Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Summary

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Abstract

Ayirt tek hücre etiketlemek için yeteneği gelişimsel biyoloji açısından önemli olmaktadır. Örneğin, nasıl hematopoetik belirlenmesi, lenf ve kan damarı soy embriyolar gelişmekte ortaya farklılaşmamış prekürsör hücrelerinin izleme kaderi haritalama ve soy gerektirir. Son zamanlarda, photoactivatable proteinler içerir: Eos ^{1, 2, 3} PAmCherry, Kaede ^{4-7, 8} pKindling, ve KikGR ^{9, 10} hücre izleme probları olarak büyük ilgi gördü. Bu proteinlerin ışığa duyarlı floresan spektrum kolayca hücre popülasyonunun bitişik olanları ayırt edilmesi için izin UV uyarma ile dönüştürülebilir. Bununla birlikte, aktif protein photoefficiency ¹¹ izleme uzun süreli hücre sınırlayabilir. Photoactivatable proteinlerin bir alternatif olarak, kafes floresein-dekstran yaygın olarak embriyo model sistemler ^{7, 12-14} olarak kullanılmıştır. Geleneksel olarak, floresein-dekstran, UV excit uncage içinBir floresan lamba ev veya tek bir foton UV lazer ation kullanılır olmuştur, ancak bu tür kaynaklardan fotoaktivasyon mekansal çözünürlüğü sınırlar. İşte kader haritası, soy izleme ve tek etiketli hücreleri algılamak için bir protokol rapor. Floresein-dekstran kafesli ile enjekte edilen embriyolar tek hücrelerin bir titanyum safir femtosaniye lazer üretilen yakın-kızılötesi lazer darbeleri ile fotoaktive edilir. Bu lazer gibi bu çalışmada kullanılan LSM 510 META NLO mikroskop gibi tüm iki-foton konfokal mikroskoplar gelenektir. Biyolojik doku yakın kızılötesi radyasyon ¹⁵ şeffaf olduğundan, lazer darbeleri Seçilen odak düzlemi üzerinde veya altında hücreler uncaging olmaksızın embriyonun içinde derin odaklı olabilir. Bu nedenle, non-lineer iki-foton soğurma tek bir hücrede floresein-dekstran uncage için geometrik odak sadece indüklenir. Floresein-dekstran Uncaged içeren hücre algılamak için, biz hızla visua basit bir immünhistokimya protokolü ¹⁶ tarifaktive edilmiş hücre lize. Bu çalışmada sunulan aktivasyon ve algılama protokolü yönlü ve herhangi bir model sistem uygulanabilir.

Not: Bu protokolde kullanılan reaktifler madde sonunda ekteki tabloda bulunabilir.

