב עובר להזרקה צריכה להיות 1 - לשלב 2 תאים.
  5. לאחר ההזרקה, להסיר את העוברים ממגש עובש microinjection ומניחים אותם בצלחת פטרי נקי המכיל מים דגים טריים. כחול מתילן ניתן להוסיף מים הדגים כדי למנוע צמיחת הפטרייה בריכוז הסופי של ב 0.02% w / v. מכסים את צלחת פטרי עם נייר אלומיניום כדי למנוע משחררות רפרוף של הזריקו בכלוב והעמסת-dextran.
  6. הרם את העוברים מזריקים לשלב כאשר תאים של עניין צריך להיות photoactivated. עבור photoactivation, להכין 0.6% נמוך פתרון agarose נמס DDH 2 O. בהתאם בשלב העובר, Tricaine (MS222) ניתן להוסיף ההיתוך agarose נמוך. כדי לעשות זאת, לדלל 0.02% Tricaine נמוך ההיתוך agarose לריכוז סופי של 0.0014%.
  7. ברגע העוברים מגיעים לשלב ההתפתחותי המתאים, dechorionate עוברים 1 X Danieau התקשורת עם מלקחיים. כאשר dechorionating, ודא כי מסנן צהוב שקוף ממוקם בנתיב של מקור אור לבן (ראה שלב 2.3).
  8. מחממים את 0.6% נמוך פתרון agarose נמס על 37 ° C. פיפטה 1 מ"ל של ההיתוך agarose נמוך לתוך הבאר של שקופית coverglass LabTek החדרים. בזהירות הר 3-4 עוברים התכה נמוכה agarose ו לכוון אותם עם מלקחיים עם התאים להיות photoactivated כלפי מטה כנגד coverslip התחתונה.
  9. אפשר agarose כדי לחזק. לאחר התמצקות, פיפטה 1 מ"ל של 1 X Danieau התקשורת על agarose.
  10. חזור על שלבים 2.8-2.9 עבור עוברים יותר.

3. שני הפוטונים הפעלת בכלוב והעמסת-dextran

* הליך זה מניח כי העובר מבטא GFP הכתב. העובר מוצג באמצעות ארגון יון (488 ננומטר) מקור לייזר המחוברים מיקרוסקופ 510 LSM NLO META. תא ה-GFP אחד חיובי נבחרה photoactivated באמצעות המאי טאי לייזר (לייזר femtosecond) מצמידים את LSM 510. ההליך הוא זהה עבור מי שאינם עוברים פלורסנט. לחלופין, אור לבן יכול לשמש כדי למצוא את התא כדי להיות מופעל, ואחריו הפעלה באמצעות מקור המאי טאי לייזר.

