الجيل مسخي في كبسولة الخصية

Summary

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) لديها القدرة على التعامل مع عدد لا يحصى من الأمراض المختلفة. فائدة هذه الخلايا تكمن في حقيقة أنها يمكن أن تفرق في أي نوع من الخلايا في الجسم. نحن هنا وصف فحص مسخي، والذي يستخدم للتدليل على pluripotence من hPSCs.

Abstract

الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية) لديها ميزة فريدة من نوعها التي يمكن أن تفرق في الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. هذا يجعل منها أداة قيمة محتملة لعلاج أمراض عديدة ومختلفة. مع ظهور الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، ومواصلة البحث مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هناك حاجة للفحوصات التي يمكن أن تثبت أن خط الخلية بشكل خاص المحفزة. وكانت سلالة الجرثومية انتقال المعيار الذهبي ليدل على pluripotence من الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) خطوط ^1،2،3. باستخدام هذا الفحص، يمكن للباحثين تبين أن خط مسك يمكن ان يجعل جميع أنواع الخلايا في الجنين بما في ذلك الخلايا الجرثومية ^4. مع الجيل من خطوط ESC الإنسان ^5،6، وكان الفحص المناسبة لاثبات pluripotence من هذه الخلايا غير واضح منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا يمكن أن الإنسان لا يمكن اختبارها لانتقال سلالة الجرثومية. كبديل، ويستخدم حاليا لفحص مسخي للتدليل على pluripotency الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) ^7،8،9. رغم أن هذا الاختبار قد حان مؤخرا تحت التدقيق ويجري استكشاف التكنولوجيات الجديدة بنشاط، وفحص مسخي هو معيار الذهب الحالية ^7. في هذا الاختبار، يتم حقن هذه الخلايا في مسألة الى فأر المناعية للخطر. إذا كانت الخلايا المحفزة، سوف مسخي وضع في نهاية المطاف، وأجزاء من الورم وسوف تظهر الأنسجة من جميع الطبقات الجرثومية 3 ^10. في مقايسة مسخي، يمكن حقنه hPSCs في مناطق مختلفة من الماوس. مواقع الحقن الأكثر شيوعا تشمل كبسولة الخصية، وكبسولة الكلى والكبد، أو في الساق إما تحت الجلد أو في العضل ^11. نحن هنا وصفا لبروتوكول قوية لجيل من teratomas من hPSCs باستخدام كبسولة خصية كموقع لنمو الورم.

Protocol

ملاحظة: يجب الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية IACUC أو ما يعادلها.

يجب تعقيم جميع المعدات الجراحية قبل الجراحة. يجب استخدام القفازات المعقمة، والستائر، والشاش.

1. قبل الجراحة إعداد

1. الحصول على 6 أسابيع من العمر Musculus موريشيوس CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J ذكور الفئران أو غيرها من سلالة المناعة من الماوس.
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية، والقفازات، والشاش.
3. فصل hPSCs ليتم حقنه مع accutase.
4. عد الخلايا والخلايا في resuspend 1000000 20-30 ميكروليتر في matrigel المخفف 1:1 في DMEM/F-12. حفاظ على الخلايا على الجليد حتى الانتهاء.
5. لاحظ أن في كثير من الأحيان يكون من المفيد القيام المدى من خلال التجربة حيث يتم حقن التريبان الأزرق. وهذا سوف يساعد على تحديد أي مشاكل محتملة قبل أن يتم إهدار أي الخلايا.
6. في المربى اليابس، تخدير الماوس وفقا لإجراءات مقبولة في مؤسستك. في تجاربنا، استخدمنا anesthESIA آلة مع isoflurane. وضعت في البداية فئران في غرفة الاستقراء مع الأكسجين 1L/min و 3-4٪ isoflurane. تخدير مرة واحدة، استخدمت مخروط الأنف مع الأكسجين 1L/min وisoflurane 2-3٪.
7. حلق البطن مع لوس انجليس كليبرز، وتنظيف الجدار الأمامي للبطن الفأر، بدءا من وسط البطن، والعمل في اتجاه عقارب الساعة نحو الخارج. أول استخدام محلول البوفيدون اليودي ثم تغسل مع الايثانول 70٪. كرر 3 مرات، وتغيير مسحات في كل مرة. نقل الحيوان إلى وسادة التدفئة للحفاظ على الحيوانات دافئ داخل الأنسجة أو غطاء محرك السيارة تشريح.
8. جعل شق طولي 1 سم عن طريق الجلد والصفاق مع مقص جراحي معقم فقط تحت مستوى مفصل الورك.
9. في حين عقد الصفاق بالملقط، تصل بسرعة نحو الورك الأيمن مع آخر forcept معقمة وسحب الأنسجة الدهنية البيضاء جنبا إلى جنب مع الخصيتين المرفقة.
10. وضع الخصيتين على شاش معقم.
11. ملء السلين أو هاميلتون (1cc) حقنة وايعشر ليتم حقنه في hPSCs. لاحظ أن ذلك هو فكرة جيدة لتشمل خط السيطرة hPSC الذي تعرفه المحفزة مثل WA09 (المعروف أيضا باسم H9). بهذه الطريقة يكون لديك سيطرة الإيجابية التي يمكنك استخدامها لتحديد ما إذا كان الحقن أو الجراحة كانت معيبة.
12. حقن ببطء hPSCs (20-30 ميكرولتر) في مركز الكبسولة الخصية بعيدا عن أي الأوعية الدموية الرئيسية، ووقف إذا الكبسولة الخصية يبدأ تضخم.
13. إزالة الإبرة ببطء لتجنب ارتداد من الخلايا.
14. باستخدام ملقط، نقل الخصيتين والأنسجة الدهنية العودة إلى موقعها الأصلي في البطن.
15. قرب الصفاق مع 2 أو 3 الغرز reabsorbable وإغلاق الجلد مع autoclips.
16. يجب أن تبقى الماوس دافئ حتى يتعافى، ونظرا شكلا من أشكال مسكن (انظر ما هو مقبول في المربى اليابس لديك) بعد خضوعه لجراحة مرتين في اليوم لمدة 1-2 أيام.
    لاحظ أن أيا من مخدر ولا مسكن لمع يتعارض مع نمو الورم.
17. رصد الحيوان ه لنمو الورم لمدة 6-12 أسابيع. نادرا جدا، والأورام يمكن أن تنمو إلى 5 ملم في حجم قبل 6 أسابيع بعد الحقن، وبالتالي فإنه من المهم لمراقبة الحيوانات. إذا حدث هذا، يجب أن يتم التخلص الحيوانات ومعالجة الأورام وتحليلها على النحو المعتاد.
18. ذات مرة كان الورم واضح ويصل 5mm تقريبا في الحجم، تخدير الماوس وتضحية وفقا لإجراءات قبول بروتوكول الحيوان.
19. إزالة ورم وثيقة وفقا لذلك - صورة وقياس حجم ووزن.
20. قطع الورم الى قطع صغيرة واصلاحها في حل بارافورمالدهيد 4٪. وترسل في مخزن لامتصاص العرق 4٪ حتى العينات إلى الطبيب الشرعي لتلطيخ، باجتزاء والتحليل.

2. ممثل النتائج:

عندما يتم ذلك بروتوكول كما هو موضح وخط خلية حقن غير المحفزة، وينبغي أن واضح، واضح بصريا، وتشكل ورم في غضون 12 أسبوعا على الأكثر. لخطوط hPSC راسخة مثل WA09، ونحن نرى عادةالأورام في غضون 6 أسابيع. لخطوط iPSC ليس من غير المألوف أن نرى الأورام داخل 8-10 أسابيع. من المهم جدا لحقن الفئران مع خط ما هو معروف أن تكون ذات قوة تناسلية متعددة، كعنصر تحكم إيجابية، من أجل أن تتأكد من أن تم تنفيذ هذا الإجراء بشكل صحيح. الأورام تبدو عادة غير متجانسة، ولها العديد من الخراجات المرفق (الشكل 1). وينبغي تحليل العينات ورم من قبل الطبيب الشرعي تبين أنسجة مختلفة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث (الشكل 2).

الشكل 1. نموذجي hPSC مسخي مستمد في كبسولة الخصية.

بعد بروتوكول وصفها، تم حقن 1000000 WA09 الخلايا في الخصية كبسولة من الماوس المناعية للخطر. بعد ستة أسابيع لوحظ وجود ورم مسخي. أ) ورم مسخي انسحبت من الماوس. ب) عن قرب صورة للمسخي. لاحظ الهياكل عدم التجانس وكيس.

الشكل 2. هيماتوكسيلين والمقاطع يوزين الملون من مسخي إظهار الأنسجة من كل طبقة الجرثومية.
بعد التثبيت، وكان مسخي مقطوع والملون مع هيماتوكسيلين ويوزين. وكشف تحليل من قبل الطبيب الشرعي وجود خلايا من كل الطبقات الجرثومية 3.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا يوفر موثوق بها للغاية، وسيلة واضحة لتوليد teratomas من hPSCs في كبسولة الخصية. هناك العديد من البارامترات الحاسمة في هذه التقنية. على وجه الخصوص، من المهم أن حقن خطوط الخلايا hPSC أن من المعروف أن المحفزة كمجموعة تحكم. المعالم الهامة الأخرى تشمل والفاصل الزمني بين الحقن ومراقبة الورم. لخطوط الخلية مثل WA09، ينبغي مراعاة teratomas في 6-8 أسابيع. لخطوط iPSC جديد نجد أن كثيرا ما يطلب من 10 أسابيع. قلق آخر هو عدد الخلايا حقن. نحن حقن 1000000 الخلايا ولكن يمكن بسهولة الفحص يمكن القيام به مع عدد أقل من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، وسيلة حقن المهم. نجد أن نحصل على أفضل النتائج عندما يتم حقن هذه الخلايا في خليط 01:01 من matrigel وDMEM/F-12، بدلا من برنامج تلفزيوني أو DMEM/F-12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Invitrogen	A1110501
DMEM/F-12	Invitrogen	113300-032
Matrigel	BD Biosciences	354277