Protocol

1. Kafesli floresein-dekstran sentezi (Ref uyarlanmıştır. 14)

1. Sodyum ve bir 0.1 M çözelti hazırlayın GKD ₂ O. içinde seyreltilmiş bor
2. 10 kDa aminodextran 4 mg ölçün ve CMNB-kafesli floresein tüpüne ekleyin.
3. CMNB-kafesli floresein tüpüne hazırlanmış sodyum borat çözeltisi (adım 1.1) 500 mcL ekleyin. Karışım çözünmesi için 30 saniye için tüp ve girdap kapak takın.
4. Karışım, oda sıcaklığında bir gece boyunca reaksiyona nutator izin verir. Ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün.
5. Alt kapağı kapalı bir Zeba desalt spin kolon ve büküm edinin. Santrifüj zaman yönlendirmek için kolon kullanılır sütun üzerinde bir nokta işaretleyin. Bir 15 mL konik Falcon tüp içinde sütun yerleştirin. Not: spin kolon içinde çözüm sütunu tampon olduğunu.
6. Desalt spin kolon üzerine üst kapağını gevşetin. Bir centr yılında desalt spin kolon evler 15 ml konik Falcon tüp yerleştirinifuge. Orient işaretlenmiş nokta ile spin kolon (adım 1.4) santrifüj rotor merkezine bakan. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin tüp.
7. Santrifüj sonra, Falcon tüp desalt spin kolon çıkarın. Yoluyla toplanmış akış ve 15 ml konik boru her ikisi de atın. Yeni bir 15 ml konik Falcon tüp alın ve yeni Falcon tüp desalt spin kolon yerleştirin. Not: santrifüjleme sonra, reçine yatağının kolon sıkıştırılmış olmalıdır görünür. Hemen sütunu kullanın.
8. Adım 1.3 reaksiyon karışımı (floresein-dekstran kafesli) edinin. Spin kolon kapağını çıkarın ve reaksiyon karışımı aspirat ve desalt spin kolon merkezine yavaşça uygulayın. Reaksiyon karışımı uyguladıktan sonra, spin kolon üzerindeki kapağı değiştirin.
9. Bir santrifüj desalt spin kolon evler Falcon tüp yerleştirin. Gibi adım 1.5, santrifüj rotor merkezine bakan İşaretli nokta ile şark spin kolon yapılır. Centrifuge oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'de tüpü.
10. Santrifüjlemeden sonra, sarı bir karışım (fluorescein-dekstran kafesli) 15 ml Falcon tüp içinde (yaklaşık 400 ul) alınır. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne kafesli floresein-dekstran karışımı aktarın.
11. Hemen ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp kapağı. Bir Speedvac olarak kafese fluoresein-dekstran karışım Lyophilize. 350 mcL Liyofilizasyon yaklaşık 4 saat sürer.
12. Liyofilizasyon tamamen sonra, yaklaşık olarak% 1 arasında bir nihai konsantrasyona GKD ₂ O toz (yaklaşık 3 mg) tekrar süspansiyon w / v Kısaca toz askıya vorteks karıştırın.
13. Tablet ayrı metal folyo kaplı tüpler içine floresein-dekstran kafesli ve -20 ° C'de saklayın

2. Embriyoların Hasat ve kafesli floresein-dekstran mikroenjeksiyon

* Bu işlem zebrafish kullanırhayvan modeli sistem olarak.

1. Gününde enjeksiyon öncesi, zebrafish haçlar 01:01 erkek-kadın veya bölücüler ile tanklarda yetiştiriciliği 2:1 erkek-kadın ya yukarı ayarlayın.
2. Ertesi sabah yetiştirme tankı su değiştirmek ve bölücüler çıkarın. Ardından bir 5 mcL 1 X Danieau medya ya da kafes floresein-dekstran, 1/10 seyreltilmiş çalışma çözeltisi (Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız) ya da GKD ₂ O. hazırlamak Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile çalışma çözüm tüp örtün.
3. Iğne içine hazırlanmış kafesli fluoresein-dekstran çözeltisi (adım 2.2) pipet. Diseksiyon mikroskop altında uygun bir boyuta iğne ucu kesim önce, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf sarı filtre bir parça yerleştirin. Sarı filtre enjeksiyonlar sırasında flöresein-dekstran spontan uncaging önleyecektir. Oküler göz parça ile bakıldığında, ışık kaynağı sarı görünmesi gerekir.
4. Embriyolar toplayın ve bir microi içine Pipetinjection kalıp tepsisi. Floresein-dekstran kafesli 4 nL 3 sunmak için mikroenjeksiyon saati ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, şark forseps ile embriyoların ve enjekte (3 ila 4 nL) blastomer hücreleri (blastomer sarısı arabirimi) üssü haline flöresein-dekstran kafesli. Enjeksiyon için embriyo 1 olmalıdır - 2-hücreli aşamada.
5. Enjeksiyon sonrası, mikroenjeksiyon kalıp tepsiden embriyolar kaldırmak ve taze balık su içeren temiz bir petri kabına koyun. Metilen mavi% 0.02 az bir nihai konsantrasyonda mantar gelişimini önlemek için balık suyu ilave edilebilir w / v Floresein-dekstran kafesli enjekte arasında uncaging önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün.
6. İlgi hücreleri fotoaktive gerektiğinde bir aşama için enjekte edilen embriyolar kaldırın. Fotoaktivasyon için GKD ₂ O. bir% 0.6 düşük erime agaroz solüsyon hazırlanır Tricaine (MS222), embriyo bağlı olarak, düşük erime noktalı agaroz için ilave edilebilir. Bunu yapmak için, 0.0 sulandırmak% 0.0014 arasında bir nihai konsantrasyona kadar düşük erime noktalı agaroz içinde% 2 Tricaine.
7. Embriyoların uygun gelişimsel aşamada ulaşır ulaşmaz, forseps ile 1 X Danieau medya dechorionate embriyolar. Dechorionating zaman, şeffaf sarı filtre (adım 2.3) beyaz ışık kaynağının yolunu yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
8. 37 ° C'ye% 0.6 düşük erime agaroz çözüm ısıtın Bir LABTEK odalı coverglass slayt kuyuya düşük erime agaroz pipetle 1 mL. Dikkatlice alt lamel karşı aşağı bakacak fotoaktive gereken hücreler ile forseps ile düşük erime agaroz ve yönlendirilmesi 4 embriyoların 3 monte.
9. Agaroz katılaşmaya bırakın. Katılaşma sonra pipet agaroz üzerinde 1 X Danieau medyanın 1 ml.
10. Daha embriyo için 2.9 adımları 2.8 tekrarlayın.