  1. טען את תוכנת 510 LSM. הנח מסנן צהוב שקוף נתיב האור הלבן קרן.
  2. בחר סריקת תמונה חדשה לחץ על התחל מצב מומחה.
  3. בחר את הכרטיסייה לייזר. הפעל את יון ארגון (488 ננומטר) מאי טאי (femtosecond) מקורות לייזר.
  4. הגדר את המאי טאי הגל 740 ננומטר.
  5. בחר את הכרטיסייה config. הגדר את תצורת הנתיב אופטי עבור יון ארגון ומאי טאי לייזר.
  6. בחר את הכרטיסייה סריקה. שינוי אובייקטיבי 20X/0.8.
  7. קבע את מהירות הסריקה מקסימום ידי לחיצה על מקס.
  8. מצב הגדר, שיטה, ומספר לקו, ממוצע, ו 1.
  9. תחת בטל ערוצים בכרטיסייה כל לייזר מקורות חוץ המאי טאי.
  10. מניחים מד הכוח בנתיב קרן אופטית.
  11. בחר את לחצן המשך כדי להפעיל סריקה רציפה.
  12. התאם את השידור% עד מד הכוח קורא כוח לייזר ממוצע של 47 mW.
  13. תפסיק את הסריקה על ידי בחירת כפתור עצור.
  14. בכרטיסייה ערוצים בטל את המאי טאי מקור לייזר לבחור את יון ארגון (488 ננומטר).
  15. בחר בלחצן xy מהיר. בכרטיסייה ערוצים להתאים את חריר, לזכות גלאי, מגבר אופסט, ולהשיג מגבר עבור יון ארגון לייזר על מנת להשיג את איכות התמונה הטובה ביותר.
  16. שימוש בבקר הבמה, למצוא ולהתמקד התא להפעיל.
  17. לחץ על לחצן עצור.
  18. שימוש בכלי זום, זום על התא הפעיל עד הגורם זום תחת הכרטיסייה מצב מציג 50-70.
  19. תפסיק את הסריקה על ידי בחירת כפתור עצור.
  20. תחת בטל ערוצים בכרטיסייה יון ארגון לייזר (488 ננומטר) ובחר את המאי טאי לייזר.
  21. בכרטיסייה מצב לקבוע את מהירות הסריקה 31.46 שניות.
  22. בחר בלחצן בודד כדי להתחיל בסריקה עבור הפעלת שני פוטונים של בכלוב והעמסת-dextran של התא הנבחר.
  23. לאחר ההפעלה, בטל את המאי טאי לייזר תחת הלשונית ערוצים, וכן לבחור מחדש את יון ארגון לייזר (488 ננומטר).
  24. הגדר את הגורם תחת מצב זום 1, ולחץ על הלחצן מהירות מקס תחת הכותרת כדי לקבוע את מהירות הסריקה המהירה ביותר.
  25. בחר xy מהיר לסקור את האזור photoactivated. בדוק את האזור photoactivated אינו לייזר ablated. לקבלת מידע נוסף על אבלציה לייזר, עיין בסעיף הדיון.
  26. חזור על השלבים לעיל עבור עוברים אחרים.

