Summary
Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.
Abstract
A capacidade de uma única célula diferencialmente rótulo tem implicações importantes na biologia do desenvolvimento. Por exemplo, determinar como hematopoiético, as linhagens de vasos linfáticos e sanguíneos surgem em embriões em desenvolvimento exige o mapeamento destino traçado e linhagem de células precursoras indiferenciadas. Recentemente, proteínas photoactivatable que incluem: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8, e KikGR 9, 10 receberam grande interesse como sondas celular de rastreamento. O espectro de fluorescência destas proteínas fotossensíveis podem ser facilmente convertidos com excitação UV, permitindo uma população de células para ser distinguido de outras adjacentes. No entanto, a foto-da proteína ativada pode limitar a longo prazo de células de rastreamento 11. Como uma alternativa às proteínas photoactivatable, enjaulado fluoresceína-dextran tem sido amplamente utilizado em sistemas de embrião modelo 7, 12-14. Tradicionalmente, para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran, excitação UV de uma casa de lâmpada fluorescente ou um laser UV de fóton único tem sido usada, no entanto, tais fontes limitar a resolução espacial de fotoativação. Aqui nós relatamos um protocolo para mapear o destino, traçar a linhagem, e detectar única células marcadas. Células individuais de embriões injetados com enjaulado fluoresceína dextran são fotoativados com pulsos de laser infravermelho próximo produzido a partir de um laser de femtossegundos de titânio safira. Este laser é de costume em todos os microscópios confocal de dois fótons, como o LSM 510 META NLO microscópio utilizado neste trabalho. Como o tecido biológico é transparente ao infravermelho próximo irradiação 15, os pulsos de laser pode ser focalizado no fundo do embrião sem uncaging células acima ou abaixo do plano selecionado focal. Portanto, não-linear de absorção de dois fótons é induzido apenas no foco geométrico para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran em uma única célula. Para detectar a célula que contém uncaged fluoresceína-dextran, nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica simples 16 a rapidamente visualizar a célula ativada. O protocolo de ativação e de detecção apresentado neste artigo é versátil e pode ser aplicado a qualquer sistema modelo.
Nota: Os reagentes utilizados neste protocolo pode ser encontrado na tabela anexada ao final do artigo.
Protocol
1. Síntese de fluoresceína enjaulado-dextran (adaptado de Ref. 14)
- Prepare uma solução 0,1 M de borato de sódio diluído em DDH 2 O.
- Medida 4 mg de 10 kDa aminodextran e adicioná-lo ao tubo de fluoresceína CMNB-enjaulado.
- Adicionar 500 mL da solução preparada borato de sódio (passo 1.1) para o tubo de fluoresceína CMNB-enjaulado. Tampe o tubo e vortex por 30 segundos para dissolver a mistura.
- Deixe a mistura reage durante a noite em um nutator à temperatura ambiente. Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição da mistura a luz ambiente.
- Obter uma coluna de spin Zeba dessalinizar e retire a tampa inferior. Marca um ponto na coluna, que será utilizado para orientar a coluna quando centrifugação. Coloque a coluna em um tubo cônico de 15ml Falcon. Nota: A solução na coluna spin é tampão coluna.
- Solte a tampa superior na coluna de spin desalt. Coloque o tubo de 15 mL cônico Falcon que abriga a coluna de spin desalt em uma centrífuga. Orientar a coluna de rotação com o ponto marcado (passo 1.4) de frente para o centro do rotor de centrífuga. Centrifugar o tubo a 1000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, remover a coluna girar desalt do tubo Falcon. Descartar tanto o fluxo coletados através eo tubo cônico de 15 mL. Obter um novo tubo de 15 mL cônico Falcon, e colocar a coluna girar desalt no tubo Falcon novo. Nota: Depois da centrifugação, o leito de resina coluna deve aparecer compactado. Use a coluna imediatamente.
- Obter a mistura reagiu (Caged fluoresceína-dextran) no passo 1.3. Remova a tampa da coluna de girar e aspirar a mistura reage e aplicá-lo lentamente para o centro da coluna de spin desalt. Depois de aplicar a mistura reagiu, recoloque a tampa na coluna de spin.
- Colocar o tubo Falcon, que abriga a coluna de spin desalt em uma centrífuga. Como foi feito no passo 1.5, orientar a coluna de spin com o ponto marcado em frente ao centro do rotor de centrífuga. Centrifugar o tubo a 1000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, uma mistura amarelo (enjaulado fluoresceína-dextran) serão coletados (aproximadamente 400 mL) nos 15 tubos Falcon mL. Transfira a mistura fluoresceína enjaulado-dextran a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Cobrir imediatamente o tubo com papel alumínio para evitar a exposição da mistura a luz ambiente. Lyophilize o enjaulado mistura fluoresceína-dextran em um speedvac. Liofilização de 350 mL deve demorar cerca de 4 horas.
- Após a liofilização completa, ressuspender o pó (cerca de 3 mg) no DDH 2 O para uma concentração final de aproximadamente 1% w / v. Mix por breves instantes, vórtex de suspender o pó.
- Alíquota da gaiola de fluoresceína-dextran em tubos de metal separadas folha coberto, e armazená-los a -20 ° C.
2. Colheita de embriões e da microinjeção enjaulado fluoresceína-dextran
* Este procedimento usa o peixe-zebra como o sistema modelo animal.
- No dia antes de injecções, criada cruza zebrafish de 1:1 do sexo masculino para feminino ou masculino 02:01 para o feminino na criação de tanques com divisórias.
- Na manhã seguinte, trocar a água do tanque de reprodução e remover os divisores. Imediatamente preparar a 5 mL 10/01 solução diluída de trabalho de gaiola de fluoresceína-dextran em qualquer 1 X Danieau media (ver Preparação de Soluções) ou DDH 2 O. Cobrir o tubo de solução de trabalho com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
- Pipeta preparada enjaulado solução fluoresceína-dextran (passo 2.2) para a agulha. Antes de cortar a ponta da agulha com um tamanho adequado sob o microscópio de dissecação, coloque um pedaço de filtro amarelo transparente em frente à fonte de luz branca. O filtro amarelo vai impedir uncaging espontânea da fluoresceína-dextran durante as injeções. Ao olhar através da ocular ocular, a fonte de luz deve aparecer amarela.
- Coletar embriões e pipeta-los em uma bandeja de molde microinjeção. Definir o tempo de microinjeção para entregar 3-4 nL de gaiola de fluoresceína-dextran. Sob o microscópio de dissecação, orientar os embriões com uma pinça e injetar (3-4 nL) enjaulado fluoresceína-dextran na base das células blastômero (blastômero-gema de interface). A fase de embrião para a injecção deve ser 1 - a 2 células de palco.
- Após a injeção, remova os embriões a partir da bandeja do molde microinjeção e colocá-los numa placa de Petri contendo água limpa peixe fresco. Azul de metileno pode ser adicionado à água de peixe para evitar crescimento de fungos na concentração final de pelo menos 0,02% w / v. Cobrir a placa de Petri com papel alumínio para evitar uncaging da injecção de gaiola de fluoresceína-dextran.
- Levantar os embriões injetado para uma fase em que as células de interesse precisam ser fotoativado. Para fotoativação, prepare uma baixa temperatura de fusão de 0,6% em solução de agarose DDH 2 O. Dependendo da fase de embrião, tricaina (MS222) pode ser adicionado à baixa temperatura de fusão de agarose. Para fazer isso, diluir 0,02% tricaina em baixa temperatura de fusão agarose a uma concentração final de 0,0014%.
- Assim que os embriões atingem o estágio adequado de desenvolvimento, os embriões dechorionate em 1 X Danieau mídia com uma pinça. Quando dechorionating, certifique-se que um filtro amarelo transparente é colocado no caminho da fonte de luz branca (veja o passo 2.3).
- Aqueça a 0,6% baixa temperatura de fusão solução de agarose a 37 ° C. Pipetar 1 mL de baixa temperatura de fusão agarose no poço de um slide lamela LabTek câmaras. Cuidadosamente montagem 3-4 embriões em baixa temperatura de fusão agarose e orientá-los com uma pinça com as células a serem fotoativados voltado para baixo contra a lamela inferior.
- Permitir que a agarose para solidificar. Após a solidificação, pipetar 1 mL de 1 X Danieau mídia sobre o agarose.
- Repita os passos de 2,8-2,9 para mais embriões.
3. Dois fótons ativação de gaiola de fluoresceína-dextran
* Este procedimento pressupõe que o embrião expressa GFP repórter. O embrião é visto usando o íon de argônio (488 nm) fonte de laser ligado ao microscópio LSM 510 META NLO. Uma célula GFP único positivo é selecionado e fotoativado com o Mai Tai laser (laser de femtossegundos) acoplado ao LSM 510. O procedimento é o mesmo para os não-fluorescentes embriões. Alternativamente, a luz branca pode ser usada para encontrar a célula a ser ativado, seguida de ativação usando o Mai Tai fonte de laser.
- Carregue o LSM 510 software. Colocar um filtro transparente amarelo no caminho de luz branca feixe.
- Selecione Digitalizar nova imagem e clique em Iniciar Expert Mode.
- Selecione a guia a laser. Ligue o íon argônio (488 nm) e Tai Mai (femtossegundos) fontes de laser.
- Definir o Mai Tai comprimento de onda a 740 nm.
- Selecione a guia de configuração. Definir a configuração do caminho óptico para o íon argônio e Tai Mai laser.
- Selecione a guia Scan. Alterar o objetivo de 20X/0.8.
- Definir a velocidade do scan max clicando Max.
- Modo de Ajuste, Método e Número de linha, média, e 1.
- Sob a aba Canais desmarque todas as fontes de laser com exceção do Tai Mai.
- Coloque um medidor de energia no caminho do feixe óptico.
- Selecione o botão para ativar Cont digitalização contínua.
- Ajustar a transmissão% até o medidor de potência lê uma potência do laser média de 47 mW.
- Interromper a verificação, selecionando o botão Parar.
- Sob a guia Canais desmarque a Mai Tai fonte de laser e selecione o íon argônio (488 nm).
- Selecione o botão xy Fast. Sob a guia Canais ajustar o pinhole, ganho de detector, amplificador de offset, e ganho do amplificador para o íon laser de argônio para alcançar a melhor qualidade de imagem.
- Usando o controlador de estágio, encontrar e foco na célula para ativar.
- Clique no botão Stop.
- Usando o zoom ferramenta de zoom, em na célula ativada até que o fator de zoom na aba Modo exibe 50-70.
- Interromper a verificação, selecionando o botão Parar.
- Sob a aba Canais desmarque a argon ion laser (488 nm) e selecione o Mai Tai laser.
- Sob a aba Modo de definir a velocidade de digitalização para 31,46 seg.
- Selecione o botão único para iniciar a verificação de dois fótons ativação de gaiola de fluoresceína-dextran da célula selecionada.
- Após a ativação, desmarque a Mai Tai laser sob a aba Channels e selecione novamente o argon ion laser (488 nm).
- Definir o fator de zoom no modo para um, e clique no botão Max sob o título de velocidade para definir a velocidade mais rápida varredura.
- Selecione xy Rápido para analisar a região fotoativados. Verificar que a região não é a laser fotoativados ablated. Para mais informações sobre ablação a laser, por favor consulte a seção de discussão.
- Repita os passos acima para outros embriões.
4. Imunodetecção de uncaged fluoresceína-dextran (adaptado de Ref. 16)
- Depois photoativation, coloque um filtro amarelo transparente na frente da fonte de luz branca e remover manualmente cada embrião da baixa temperatura de fusão agarose usando uma pinça afiada. Coloque todos os embriões removidos em uma placa de petri contendo novas frescas 1 X Danieau mídia. Cobrir a placa de Petri com papel alumínio para evitar a exposição dos embriões à luz.
- Se necessário, os embriões traseira para o estágio de desenvolvimento desejado. Nesse meio tempo, prepare uma solução de paraformaldeído a 4% (ver Preparação de Soluções). Alíquota de 1,5 mL de paraformaldeído preparado em um tubo de microcentrífuga.
- Depois os embriões atingiram o estágio de desenvolvimento de interesse, pipetar os embriões dentro do tubo de microcentrífuga (a partir do passo 4.2). Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
- Nutar do tubo durante a noite a 4 ° C. Para o dia seguinte prepare classificados etanol (EtOH) soluções em tampão fosfato salina (PBS) e 2 DDH O; 30% EtOH: PBS, EtOH 50%: PBS, EtOH 70%: DDH 2 O, e 100% EtOH.
- No dia seguinte, retire os embriões a partir de 4 ° C. Remova o papel alumínio que cobre o tubo e aspirar rapidamente off parágrafoformaldehye (deixar para trás um pequeno volume que é suficiente para cobrir os embriões). Pipetar 1,5 mL de EtOH 30%: PBS dentro do tubo. Re-cobrir o tubo com papel alumínio. Nutar o tubo à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Repita o passo 4.5 usando 50, 70 e 100% classificados soluções EtOH. Após a lavagem EtOH 100%, lavar os embriões de novo em EtOH 100% para 10 mins.
- Após as lavagens, armazenar os embriões durante a noite a -20 ° C. Para o dia seguinte preparar tampão fosfato tween (PBT; ver Preparação de Soluções), 5 X tampão de bloqueio (ver protocolo do fabricante para a preparação), ácido maleico (protocolo para a preparação pode ser encontrado no protocolo de tampão de bloqueio), 10 mg / ml proteinase K, e uma solução de 10 X anticorpo (Anti-fluoresceína-AP; ver Preparação de Soluções).
- Também preparam a 2% de soro de carneiro (LS; ver Preparação de Soluções) diluída em PBT. Armazenar os anticorpos a 4 ° C durante a noite em um tremendo nutator. O LS 2% pode ser mantido a 4 ° C.
- No dia seguinte, retire os embriões de -20 ° C. Remova o papel alumínio que cobre o tubo e aspirar rapidamente fora de 100% EtOH. Adicionar 1,5 mL de EtOH 70%: 2 O DDH ao tubo. Re-cobrir o tubo com papel alumínio. Nutar o tubo à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Repita o passo 4,8 com 50 e 30% EtOH soluções graduais e PBT de 100%. Após a lavagem PBT 100%, lavar os embriões vezes 3 mais em PBT 100% para 10 mins.
- Se os embriões são mais de 24 horas, proteinase K tratá-los. Se não, vá para o passo 4.13. Para fazer isso, dilua o preparado proteinase K (passo 4.7) 1:1000 em PBT. Incubar os embriões em proteinase K por 10 minutos ou mais, se os embriões são mais velhos. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz.
- Após tratamento proteinase K, lave os embriões 5 vezes em PBT de 10 minutos. Após a lavagem, fixar os embriões em paraformaldeído 4% por 30 minutos à temperatura ambiente em um nutator. Depois, lave imediatamente os embriões 5 vezes em PBT de 10 minutos. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz.
- Faça tampão de bloqueio, diluindo 5 X tampão de bloqueio no tampão de ácido maleico a 1 X. Remova os embriões de PBT e colocá-los em um buffer de X bloqueio. Cobrir os embriões com folha de metal e nutar-los em temperatura ambiente por 5-6 horas.
- Depois de 5-6 horas de choque térmico de bloqueio, os embriões a 65 ° C por 15 a 20 minutos.
- Obter a solução de anticorpos ea LS 2% preparado no dia anterior. Centrifugar a solução de anticorpos no máximo rpm. Transferir a fase aquosa para o tubo de LS 2%. Inverter o tubo para misturar.
- Transferir os embriões de tampão de bloqueio à mistura LS-anticorpo. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz. Nutar os embriões a 4 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, lave os embriões à temperatura ambiente 6 vezes durante 15 minutos em PBT. Prepare AP buffer (ver Preparação de Soluções).
- Lavar os embriões em temperatura ambiente 2 vezes por 10 minutos em tampão AP. Prepare NBT / BCIP solução em desenvolvimento (ver Preparação de Soluções).
- Transferir os embriões para NBT / BCIP. Permitir que a mancha de desenvolver no escuro.
- Parar o desenvolvimento dos embriões por lavagem 3 vezes em PBT por 5 minutos cada.
- Para aquisição de imagem montar a embriões em 0,6% agarose baixa temperatura de fusão ou metilcelulose 3%, e adquirir imagens através de um microscópio composto invertido ou vertical.
- Fotoativados amostras podem ser armazenadas para futuras análises (coloração permanece estável) por desidratação-los em uma lavagem de EtOH classificados. Siga os passos de 4,4 por 4,7 para desidratar as amostras.
5. Resultados representativos:
Figura 1. Fotoativação do Caged fluoresceína-dextran. (A, B) Brightfield e imagem da fluorescência de um embrião de peixe-zebra vista lateral na fase 13/14-somite antes de fotoativação. (C, D) O embrião foi fotoativado na fase the13/14-somite em um dos somitos (seta) com um comprimento de onda de 740 nm, tempo de varredura de 31 segundos, e uma potência de laser média de 47 mW. Pós-ativação, (d) de fluorescência de uncaged fluoresceína-dextran é observado. Orientação: Dorsal (direita), ventral (à esquerda). Barra de escala 100 mm.
Figura 2. Imunodetecção de gaiola de fluoresceína-dextran. A Figura 2 mostra a imunocoloração de uncaged fluoresceína-dextran em um embrião de peixe-zebra 18/19 hpf. Na fase de 10 somito uma pequena região do embrião foi ativado no mesoderma da placa lateral usando os parâmetros do laser mesmo declarou na Figura 1. Utilizando o procedimento de imunodetecção, a seta identifica a região ativada com coloração de fundo mínimo. Orientação: Dorsal (top), ventral (inferior). Barra de escala 100 mm.
Discussion
Este artigo descreve um método versátil para mapeamento única célula destino baseado na fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran. Uncaging de fluoresceína-dextran enjaulado em uma única célula é obtida através de dois fótons de absorção de um laser de femtossegundos Mai Tai acoplada ao microscópio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína-dextran em células fotoativados é rapidamente visualizada através de um procedimento simples imuno-histoquímica.
Neste protocolo o comprimento de onda de absorção de dois fótons para fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran é 740 nm. Este comprimento de onda foi determinado experimentalmente por photoactivating enjaulado fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado. O comprimento de onda de excitação do laser foi variado 600-800 nm, ea presença ou ausência de fluoresceína de fluorescência de pós-ativação foi qualitativamente determinado. Nós descobrimos que 740 nm produziu a ativação de sinal mais forte de fluoresceína seguinte. Idealmente, 740 nm deve funcionar para todos os sistemas do modelo, no entanto, aconselhamos testar uma gama de comprimentos de onda para determinar o comprimento de onda de excitação ideal de dois fótons de sua amostra.
Em gaiolas de fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado, para cada comprimento de onda de excitação de dois fotões testado também variadas a potência do laser média. Para um comprimento de onda de excitação de 740 nm, uma potência do laser média de 47 mW produziu um sinal mais forte de fluoresceína na região ativada em comparação com menores poderes a laser média. Maior poder de laser média não produzem sinais mais fortes de fluoresceína, mas a ablação induzida do tecido. Desde pulsos de laser de femtossegundos são eficientes na ablação de tecido biológico 15, recomendamos determinação do limiar de potência do laser média de fotoativação que evita a ablação de tecido.
Dois fótons absorção ocorre dentro de um volume pequeno de interação. Para garantir a activação correcta de gaiola de fluoresceína-dextran, a célula deve ser trazida para o foco correto. No protocolo acima, as células GFP positivas foram simultaneamente fotografada sob luz branca para confirmar o foco da célula. Portanto, a aquisição de luz branca, além de outros canais é aconselhável. Após a confirmação de foco de células, nosso protocolo sugere ampliação da célula ativada. Um fator de zoom de 50 a 70 é sugerido, no entanto, este valor depende do tamanho da célula escolhida. Aumentar o zoom isola a célula ativada a partir de células adjacentes, e limita a área de digitalização de dois fótons ativação. Idealmente, a área de digitalização deve cobrir uma grande área da célula.
Detecção de células ativadas único requer que a coloração de fundo ser mínima. No protocolo imunodetecção acima, é importante que a amostra está bloqueada em tampão de bloqueio por 5 a 6 horas (passo 4.13). Ao desenvolver com NBT / BCIP, uncaged fluoresceína-dextran deve tornar-se visíveis em 10 a 20 minutos. Se é forte coloração de fundo, sugerimos um maior tempo de bloqueio e lavagens adicionais para remover os anticorpos (passo 4.17).
Figuras 1 e 2 fornecem resultados representativos de fotoativação e imunodetecção. Na Figura 1, os primeiros 1 - a 2 células de embriões tipo selvagem fase foram injetados com gaiola de fluoresceína-dextran. Os embriões foram criados para somitogenesis médio e montado em baixa temperatura de fusão agarose na orientação lateral. Figura 1 (a, b) mostram claro e imagens fluorescentes do embrião antes de fotoativação. Evidência de que o embrião permaneceu uncaged é demonstrado pela ausência de fluorescência da fluoresceína na Figura 1 (b). Uma pequena região dentro de um somito foi ativado com um comprimento de onda de 740 nm por 31 segundos usando um laser de potência média de 47 mW, a Figura 1 (c; seta). Pós-ativação, uncaging dois fótons de fluoresceína-dextran ocorreu como mostra a fluorescência da área ativada, Figura 1 (d; seta). Ativação não foi acompanhada por ablação a laser, como o tecido somítica permaneceu Figura, intacta 1 (c). Figura 2 demonstra a imunodetecção de uncaged fluoresceína-dextran. Uma pequena região no mesoderma da placa lateral de um embrião de estágio de 10 somito foi fotoativado usando os parâmetros do laser mesmo, como mencionado na Figura 1. O embrião foi criado e processado utilizando os passos 4.1 até 4.20. A seta na Figura 2 localiza a região ativada, como indicado pelo acúmulo de precipitado azul. Apenas a localização ativado é claramente detectado sem interferir coloração de fundo.
Preparação das soluções:
1 X PBT (1 L)
100 mL 10 X PBS
2 g BSA
10 mL de Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
DDH 2 O em 1 L
pH para 7,3
Paraformaldeído 4% (160 mL)
Paraformaldeído 32% (dois frascos de 10 mL)
8 mL 20 X PBS
132 mL DDH 2 O
1 mL de NaCl 5 M
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 mL 1 M Tris pH 9,5
250 mL de Tween 20%
41,25 mL DDH 2 O
Solução de anticorpos (para 1 amostra)
5,5 mL de acetona em pó
40 mL PBT
0,8 mL LS
0,1 de anticorpos Anti-fluoresceína-AP mL
LS 2% (360 mL de uma amostra)
7,2 mL LS 100%
352,8 mL PBT
1 X Danieau media (1 L) ‡
11,6 mL de NaCl 5 M
700 mL KCl 1 M
400 mL 1 M MgSO 4
600 mL 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
DDH 2 O em 1 L
pH ajustar para 7,6
‡ Danieau é uma solução de sal ideal para a criação de embriões zebrafish dechorionated. Outros meios de comunicação podem ser usados, desde que sejam corretamente com soluções isotônicas osmolaridade (mOsm ~ 300 para zebrafish)
NBT estoque (1 mL)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0,7 mL de anidrido dimetil formamida
0,3 mL DDH 2 O
BCIP estoque (1 mL)
50 mg 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
1 mL de anidrido dimetil formamida
NBT / BCIP solução desenvolvimento
1 mL tampão AP
4,5 mL NBT estoque
3,5 mL de ações BCIP
Pó de acetona
- Selecione 20 peixes adultos e congelá-los em nitrogênio líquido.
- Moer o peixe congelado com um almofariz e pilão de um pó.
- Transferir o pó de peixe em um tubo cônico de 50 mL.
- Encha o tubo cônico com acetona 100%. Vortex do tubo.
- Girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante.
- Lavar o pellet de mais 3 vezes em acetona 100% e girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Pela última lavagem, o sobrenadante deve aparecer claro.
- Adicionar 100% de acetona para a pelota de novo e deixar o tubo repousar à temperatura ambiente. As partículas mais densas vai resolver, enquanto as partículas mais finas permanecem em suspensão.
- Decantar as partículas finas em um novo tubo. Solução alíquota do pó em tubos separados e armazená-los a -20 ° C.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a J. Chen para fornecer o protocolo de síntese enjaulado fluoresceína-dextran. Esta pesquisa foi suportada pelo March of Dimes prêmio 5-AF09-78, a American Heart Association 09BGIA2090075 prêmio, eo prêmio NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Um agradecimento especial a C. Closson por sua assistência microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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