3. Kafesli floresein-dekstran İki fotonun aktivasyon

* Bu işlem embriyonun reporte ifade ettiğini varsayarr GFP. Embriyo LSM 510 META NLO mikroskop bağlı argon iyon (488 nm) lazer kaynağı kullanılarak görüntülenebilir. Tek bir GFP pozitif hücre seçilir ve LSM 510 birleştiğinde Mai Tai lazer (femtosaniye lazer) kullanılarak fotoaktive edilir. Prosedür floresan olmayan embriyolar için aynıdır. Alternatif olarak, beyaz ışık Mai Tai lazer kaynağı kullanarak etkinleştirme ve ardından aktive edilmesi, hücre, bulmak için de kullanılabilir.

1. LSM 510 yazılımı yükleyin. Beyaz ışık ışın yolu bir şeffaf sarı filtre yerleştirin.
2. Tarama Yeni Resim seçin ve Uzman Modu Başlat'ı tıklatın.
3. Lazer sekmesini seçin. Argon iyon (488 nm) ve Mai Tai (femtosecond) lazer kaynağı açın.
4. 740 nm Mai Tai dalgaboyu ayarlayın.
5. Yapılandırma sekmesini seçin. Argon iyon ve Mai Tai lazer optik yol yapılandırmasını ayarlayın.
6. Tara sekmesini seçin. 20X/0.8 için objektif değiştirin.
7. Max tıklayarak maksimum tarama hızı ayarlayın.
8. Set Mode, Yöntem ve Hat Numara, Ortalama ve 1.
9. Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai dışında tüm lazer kaynaklarının altında.
10. Optik ışın yolu bir güç ölçer yerleştirin.
11. Sürekli tarama etkinleştirmek için Devam düğmesini seçin.
12. Güç metre 47 mW ortalama bir lazer güç okuyana kadar iletim% ayarlayın.
13. Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun.
14. Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai lazer kaynağı ve argon iyon (488 nm) altında seçin.
15. Hızlı xy düğmesini seçin. Kanallar sekmesinin altında iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, ve en iyi görüntü kalitesini elde etmek için argon iyon lazer yükselteç kazancı ayarlayın.
16. Sahne denetleyici kullanarak, bulmak ve etkinleştirmek için hücre odaklanmak.
17. Durdur düğmesine tıklayın.
18. Mod sekmesi altında yakınlaştırma faktörü 50 ile 70 görüntüler kadar aktif hücre üzerinde yakınlaştırma aracı, yakınlaştırma kullanma.
19. Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun.
20. Kanallar sekmesini kaldırın argon iyon las altındave er (488 nm) Mai Tai lazer seçin.
21. Mod sekmesi altında 31.46 sn tarama hızını ayarlayabilirsiniz.
22. Seçilen hücrenin floresein-dekstran Kafeste iki-foton aktivasyonu için tarama başlatmak için tek düğmesini seçin.
23. Sonra aktivasyon seçimini kaldırın Mai Tai Kanallar sekmesi altında lazer ve yeniden seçme argon iyon lazer (488 nm).
24. 1 Mod altında yakınlaştırma faktörünü ayarlayın ve hızlı tarama hızını ayarlamak için başlığı Hız altında Max düğmesini tıklatın.
25. Fotoaktive bölgeyi incelemek için Hızlı xy seçin. Fotoaktive bölgeye lazer ablasyon olmadığını kontrol edin. Lazer ablasyon hakkında daha fazla bilgi için, tartışma bölümüne bakın.
26. Diğer embriyolar için yukarıdaki adımları tekrarlayın.