4. Immunodetection שברחה מכלוב של והעמסת-dextran (עיבוד Ref. 16)

  1. לאחר photoativation, במקום מסנן צהוב שקוף מול מקור האור הלבן להסיר באופן ידני את כל העובר מן התכה נמוכה agarose באמצעות מלקחיים חדה. שמים את כל העוברים הסיר בצלחת פטרי חדשה המכילה טרי 1 X Danieau התקשורת. מכסים את צלחת פטרי עם נייר אלומיניום, כדי למנוע חשיפה של עוברים לאור.
  2. במידת הצורך, החלק האחורי עוברים לשלב ההתפתחותי הרצוי. בינתיים, להכין פתרון paraformaldehyde 4% (ראה הכנת פתרונות). Aliquot 1.5 מ"ל של paraformaldehyde מוכן לתוך צינור microcentrifuge.
  3. אחרי העוברים הגיעו לשלב ההתפתחותי של עניין, פיפטה עוברים לתוך הצינור microcentrifuge (משלב 4.2). מכסים את הצינור עם רדיד מתכת כדי למנוע חשיפה לאור.
  4. Nutate צינור לילה בשעה 4 ° C. למחרת להכין מדורגים (EtOH) פתרונות אתנול חיץ מלח פוספט (PBS) ו DDH 2 O, 30% EtOH: PBS, EtOH 50%: PBS, EtOH 70%: DDH 2 O, ו - 100 EtOH%.
  5. למחרת, להסיר את העוברים מתוך 4 ° C. הסר את רדיד מתכת המכסים את הצינור במהירות לשאוב את סעיףformaldehye (להשאיר בנפח קטן זה מספיק כדי לכסות את העוברים). פיפטה 1.5 מ"ל של EtOH 30%: PBS לתוך הצינור. Re-לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום. Nutate הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  6. חזור על שלב 4.5 באמצעות 50, 70, ו 100% ציון פתרונות EtOH. לאחר לשטוף את EtOH 100%, יש לשטוף את העוברים שוב EtOH 100% במשך 10 דקות.
  7. לאחר שוטפת, בחנות עוברים בין לילה ב -20 ° C. למחרת להכין בופר פוספט tween (PBT, לראות הכנה של פתרונות), 5 X חיץ חסימה (ראה פרוטוקול היצרן להכנת), חומצה maleic (פרוטוקול להכנת ניתן למצוא בפרוטוקול חיץ חסימה), 10 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K, ופתרון 10 X נוגדנים (אנטי והעמסת-AP, לראות הכנה של פתרונות).
  8. כמו כן להכין 2% טלה בסרום (LS; לראות הכנה של פתרונות) מדולל PBT. אחסן את הנוגדן ב 4 ° C למשך הלילה רועד על nutator. LS 2% יכול להיות כל הזמן ב 4 ° C.
  9. למחרת להסיר את העוברים מ -20 ° C. הסר את רדיד מתכת המכסים את הצינור במהירות לשאוב את EtOH 100%. הוסף 1.5 מ"ל של EtOH 70%: DDH 2 O ל הצינור. Re-לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום. Nutate הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  10. חזור על שלב 4.8 באמצעות 50 ו - 30% פתרונות מדורגים EtOH ו PBT 100%. לאחר לשטוף את PBT 100%, יש לשטוף את העוברים 3 פעמים יותר PBT 100% במשך 10 דקות.
  11. אם העוברים הם בני יותר מ 24 שעות, proteinase K להתייחס אליהם. אם לא, המשך לשלב 4.13. כדי לעשות זאת, מוכן לדלל את proteinase K (שלב 4.7) 1:1000 ב PBT. דגירה עוברים proteinase K עבור 10 דקות, או יותר אם עוברים הם מבוגרים. שמור את העוברים מכוסה ברדיד מתכת כדי למנוע חשיפה לאור.
  12. לאחר הטיפול K proteinase, לשטוף את העוברים 5 פעמים PBT במשך 10 דקות. לאחר כביסה, לתקן את העוברים paraformaldehyde 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על nutator. לאחר מכן, מיד לשטוף את העוברים 5 פעמים PBT במשך 10 דקות. שמור את העוברים מכוסה ברדיד מתכת כדי למנוע חשיפה לאור.
  13. הפוך את החיץ חסימה על ידי דילול 5 X חיץ חסימת במאגר חומצה maleic עד 1 X. הסר את העוברים מן PBT ולמקם אותם במאגר X 1 חסימה. מכסים את העוברים עם רדיד מתכת nutate אותם בטמפרטורת החדר במשך 5 עד 6 שעות.
  14. אחרי 5 עד 6 שעות של הלם, חסימת החום עוברים על 65 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות.
  15. השג את הפתרון נוגדנים ואת LS 2% מוכנים יום קודם לכן. צנטריפוגה הפתרון נוגדן על מקסימום סל"ד. מעבירים את השלב מימית אל הצינור LS 2%. הפוך את הצינור לערבב.
  16. העברת עוברים לחסום חיץ לתערובת LS-הנוגדן. שמור את העוברים מכוסה ברדיד מתכת כדי למנוע חשיפה לאור. Nutate את העוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  17. למחרת לשטוף את העוברים בטמפרטורת החדר 6 פעמים במשך 15 דקות ב PBT. הכן AP חיץ (ראו הכנת פתרונות).
  18. לשטוף את העוברים בטמפרטורת החדר 2 פעמים במשך 10 דקות במאגר AP. הכן NBT / פתרון BCIP פיתוח (ראו הכנת פתרונות).
  19. העברת עוברים אל NBT / BCIP. כתם אפשר לפתח בחושך.
  20. תפסיק את הפיתוח על ידי שטיפת העוברים 3 פעמים PBT במשך 5 דקות כל אחד.
  21. לרכישת התמונה ההר עוברים 0.6% ההיתוך agarose נמוך או methylcellulose 3% ו לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ מתחם הפוך או ישר.
  22. דגימות Photoactivated ניתן לאחסן לניתוח בעתיד (מכתים נשאר יציב) על ידי dehydrating אותם לשטוף EtOH מדורגים. בצע את שלבים 4.4 עד 4.7 ל dehydrating דגימות.

