Summary
Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.
Abstract
La capacidad de etiquetar diferencialmente las células individuales tiene implicaciones importantes en la biología del desarrollo. Por ejemplo, la determinación de cómo hematopoyéticas, linajes linfáticos y los vasos sanguíneos surgen en embriones en desarrollo requiere la asignación destino y el linaje de localización de las células precursoras no diferenciadas. Recientemente, las proteínas fotoactivables que incluyen: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 y KikGR 9, 10 han recibido un gran interés como sondas de rastreo celular. El espectro de fluorescencia de estas proteínas fotosensibles se puede convertir fácilmente con excitación UV, lo que permite a una población de células que se distingue de las adyacentes. Sin embargo, el photoefficiency de la proteína activada puede limitar a largo plazo de células de seguimiento 11. Como una alternativa a las proteínas fotoactivables, enjaulados con fluoresceína dextrano ha sido ampliamente utilizado en sistemas modelo embrión 7, 12-14. Tradicionalmente, para desenjaular fluoresceína dextrano, excitación UV de una casa de la lámpara fluorescente o un láser UV solo fotón se ha utilizado, sin embargo, dichas fuentes límite de la resolución espacial de fotoactivación. Aquí se presenta un protocolo de mapa del destino, traza el linaje, y detectar solo las células marcadas. Las células individuales en embriones inyectados con fluoresceína enjaulado-dextrano se fotoactivado con pulsos láser en el infrarrojo cercano producido a partir de un láser de femtosegundo de titanio zafiro. Este láser es habitual en todos los microscopios confocal de dos fotones, como el microscopio LSM 510 META NLO utilizado en este trabajo. Dado que el tejido biológico es transparente a la radiación en el infrarrojo cercano, 15 de los pulsos del láser puede ser enfocado en lo profundo de las células del embrión sin uncaging por encima o por debajo del plano focal seleccionada. Por lo tanto, no lineal, la absorción de dos fotones es inducido sólo en el centro geométrico de desenjaular fluoresceína dextrano en una sola célula. Para detectar la celda que contiene uncaged fluoresceína dextrano, se describe un protocolo de inmunohistoquímica sencilla de 16 a visualizar rápidamente la celda activa. El protocolo de activación y detección presentados en este trabajo es versátil y puede aplicarse a cualquier modelo de sistema.
Nota: Los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la tabla adjunta al final del artículo.
Protocol
1. Síntesis de la jaula con fluoresceína dextrano (adaptado de la referencia 14.)
- Prepare una solución 0,1 M de borato de sodio diluido en ddH 2 O.
- Medida 4 mg de 10 kDa aminodextrano y añadirlo al tubo CMNB-jaula con fluoresceína.
- Añadir 500 l de la solución de borato de sodio preparada (paso 1.1) en el tubo CMNB-jaula con fluoresceína. Tape el tubo y agitar durante 30 segundos para disolver la mezcla.
- Dejar que la mezcla de reacción durante la noche en un nutator a temperatura ambiente. Cubrir el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición de la mezcla de la luz ambiental.
- Obtener una columna Zeba desalar giro y giro de la tapa inferior. Marca un punto en la columna, que se utilizarán para orientar la columna cuando la centrifugación. Colocar la columna en un tubo de 15 ml cónicos Falcon. Nota: La solución en la columna de giro es tampón de columna.
- Afloje la tapa superior de la columna de centrifugación desalar. Coloque el tubo cónico de 15 ml Falcon que alberga la columna de centrifugación desalar en una centrifugadora. Orientar la columna de centrifugación con el punto marcado (paso 1.4) frente al centro del rotor centrífugo. Centrifugar el tubo a 1000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, eliminar la columna de centrifugación desalinización del tubo Falcon. Descartar tanto el flujo de recogidas y el tubo cónico de 15 ml. Obtener un nuevo tubo cónico de 15 ml Falcon, y el lugar de la columna de centrifugación desalar en el nuevo tubo Falcon. Nota: Después de la centrifugación, el lecho de resina columna debe aparecer compactado. Use la columna de inmediato.
- Obtener la mezcla de reacción (jaulas con fluoresceína dextrano) en el paso 1.3. Retire la tapa de la columna de centrifugación y se aspira la mezcla de reacción y se aplican lentamente hacia el centro de la columna de giro desalar. Después de aplicar la mezcla de reacción, coloque la tapa en la columna de giro.