4. Uncaged floresein-dekstran İmmuno (Ref uyarlanmıştır. 16)

1. Photoativation sonra, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf bir sarı filtre yerleştirin ve elle l her bir embriyo çıkarınkeskin forseps kullanarak ow erime agaroz. Taze 1 X Danieau medya içeren yeni bir petri tüm kaldırıldı embriyolar yerleştirin. Işığa embriyoların maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün.
2. Gerekirse istenen gelişim aşamasına embriyolar, arka. Bu arada, (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız)% 4 paraformaldehid solüsyon hazırlanır. Bir mikrosantrifüj tüp içine hazırlanmış paraformaldehid arasında kısım 1.5 ml.
3. Embriyoların ilgi gelişim aşamasına ulaşmış sonra, mikrosantrifüj tüp (adım 4.2 'dan itibaren) içine embriyolar Pipeti. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün.
4. 4. gece boyunca tüp Nutate ° C. Ertesi gün için fosfat tamponu (PBS) ve GKD ₂ O derecelendirildi etanol (EtOH) çözümler hazırlamak;% 30 EtOH: PBS,% 50 EtOH: PBS,% 70 EtOH: GKD ₂ O ve% 100 EtOH.
5. Ertesi gün, 4 ° C arasında embriyolar çıkarmak Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı para kapalı aspireformaldehye (embriyolar kaplayacak kadar küçük bir hacim geride bırakmak). % 30 lik EtOH pipetle 1.5 mL: tüp içine PBS ile yıkandı. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate.
6. 4,5, 70 50 ile ve% 100 EtOH çözümler derecelendirildi adımı yineleyin. % 100 EtOH yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 EtOH içinde yeniden embriyolar durulayın.
7. Yıkamadan sonra, -20 ° C'de gece boyunca embriyolar depolamak Ertesi gün için fosfat (PBT; Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) aranın tamponlu hazırlamak, 5 X engelleme tampon (Hazırlık üreticisi protokol bakın), maleik asit (Hazırlık protokolü engelleme tampon protokol bulunabilir), 10 mg / ml proteinaz K, ve bir 10 x antikor çözeltisi (Anti-florosin AP-; Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız).
8. PBT seyreltilir; Ayrıca kuzu serum (Çözeltilerin Hazırlanması bkz. LS)% 2 hazırlar. 4 de antikor Mağaza ° C gecede bir nutator sallayarak. % 2 LS 4 ° C'de muhafaza edilebilir
9. Ertesi gün embriyolar kaldırmak-20 ° C'den Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı% 100 EtOH kapalı aspire. Tüp GKD ₂ O:% 70 EtOH 1.5 mL ekleyin. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate.
10. 4.8 kullanılarak 50 ve% 30 EtOH çözümleri derecelendirildi ve% 100 PBT adımı yineleyin. % 100 PBT yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 PBT olarak embriyolar daha fazla 3 kez yıkayın.
11. Embriyoların 24 saatten daha yaşlı iseniz, proteinaz K onları tedavi. Değilse, 4.13 adıma geçin. Bunu yapmak için, PBT Hazırlanan proteinaz K (adım 4.7) 1:1000 sulandırmak. Embriyoların büyükseniz 10 dakika veya daha uzun süre proteinaz K embriyolar inkübe edin. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun.
12. Proteinaz K tedaviden sonra, 10 dakika için PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, bir nutator oda sıcaklığında 30 dakika için% 4 paraformaldehit içinde embriyolar düzeltmek. Daha sonra, hemen 10 dakika PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Embriyolar tutunışığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır.
13. 1 X. PBT gelen embriyolar çıkarın ve 1 X tampon engelleme yerleştirmek için maleik asit tampon tampon engelleme 5 X sulandırarak engelleme tampon yapın. Metal folyo ile, embriyoları örtün ve 5-6 saat için oda sıcaklığında onları nutate.
14. 65 de ısı şoku, embriyolar engelleme 15-20 dakika için ° C. 5-6 saat sonra
15. Antikor çözeltisi ve bir önceki gün hazırlandı% 2 LS elde edilir. Max rpm antikor çözüm santrifüjleyin. % 2 LS tüp için sulu faz transfer edin. Karıştırmak için Tüpü ters çevirin.
16. LS-antikor karışımı tampon engelleme embriyolar transfer. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun. 4 ° C'da gece boyunca embriyolar Nutate.
17. Ertesi gün, 6 kez, PBT içinde 15 dakika için oda sıcaklığında embriyolar yıkayın. AP tamponu (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın.
18. AP met içinde 10 dakika için oda sıcaklığında 2 kez yıkayın embriyolarffer. NBT / BCIP gelişmekte çözeltisi (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın.
19. NBT / BCIP için embriyolar transfer. Leke karanlıkta geliştirmek için izin ver.
20. 5 dakika her embriyolar PBT 3 kez yıkanarak gelişimini durdurur.
21. Görüntü alımı için% 0.6 düşük erime agaroz veya% 3 metilselüloz embriyolar monte ve bir ters veya dik bileşik mikroskop kullanılarak görüntü elde.
22. Fotoaktive örnekleri derecelendirilmiş bir EtOH yıkama onları dehydrating gelecek analizi (boyama sabit kalır) saklanabilir. Örnekleri dehydrating 4.7 adımları 4.4 izleyin.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. Floresein-dekstran kafesli bir Fotoaktivasyona. (A, B) ve aydınlık fotoaktivasyon önce 13/14-somite aşamada bir yan görünümdür zebrafish embriyo floresan imaj. (C, D) Embriyo fotoaktive edildi740 nm dalga boyuna sahip Somitlerin (ok) bir t the13/14-somite aşamasında, 31 saniye saati ve 47 mW ortalama bir lazer güç tarayın. Post-aktivasyonu, (d) Uncaged floresein-dekstran dan floresan gözlemlenmiştir. Oryantasyon: Dorsal (sağda), ventral (solda). Ölçek çubuğu 100 mikron.

Şekil 2. Floresein-dekstran kafesli bir İmmuno. Şekil 2 18/19 hpf zebrafish embriyo Uncaged floresein-dekstran immün gösteriyor. 10-somite aşamada embriyo küçük bir bölgeye Şekil 1'de belirtilen aynı lazer parametreleri kullanarak lateral plaka mezoderm faaliyete geçmiştir. İmmuno prosedürü kullanarak, ok en az arka plan boyama yöntemi ile, aktive edilmiş bölgesini tanımlar. Oryantasyon: Dorsal (üst), ventral (alt). Ölçek çubuğu 100 mikron.

Discussion

Bu kağıt floresein-dekstran kafesli bir fotoaktivasyon dayalı tek bir hücre kaderi haritalama için çok yönlü bir yöntem açıklanır. Tek hücreler içinde floresein-dekstran kafesli bir Uncaging Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskop ile birleştiğinde bir Mai Tai femtosaniye lazer iki-foton soğurma kullanılarak elde edilir. Fotoaktive hücrelerinde Uncaged floresein-dekstran basit immünohistokimya prosedürü kullanarak hızla görüntülenmiştir.

Bu protokolde kafesli floresein-dekstran fotoaktivasyon için iki foton soğurma dalga boyu 740 nm. Bu dalga boyu deneysel olarak kafese floresein-dekstran enjekte yabani-tip embriyolar photoactivating ile tespit edilmiştir. Lazer uyarma dalga boyu 600 ila 800 nm arasında değişiyordu, floresein floresan sonrası aktivasyonunun varlığı veya yokluğu niteliksel olarak tespit edilmiştir. Biz 740 nm güçlü flöresein sinyal aşağıdaki aktivasyon ürettiğini bulundu. İdeal olarak, 740 nm herkes için çalışması gerektiğinimodel sistemler, ancak biz örnek için en uygun iki foton uyarma dalgaboyu belirlemek için dalga boyu bir dizi test öneriyoruz.

Her iki foton uyarma dalgaboyu biz de ortalama lazer gücü zengindir test için kafesli olarak floresein-dekstran, yabani-tip embriyolar enjekte. 740 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu için, 47 arasında bir ortalama lazer güç mW ortalama lazer güçler düşürmek ile karşılaştırıldığında, aktif bölge de daha kuvvetli bir fluoresein sinyal üretti. Yükseköğretim ortalama lazer güçler güçlü floresan sinyalleri üretmek, ancak doku kaynaklı ablasyonu vermedi. Femtosaniye lazer darbeleri ablasyonu biyolojik doku ¹⁵ verimli olduğundan, biz doku ablasyonu önler fotoaktivasyon için eşik ortalama lazer gücünün belirlenmesinde öneririz.

İki foton soğurma küçük bir etkileşim hacmi içinde gerçekleşir. Kafesli floresein-dekstran uygun aktivasyon sağlamak için, hücrenin uygun odak noktasına getirilmelidir. Thprotokolü yukarıdaki e, GFP pozitif hücreler aynı anda hücre odak onaylamak için beyaz ışık altında görüntülendi. Bu nedenle, beyaz ışık toplama diğer kanallarına ek olarak tavsiye edilir. Hücre odak onayladıktan sonra, bizim protokolü aktif hücre büyütme göstermektedir. 50 ila 70 arasında bir büyütme faktörü tavsiye edilmektedir, bununla birlikte, bu değer hücre seçilmiş büyüklüğüne bağlıdır. Zum arttırılması bitişik hücrelerin aktive olan hücre izole etme, ve iki-fotonlu aktivasyonu için tarama alanı sınırlar. İdeal olarak, tarama alanının hücre geniş bir alanı kapsamalıdır.

Tek aktif hücrelerin saptanması plan boyama minimal olmasını gerektirir. Yukarıdaki İmmuno protokolde bu örnek 5 ila 6 saat (adım 4.13) için tampon engelleme engellenmiş olduğunu önemlidir. NBT / BCIP ile geliştirirken, Uncaged floresein-dekstran 10 ila 20 dakika içinde görünür hale gelmelidir. Arka plan boyama güçlü ise, anti-kaldırmak için uzun bir engelleme süre ve ek yıkar öneririzvücut (adım 4.17).

Şekiller 1 ve 2 fotoaktivasyon ve İmmuno temsili sonuçlar sağlar. Şekil 1, erken 1 - 2-hücreli aşamada yabani-tip embriyolar floresein-dekstran kafesli enjekte edildi. Embriyolar orta somitogenesis kaldırdı ve yanal yönde düşük erime agaroz monte edildi. Şekil 1. (a, b) fotoaktivasyon önce Aydınlık ve embriyo floresan görüntüler betimliyor. Embriyo Uncaged kalmıştır dair kanıt Şekil 1 (b) 'de floresan floresan olmaması ile ortaya konmuştur. Bir somite içinde küçük bir bölge 47 ortalama bir lazer güç mW, Şekil 1 (; ok c) kullanarak 31 saniye için 740 nm dalga boyu ile aktive edildi. Floresein-dekstran Post-aktivasyon, iki-fotonlu uncaging olarak etkin alan, Şekil 1 (; ok d) floresan ile gösterilen oluştu. Somitic dokusu bozulmadan, Şekil 1 (c) kalmıştır Aktivasyon, lazer ablasyon eşlik etmemişti. Şekil 2, Uncaged florun İmmuno göstermektedir -dekstran escein. 10 somite aşama embriyo yan plaka mezoderm içinde küçük bir bölge Şekil 1 'de belirtildiği gibi aynı lazer parametreleri kullanarak fotoaktive edildi. Embriyo kaldırdı ve 4.20 arasındaki adımları 4.1 kullanılarak işlendi. Şekil 2 bulur ok aktif bölge olarak mavi çökelti birikimi ile gösterilir. Sadece aktif konum açıkça arka plan boyama müdahale olmadan tespit edilir.