5. נציג תוצאות:

איור 1
באיור 1. Photoactivation בכלוב של והעמסת-dextran. (A, B) brightfield ותמונה הקרינה של עובר דג הזברה לרוחב להציג בשלב 13/14-somite לפני photoactivation. (C, D) העובר היה photoactivated בשלב the13/14-somite באחד somites (חץ) עם אורך גל של 740 ננומטר, סריקה בזמן של 31 שניות, ואת כוח לייזר ממוצע של 47 mW. לאחר ההפעלה, (ד) הקרינה מן שברחה מכלוב והעמסת-dextran הוא ציין. אוריינטציה: הגבי (מימין), הגחון (משמאל). סולם בר 100 מיקרומטר.

איור 2
באיור 2. בכלוב Immunodetection של והעמסת-dextran. איור 2 מתאר את immunostaining של שברחה מכלוב והעמסת-dextran ב 18/19 עובר דג הזברה hpf. בשלב 10-somite אזור קטן של העובר הופעל והמזודרם את הצלחת לרוחב באמצעות לייזר הפרמטרים שנזכרו באיור 1. באמצעות ההליך immunodetection, החץ מזהה את האזור הפעיל עם מכתים רקע מינימלי. אוריינטציה: הגב (למעלה), הגחון (התחתון). סולם בר 100 מיקרומטר.

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה צדדי למיפוי תא בודד גורל בהתבסס על photoactivation של בכלוב והעמסת-dextran. משחררות רפרוף של בכלוב והעמסת-dextran בתאים בודדים מושגת באמצעות שני פוטונים הקליטה של ​​לייזר femtosecond מאי טאי מצמידים את המיקרוסקופ LSM 510 META Zeiss confocal. שברחה מכלוב והעמסת-dextran בתאים photoactivated הוא מדמיין במהירות באמצעות הליך פשוט אימונוהיסטוכימיה.

בפרוטוקול זה הגל שני הפוטונים קליטה של ​​photoactivation בכלוב והעמסת-dextran הוא 740 ננומטר. אורך גל זה נקבע באופן ניסיוני על ידי photoactivating בכלוב והעמסת-dextran עוברים wildtype מוזרק. גל עירור הלייזר היתה מגוונת 600-800 ננומטר, ועל נוכחות או העדר והעמסת הקרינה שלאחר ההפעלה נקבע איכותית. מצאנו כי 740 ננומטר המיוצר ההפעלה החזקה והעמסת האות הבאה. באופן אידיאלי, 740 ננומטר צריך לעבוד עבור כל מערכות המודל, אך אנו מייעצים בדיקות מגוון רחב של אורכי גל כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי שני הפוטונים עירור למדגם שלך.

בשנת עוברים בכלוב והעמסת-dextran wildtype מוזרק, עבור גל שני הפוטונים כל עירור נבדק גם אנחנו מגוונים את הכוח לייזר הממוצע. עבור גל עירור של 740 ננומטר, כוח לייזר ממוצע של 47 mW המיוצר אות והעמסת חזקה על האזור הפעיל בהשוואה נמוך סמכויות לייזר הממוצע. גבוהה סמכויות לייזר הממוצע לא לייצר אותות והעמסת חזק, אבל אבלציה המושרה של הרקמה. מאז לייזר פולסים femtosecond יעילים ב ablating רקמות ביולוגיות 15, אנו ממליצים על קביעת סף ממוצע לייזר כוח photoactivation כי ימנע אבלציה רקמות.