- Coloque el tubo Falcon que alberga la columna de centrifugación desalar en una centrifugadora. Como se ha hecho en el paso 1.5, orientar la columna de centrifugación con el punto marcado hacia el centro del rotor centrífugo. Centrifugar el tubo a 1000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, una mezcla de color amarillo (fluoresceína enjaulado-dextrano) serán recogidos (aproximadamente 400 l) en el tubo de 15 ml Falcon. Transferencia de la jaula con fluoresceína dextrano mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Cubrir inmediatamente el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición de la mezcla de la luz ambiental. Liofilizar la jaula con fluoresceína dextrano mezcla en un speedvac. La liofilización de 350 l debe tomar aproximadamente 4 horas.
- Después de completar la liofilización, resuspender el polvo (aproximadamente 3 mg) en ddH2O a una concentración final de aproximadamente 1% w / v. Mezclar con una breve agitación de suspender el polvo.
- Alícuota de la jaula con fluoresceína dextrano en tubos separados de lámina de metal cubierta, y almacenarlos a -20 ° C.
2. La recolección de los embriones y microinyección de jaulas con fluoresceína dextrano
* Este procedimiento utiliza el pez cebra como modelo animal el sistema.
- El día antes de las inyecciones, establecer cruces cebra o 1:01 de hombre a mujer o de 2:1 hombre-mujer en acuarios de cría con separadores.
- A la mañana siguiente cambiar el agua del tanque de cría y eliminar los separadores. Inmediatamente prepare un 5 l 01.10 solución diluida de trabajo de la jaula con fluoresceína dextrano, ya sea en un medio X Danieau (ver Preparación de las soluciones) o ddH 2 O. Cubra el tubo de solución de trabajo con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz.
- Pipeta de la jaula preparada con fluoresceína dextrano solución (paso 2.2) en la aguja. Antes de cortar la punta de la aguja de un tamaño apropiado en el microscopio de disección, coloque un pedazo de filtro amarillo transparente frente a la fuente de luz blanca. El filtro amarillo evitará uncaging espontánea de la fluoresceína dextrano durante las inyecciones. Al mirar a través del ocular ocular, la fuente de luz debe aparecer de color amarillo.
- Recoger los embriones y la pipeta que el molde en una bandeja de microinyección. Establecer el tiempo de microinyección para entregar 3-4 nL de jaulas con fluoresceína dextrano. Bajo el microscopio de disección, orientar a los embriones con unas pinzas y se inyecta (3 a 4 nL) enjaulados fluoresceína dextrano en la base de las células blastómeros (blastómero de yema de interfaz). La etapa de embrión para la inyección debe ser de 1 - a 2 células etapa.
- Después de la inyección, la toma de embriones de la bandeja de molde microinyección y colocarlos en una placa de Petri que contiene limpiar los peces de agua dulce. El azul de metileno puede ser añadido al agua de pescado para prevenir el crecimiento de hongos en una concentración final de 0,02% w / v. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para evitar que uncaging de la inyección de fluoresceína enjaulado-dextrano.
- Aumentar los embriones inyectados a una etapa en la que las células de interés deben ser fotoactivado. Para la fotoactivación, preparar un 0,6% de baja fusión solución de agarosa en ddH 2 O. Dependiendo de la etapa embrionaria, tricaína (MS222) se puede agregar a la baja temperatura de fusión de agarosa. Para ello, diluir 0,02% de agarosa de bajo tricaína en fusión a una concentración final de 0.0014%.
- Tan pronto como los embriones llegan a la etapa de desarrollo apropiada, dechorionate los embriones en un medio X Danieau con pinzas. Cuando dechorionating, asegúrese de que un filtro de color amarillo transparente se coloca en el camino de la fuente de luz blanca (ver paso 2.3).
- Calentar el 0,6% de baja fusión solución de agarosa a 37 ° C. Pipeta de 1 ml de bajo punto de fusión de agarosa en el pozo de una diapositiva cubreobjetos Labtek cámaras. Cuidado montaje 3 a 4 embriones de baja fusión de agarosa y orientarlos con una pinza con las células que se fotoactivado hacia abajo contra la parte inferior cubreobjetos.
- Deje que la agarosa se solidifique. Después de la solidificación, pipeta de 1 ml de un medio X Danieau más de la agarosa.
- Repita los pasos 2,8 a 2,9 para obtener más embriones.