Çözeltilerin Hazırlanması:

1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 mL% 20 Tween

10 x PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCI
6.1 g Na ₂ HPO ₄
1.9 g KH ₂ PO ₄
1 L GKD ₂ O
7.3 pH

% 4 paraformaldehit (160 mL)
% 32 Paraformaldehyde (iki 10 ml flakon)
8 ml 20 X PBS
132 ml GKD ₂ O

jove_content "> AP Tamponu (50 mL)
1 mL 5 M NaCl
2,5 ml 1 M _MgCl2
5 mL 1 M Tris, pH 9.5
250 ul% 20 Tween
41.25 ml GKD ₂ O

Antikor çözeltisi (1 numune için)
5.5 mcL Aseton tozu
40 ul PBT
0.8 mcL LS
0.1 mcL Anti-florosin AP-antikor

% 2 LS (1 numune için 360 mcL)
7.2 mcL% 100 LS
352,8 mcL PBT

1 X Danieau ortamı (1 L) ^‡
11.6 ml 5 M NaCI
700 mcL 1 M KCl
400 ul 1 M _MgSO4
600 ul 1 M Ca (NO _{3) 2}
5 mL 1 M HEPES
1 L GKD ₂ O
pH 7,6 ayarlamak

^‡ Danieau dechorionated zebrafish embriyolar yetiştirme için ideal bir tuz bir çözümdür. Diğer medya kullanılıyor olabilir, bunlar pro ile izotonik çözeltiler şartıylaPerly ozmolarite (zebrafish için ~ 300 mOsm)

NBT stok (1 mL)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0.7 ml dimetil formamid anhidrid
0.3 ml GKD ₂ O

BCIP stok (1 mL)
50 mg 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat
1 ml dimetil formamid anhidrid

NBT / BCIP gelişmekte çözümü
1 mL AP tampon
4.5 mcL NBT stok
3.5 mcL BCIP stok

Aseton tozu

1. 20 erişkin balık seçin ve sıvı azot içinde bunları dondurmak.
2. Bir harçla dondurulmuş balık Grind ve toz pestle.
3. Bir 50 mL konik bir tüp içine balık tozu aktarın.
4. % 100 aseton ile konik boru doldurun. Vorteks tüpü.
5. 10 dakika için maksimum devirde tüp Spin. Süpernatantı atın.
6. % 100 aseton pelet 3 kez yıkayın ve 10 dakika için maksimum devirde tüp dönerler. By son yıkama süpernatantı açıkça görünmelidir.
7. Tekrar pelet% 100 aseton ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bekletin. Ince parçacıkların süspansiyon kalır ise daha yoğun parçacıklar, razı olacak.
8. Yeni bir tüp içine ince parçacıklar süzün. Tablet toz ayrı tüpleri içine çözelti ve -20 ° C'de saklayın

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
10 kDa Aminodextran	Invitrogen	D1860
Zeba Desalt Spin Column	Pierce, Thermo Scientific	89889
Low melting agarose	Amresco	0815-100G
Sodium Borate	Amresco	1131117-100G
Tricaine Methylsulfonate/ MS222	Research Organics	1347A
Anti-fluorescein-AP	Roche Group	11376622
Blocking buffer	Roche Group	11 096 176 001
Maleic Acid	Sigma-Aldrich	MO375-500G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
NBT	Sigma-Aldrich	I8377-250mg
BCIP	Fisher Scientific	PI-34040
Microinjector	Harvard Apparatus	PLI-2000
LabTek chambered coverglass slides	Nalge Nunc international	155380
Proteinase K	Invitrogen	AM2544
Lamb serum	Invitrogen	16070096
LSM 510 META NLO	Carl Zeiss, Inc.
20X 0.8 NA Air apochromatic objective	Carl Zeiss, Inc.
Transparent yellow filter	Theatre House Inc.	Roscolux filter sheet Color: 312