שני הפוטונים הקליטה מתרחשת בתוך אינטראקציה נפח קטן. כדי להבטיח הפעלה ראויה של בכלוב והעמסת-dextran, התא חייב להיות מובא אל המוקד הנכון. בפרוטוקול לעיל, תאים GFP חיובית היו צילמו בו זמנית תחת אור לבן כדי לאשר להתמקד התא. לכן, רכישת אור לבן, בנוסף לערוצים אחרים מומלץ. לאחר אישור להתמקד התא, פרוטוקול שלנו מציע מגדלת התא הפעיל. גורם זום של 50-70 הוא הציע, עם זאת, ערך זה תלוי בגודל של התא הנבחר. הגדלת זום מבודד את התא הפעיל של תאים סמוכים, ומגביל את אזור הסריקה להפעלת שני הפוטונים. באופן אידיאלי, לסרוק את האזור צריך לכסות שטח גדול של התא.

איתור של תאים מופעל יחיד דורש כי מכתים רקע להיות מינימלית. בפרוטוקול immunodetection לעיל חשוב כי המדגם הוא חסום חוסם חיץ במשך 5 עד 6 שעות (שלב 4.13). בעת פיתוח עם NBT / BCIP, שברחה מכלוב והעמסת-dextran צריך להיות גלוי ב 10 עד 20 דקות. אם מכתים רקע חזק, אנו ממליצים זמן ארוך יותר חסימת ושוטף נוספת כדי להסיר את הנוגדן (שלב 4.17).

איורים 1 ו -2 לספק תוצאות נציג photoactivation ו immunodetection. באיור 1, מוקדם 1 - ל 2 תאים בשלב עוברי wildtype הוזרקו בכלוב והעמסת-dextran. עוברים הועלו על somitogenesis באמצע ועלה נמוך ההיתוך agarose בכיוון לרוחב. איור 1 (a, b) מתארים brightfield ותמונות הניאון של העובר לפני photoactivation. ראיות כי העובר נשאר שברחה מכלוב באה לידי ביטוי בהעדר והעמסת הקרינה באיור 1 (ב). אזור קטן בתוך somite הופעל עם אורך גל של 740 ננומטר במשך 31 שניות באמצעות כוח לייזר ממוצע של 47 mW, איור 1 (ג; החץ). לאחר ההפעלה, שני הפוטונים משחררות רפרוף של והעמסת-dextran התרחשו כפי שמוצג על ידי הקרינה מאזור מופעל, איור 1 (ד; החץ). הפעלה לא לוותה אבלציה לייזר, כמו רקמת somitic איור נשאר שלם, 1 (ג). איור 2 מדגים את immunodetection שברחה מכלוב של והעמסת-dextran. אזור קטן והמזודרם את הצלחת רוחבי של העובר 10-somite שלב היה photoactivated באמצעות פרמטרים לייזר זהה כאמור באיור 1. העובר גדל ומעובד באמצעות צעדים 4.1 עד 4.20. החץ באיור 2 מאתרת באזור הפעיל, כפי שצוין על ידי הצטברות של משקע כחול. רק המיקום מופעל מזוהה בבירור בלי להתערב מכתים רקע.

ההכנה של פתרונות:

1 X PBT (1 L)
100 מ"ל 10 X PBS
2 גרם BSA
10 מ"ל 20% Tween

10 X PBS (1 L)
80 גרם NaCl
2 גרם KCl
6.1 גרם Na 2 HPO 4
1.9 גרם KH 2 PO 4
DDH 2 O ל L 1
עד 7.3 pH

Paraformaldehyde 4% (160 מ"ל)
Paraformaldehyde 32% (שני בקבוקונים 10 מ"ל)
8 X 20 מ"ל PBS
132 מ"ל DDH 2 O

"jove_content> AP חוצץ (50 מ"ל)
1 מ"ל 5 M NaCl
2.5 מ"ל 1 M MgCl 2
5 מ"ל 1 M טריס pH 9.5
250 Tween 20% μL
41.25 מ"ל DDH 2 O

פתרון נוגדן (למדגם 1)
5.5 אצטון μL אבקת
40 μL PBT
0.8 LS μL
0.1 μL נוגדן Anti-והעמסת-AP

LS 2% (360 μL למדגם 1)
7.2 LS 100% μL
352.8 μL PBT

1 X Danieau מדיה (1 L) ‡
11.6 mL 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO 4
600 μL 1 M Ca (NO 3) 2
5 מ"ל 1 M HEPES
DDH 2 O ל L 1
pH להסתגל 7.6