3. Dos fotones de la activación de jaulas con fluoresceína dextrano
* Este procedimiento supone que el embrión expresa GFP reportero. El embrión se ve usando el ion de argón (488 nm) fuente de láser conectado al microscopio LSM 510 META NLO. Una célula de GFP positivos solo se selecciona y fotoactivado con el Mai Tai láser (láser de femtosegundo), junto a la LSM 510. El procedimiento es el mismo para no fluorescente embriones. Por otra parte, la luz blanca se puede utilizar para encontrar la célula para ser activado, seguido por la activación con el Mai Tai fuente de láser.
- Cargar el software LSM 510. Colocar un filtro amarillo transparente en el camino del haz de luz blanca.
- Seleccione Escanear imagen nueva y haga clic en Iniciar el modo experto.
- Seleccione la pestaña de láser. Encienda el ion argón (488 nm) y Mai Tai (femtosegundo) las fuentes de láser.
- Establecer el Mai Tai longitud de onda de 740 nm.
- Seleccione la pestaña de configuración. Establecer la configuración de camino óptico para el ion argón y láser de Mai Tai.
- Seleccione la ficha Escanear. Cambiar el objetivo de 20X/0.8.
- Ajustar la velocidad de escaneo máximo por clic Max.
- Modo de ajuste, método y número de línea, media, y 1.
- Bajo la pestaña anular la selección de los canales están todas las fuentes excepto por el Mai Tai.
- Colocar un medidor de potencia en la trayectoria del haz óptico.
- Seleccione el botón Cont. para activar una exploración continua.
- Ajustar el% de transmisión hasta que el medidor de potencia lee un láser de potencia media de 47 mW.
- Detener la búsqueda, seleccione el botón Detener.
- En la ficha Canales anular la selección del Mai Tai fuente láser y seleccione el ion argón (488 nm).
- Seleccione el botón de xy rápido. En la ficha Canales ajustar el agujero de alfiler, ganancia del detector, un amplificador de compensación, y la ganancia del amplificador para que el láser de iones de argón para lograr la mejor calidad de imagen.
- Utilizando el controlador de la etapa, encontrar y centrarse en la célula para activar.
- Haga clic en el botón Detener.
- Con la herramienta de zoom, zoom en la celda activa hasta que el factor de zoom en la pestaña muestra el modo de 50 a 70.
- Detener la búsqueda, seleccione el botón Detener.
- Bajo la pestaña Canales anular la selección de los iones de argón láser (488 nm) y seleccione el Mai Tai láser.
- En la ficha Modo de ajustar la velocidad de escaneo de 31,46 segundos.
- Seleccione el botón para iniciar el análisis de dos fotones de la activación de jaulas con fluoresceína dextrano de la celda seleccionada.
- Después de la activación, desactive la Mai Tai láser bajo la pestaña Canales y vuelva a seleccionar el láser de iones de argón (488 nm).
- Establecer el factor de zoom en el modo a 1, y haga clic en el botón Max bajo el título de velocidad para ajustar la velocidad más rápida de exploración.
- Seleccione xy rápido para revisar la región fotoactivado. Compruebe que la región no es fotoactivado láser ablación. Para más información sobre la ablación con láser, por favor refiérase a la sección de discusión.
- Repita los pasos anteriores de otros embriones.
4. Inmunodetección de uncaged fluoresceína dextrano (adaptado de la referencia. 16)
- Después de photoativation, coloque un filtro amarillo transparente frente a la fuente de luz blanca y eliminar manualmente cada embrión de baja fusión de agarosa utilizando pinzas afiladas. Coloque todos los embriones procedentes de una nueva placa de Petri que contiene un fresco X Danieau los medios de comunicación. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para prevenir la exposición de los embriones a la luz.
- Si es necesario, posterior a los embriones a la etapa deseada de desarrollo. Mientras tanto, prepare una solución de paraformaldehído al 4% (ver Preparación de las soluciones). Alícuota de 1,5 ml de paraformaldehído preparado en un tubo de microcentrífuga.
- Después de los embriones han llegado a la etapa de desarrollo de interés, una pipeta de los embriones en el tubo de microcentrífuga (desde el paso 4.2). Cubrir el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz.
- Inclinar la cabeza del tubo de la noche a 4 ° C. Para el día siguiente preparar graduada de etanol (EtOH) soluciones en tampón fosfato salino (PBS) y ddH2O, el 30% EtOH: PBS, el 50% EtOH: PBS, el 70% de EtOH: ddH2O, y el 100% EtOH.
- Al día siguiente, la toma de embriones a partir de 4 ° C. Retire la hoja de metal que cubre el tubo de aspiración y rápidamente el párrafoformaldehye (dejar atrás un pequeño volumen que es suficiente para cubrir los embriones). Pipetear 1,5 ml de 30% EtOH: PBS en el tubo. Vuelva a cubrir el tubo con papel de aluminio. Inclinar la cabeza del tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Repita el paso 4.5 con 50, 70 y 100% calificado soluciones EtOH. Después de que el 100% de EtOH lavar, enjuagar los embriones de nuevo en EtOH al 100% durante 10 minutos.
- Después de los lavados, almacenar los embriones durante la noche a -20 ° C. Para el día siguiente preparar tampón fosfato entre (PBT, ver Preparación de las soluciones), 5 X buffer de bloqueo (ver el protocolo del fabricante para la preparación), el ácido maleico (protocolo de preparación se pueden encontrar en el protocolo de tampón de bloqueo), 10 mg / ml de proteinasa K, y una solución de 10 X anticuerpos (anti-fluoresceína-AP, ver Preparación de las soluciones).
- También hay que preparar un 2% de suero de cordero (LS, ver Preparación de las soluciones) diluido en PBT. Almacenar los anticuerpos a 4 ° C durante la noche temblando en un nutator. El LS 2% pueden mantenerse a 4 ° C.
- Al día siguiente la toma de embriones a partir de -20 º C. Retire la hoja de metal que cubre el tubo y aspirar rápidamente el 100% EtOH. Añadir 1,5 ml de EtOH al 70%: ddH2O al tubo. Vuelva a cubrir el tubo con papel de aluminio. Inclinar la cabeza del tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Repita el paso 4.8 con 50 y el 30% clasificado soluciones EtOH, y el 100% PBT. Después de que el 100% PBT lavar, enjuagar los embriones 3 veces más en el 100% PBT durante 10 minutos.
- Si los embriones son más de 24 horas, proteinasa K tratarlos. Si no, vaya al paso 4.13. Para ello, diluir el preparado de proteinasa K (paso 4.7) 1:1000 en PBT. Incubar los embriones en proteinasa K durante 10 minutos, o más si los embriones son mayores. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz.
- Después de proteinasa K tratamiento, lavado de los embriones de 5 veces en PBT durante 10 minutos. Después de lavar, arreglar los embriones en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente en un nutator. Después, inmediatamente lave los embriones de 5 veces en PBT durante 10 minutos. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz.
- Hacer el amortiguador de bloqueo mediante la dilución de 5 de amortiguación X bloqueo en tampón ácido maleico a 1 X. Retirar los embriones de PBT y colocarlos en un buffer X de bloqueo. Cubrir los embriones con papel de aluminio y titubear a temperatura ambiente durante 5 a 6 horas.
- Después de 5 a 6 horas de descarga bloquear el calor, los embriones a los 65 ° C durante 15 a 20 minutos.
- Obtener la solución de anticuerpos y la LS 2% preparada el día anterior. Centrifugar la solución de anticuerpos a un máximo de rpm. Pasar la fase acuosa en el tubo de LS 2%. Invierta el tubo para mezclar.
- La transferencia de los embriones de tampón de bloqueo a la mezcla de LS-anticuerpo. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. Inclinar la cabeza a los embriones a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, lave los embriones a temperatura ambiente 6 veces durante 15 minutos en PBT. Prepare AP buffer (ver Preparación de las soluciones).
- Lavado de los embriones a temperatura ambiente 2 veces durante 10 minutos en un tampón de AP. Prepare NBT / BCIP solución en desarrollo (ver Preparación de las soluciones).
- La transferencia de los embriones de NBT / BCIP. Permitir que la mancha se desarrollan en la oscuridad.
- Detener el desarrollo de los embriones por lavado tres veces en PBT durante 5 minutos cada uno.
- Para la adquisición de la imagen de montaje de los embriones en el 0,6% de agarosa de baja fusión o el 3% de metilcelulosa, y adquirir imágenes utilizando un microscopio compuesto invertida o vertical.
- Fotoactivado muestras pueden ser almacenadas para su posterior análisis (tinción se mantiene estable) por deshidratación en un graduado de lavado EtOH. Siga los pasos 4.4 a 4.7 para la deshidratación de las muestras.
5. Los resultados representativos:
Figura 1. Fotoactivación de jaulas con fluoresceína dextrano. (A, B) campo claro y fluorescencia de la imagen de un embrión de pez cebra vista lateral en la etapa de 13/14-somite antes de fotoactivación. (C, D) El embrión estaba en la etapa de fotoactivado the13/14-somite en uno de los somitas (flecha) con una longitud de onda de 740 nm, el tiempo de exploración de 31 segundos, y un láser de potencia media de 47 mW. Después de la activación, (d) de fluorescencia de la fluoresceína uncaged-dextrano se observa. Orientación: dorsal (derecha), ventral (izquierda). Barra de escala 100 micras.
Figura 2. Inmunodetección de jaulas con fluoresceína dextrano. La figura 2 muestra la inmunotinción de uncaged fluoresceína dextrano en un 18/19 embrión de pez cebra HPF. En la etapa 10 somite una pequeña región del embrión se ha activado en el mesodermo de la placa lateral con los parámetros del láser mismo se indica en la Figura 1. Mediante el procedimiento de inmunodetección, la flecha identifica la región activa con la tinción de fondo mínimo. Orientación: dorsal (arriba), ventral (abajo). Barra de escala 100 micras.
Discussion
Este artículo describe un método versátil para la asignación de un solo destino celular basado en la fotoactivación de jaulas con fluoresceína dextrano. Uncaging de jaulas con fluoresceína dextrano en las células individuales se logra mediante la absorción de dos fotones de un láser de femtosegundo Mai Tai, junto con el microscopio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína dextrano en las células fotoactivado es rápidamente visualizado mediante un procedimiento de inmunohistoquímica simple.
En este protocolo la longitud de onda de absorción de dos fotones para la fotoactivación de la jaula con fluoresceína dextrano es de 740 nm. Esta longitud de onda se determinó experimentalmente por photoactivating enjaulados fluoresceína dextrano inyecta embriones de tipo salvaje. La longitud de onda de excitación láser se varió desde 600 hasta 800 nm, y la presencia o ausencia de fluoresceína fluorescencia después de la activación se determinó cualitativamente. Encontramos que 740 nm produce la mayor activación de la señal de fluoresceína siguientes. Lo ideal es 740 nm debe trabajar para todos los sistemas modelo, sin embargo, le recomendamos probar una amplia gama de longitudes de onda para determinar el óptimo de dos fotones de longitud de onda de excitación de la muestra.
En jaulas con fluoresceína dextrano embriones de tipo salvaje se inyecta, para cada longitud de onda de excitación de dos fotones prueba también varía la potencia del láser promedio. Para una longitud de onda de excitación de 740 nm, un láser de potencia media de 47 mW produce una señal fuerte de fluoresceína en la región activa en comparación con el promedio más bajo poderes láser. Mayores potencias de láser promedio no producen señales más fuertes de fluoresceína, pero la ablación inducida del tejido. Puesto que los pulsos láser de femtosegundos son eficientes en la ablación de los tejidos biológicos 15, se recomienda la determinación de la media del umbral de potencia láser para la fotoactivación que evita la ablación del tejido.
Absorción de dos fotones se produce dentro de un volumen pequeño de interacción. Para garantizar la correcta activación del enjaulados fluoresceína dextrano, la célula debe ser llevado a un enfoque correcto. En el protocolo anterior, las células GFP positivas fueron fotografiadas simultáneamente con luz blanca para confirmar el enfoque de la célula. Por lo tanto, la adquisición de la luz blanca, además de otros canales es aconsejable. Después de confirmar el enfoque celular, el protocolo sugiere aumento de la celda activa. Un factor de zoom de 50 a 70 se sugiere, sin embargo, este valor depende del tamaño de la celda seleccionada. Aumentar el zoom aislados de la celda activa de las células adyacentes, y los límites de la zona de exploración de dos fotones de activación. Lo ideal sería que el área de exploración debe cubrir un área grande de la célula.
La detección de células activadas solo requiere que la tinción de fondo es mínimo. En el protocolo de inmunodetección por encima de ella es importante que la muestra está bloqueada en tampón de bloqueo durante 5 a 6 horas (paso 4,13). Cuando se desarrolla con NBT / BCIP, uncaged fluoresceína dextrano se hacen visibles en 10 a 20 minutos. Si la tinción de fondo es fuerte, se aconseja un tiempo más largo bloqueo y lavados adicionales para eliminar los anticuerpos (paso 4,17).
Las figuras 1 y 2 proporcionan resultados representativos de la foto-y la inmunodetección. En la figura 1, los primeros 1 - 2 de células de tipo salvaje embriones fueron inyectados con la etapa enjaulados fluoresceína dextrano. Los embriones se plantearon a mediados somitogenesis y montado en agarosa de baja fusión en la orientación lateral. Figura 1 (a, b) representar claro y las imágenes fluorescentes del embrión antes de la fotoactivación. La evidencia de que el embrión se mantuvo uncaged se demuestra por la ausencia de fluorescencia de la fluoresceína en la Figura 1 (b). Una pequeña región dentro de un somite se activó con una longitud de onda de 740 nm durante 31 segundos utilizando un láser de potencia media de 47 mW, la Figura 1 (c, flecha). Después de la activación de dos fotones uncaging de fluoresceína-dextrano se produjo, como se muestra por la fluorescencia de la zona activa, la Figura 1 (d, flecha). La activación no fue acompañado por la ablación por láser, como el tejido somitic mantuvo intacta la figura, 1 (c). La figura 2 muestra la inmunodetección de uncaged fluoresceína dextrano. Una pequeña región en el mesodermo de la placa lateral de un embrión en su fase de 10 somitas se fotoactivado utilizando los parámetros del láser que se mencionan en la Figura 1. El embrión fue levantado y procesados utilizando los pasos 4.1 a 4.20. La flecha en la Figura 2 localiza en la región activa, según lo indicado por la acumulación de precipitado de color azul. Sólo la ubicación activa se detecta claramente, sin interferir la tinción de fondo.
Preparación de las soluciones:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 x PBS
2 g de BSA
10 ml de 20% de Tween
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g KCl
6,1 g de Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
ddH2O a 1 L
pH a 7.3
Paraformaldehído al 4% (160 ml)
32% de paraformaldehído (dos viales de 10 ml)
8 de 20 ml X PBS
132 ml ddH2O
1 ml de 5 M NaCl
2,5 ml de 1 M de MgCl2
5 ml de 1 M Tris pH 9,5
250 l de Tween 20%
41,25 mL ddH2O
Solución de anticuerpos (para una muestra)
5,5 l de acetona en polvo
40 l PBT
LS 0.8 l
0,1 l anti-fluoresceína anticuerpos AP
2% LS (360 l de una muestra)
LS 7.2 l 100%
352,8 l PBT
1 X Danieau los medios de comunicación (1 l) ‡
11,6 ml de 5 M NaCl
700 l 1 M KCl
400 l 1 M MgSO 4
600 l 1 M de Ca (NO 3) 2
5 ml de 1 M HEPES
ddH2O a 1 L
pH ajustar a 7,6
‡ Danieau es una solución de sal ideales para la cría de embriones de pez cebra dechorionated. Otros medios de comunicación se pueden utilizar, siempre que sean isotónicas con la adecuada osmolaridad (~ 300 mOsm para el pez cebra)
NBT de valores (1 ml)
50 mg nitro azul tetrazolio
0,7 ml de anhídrido dimetilformamida
0,3 ml ddH2O
BCIP de valores (1 ml)
50 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
1 mL de anhídrido dimetilformamida
NBT / BCIP solución de desarrollo
1 ml de buffer AP
4,5 l de archivo NBT
3,5 l de valores BCIP
Acetona en polvo
- Seleccionar 20 peces adultos y congelarlos en nitrógeno líquido.
- Moler el pescado congelado con un mortero hasta obtener un polvo.
- Transferencia de la harina de pescado en un tubo cónico de 50 ml.
- Llenar el tubo cónico con acetona al 100%. El tubo de vórtice.
- Girar el tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.
- Lavar el sedimento otras 3 veces en acetona al 100% y el giro del tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Por el último lavado el sobrenadante debe ser transparente.
- Añadir 100% de acetona a la bolita de nuevo y dejar el tubo a temperatura ambiente. Las partículas más densas se instalará, mientras que las partículas más finas que permanecen en suspensión.
- Decantar las partículas finas en un nuevo tubo. Alícuota de la solución de polvo en tubos separados y almacenarlos a -20 ° C.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a J. Chen para proporcionar la jaula con fluoresceína dextrano protocolo de síntesis. Esta investigación fue financiada por March of Dimes premio 5-AF09-78, la American Heart premio de la Asociación 09BGIA2090075, y el premio del NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Un agradecimiento especial a C. Closson por su ayuda de microscopía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
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