‡ Danieau הוא פתרון אידיאלי עבור מלח גידול עוברי דג הזברה dechorionated. מדיה אחרים עשויים לשמש, בתנאי שהם פתרונות איזוטוני עם osmolarity כראוי (~ 300 mOsm עבור דג הזברה)

NBT מניות (1 מ"ל)
50 מ"ג Nitro כחול Tetrazolium
0.7 מ"ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל
0.3 מ"ל DDH 2 O

BCIP מניות (1 מ"ל)
50 מ"ג 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט
1 מ"ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל

NBT / BCIP בפיתוח פתרון
1 מ"ל AP חיץ
4.5 NBT μL מניות
3.5 BCIP μL מניות

אצטון אבקת

  1. בחר 20 דגים בוגרים להקפיא אותם בחנקן נוזלי.
  2. טוחנים את הדג הקפוא עם במכתש ועלי לאבקה.
  3. מעבירים את אבקת דגים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  4. מלאו את צינור חרוטי עם אצטון 100%. וורטקס את הצינורית.
  5. ספין התחתית מקסימום סל"ד במשך 10 דקות. בטל supernatant.
  6. שטפו את גלולה אחרת 3 פעמים אצטון 100% ספין התחתית מקסימום סל"ד במשך 10 דקות. עד לשטוף האחרון supernatant אמור להופיע ברור.
  7. הוסף אצטון 100% עד שוב את הכדור ולתת הצינור לעמוד בטמפרטורת החדר. החלקיקים צפופים יותר יהיה להסתפק, ואילו חלקיקי עדין יישארו ההשעיה.
  8. למזוג חלקיקים לתוך צינור חדש. Aliquot אבקת פתרון לתוך צינורות נפרדים ולאחסן אותם ב -20 ° C.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים ג'יי צ'ן מתן בכלוב והעמסת-dextran פרוטוקול סינתזה. מחקר זה נתמך על ידי מצעד הפרוטות פרס 5-78-FY09, איגוד הלב האמריקאי הפרס 09BGIA2090075, ואת הפרס NIH / NHLBI HL107369 R01-01 אס תודה מיוחדת ג Closson לסיוע במיקרוסקופ שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMNB-caged fluorescein SE Invitrogen C20050
10 kDa Aminodextran Invitrogen D1860
Zeba Desalt Spin Column Pierce, Thermo Scientific 89889
Low melting agarose Amresco 0815-100G
Sodium Borate Amresco 1131117-100G
Tricaine Methylsulfonate/ MS222 Research Organics 1347A
Anti-fluorescein-AP Roche Group 11376622
Blocking buffer Roche Group 11 096 176 001
Maleic Acid Sigma-Aldrich MO375-500G
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
NBT Sigma-Aldrich I8377-250mg
BCIP Fisher Scientific PI-34040
Microinjector Harvard Apparatus PLI-2000
LabTek chambered coverglass slides Nalge Nunc international 155380
Proteinase K Invitrogen AM2544
Lamb serum Invitrogen 16070096
LSM 510 META NLO Carl Zeiss, Inc.
20X 0.8 NA Air apochromatic objective Carl Zeiss, Inc.
Transparent yellow filter Theatre House Inc. Roscolux filter sheet Color: 312

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
  2. Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
  3. Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
  4. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
  5. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  6. Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
  7. Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
  8. Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
  9. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
  10. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
  11. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  12. Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
  13. Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
  14. Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
  15. Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
  16. Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).

Tags

לביולוגיה התפתחותית גיליון 56 דג הזברה שני הפוטונים photoactivation אימונוהיסטוכימיה בכלוב חלבון פלואורסצנטי מיפוי גורל
תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kohli, V., Rehn, K., Sumanas, S.… More

Kohli, V., Rehn, K., Sumanas, S. Single Cell Fate Mapping in Zebrafish. J. Vis. Exp. (56), e3172, doi:10.3791/3172 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter