Summary
Les cellules souches pluripotentes (hPSCs) ont le potentiel pour traiter une myriade de maladies différentes. L'utilité de ces cellules réside dans le fait qu'elles peuvent se différencier en n'importe quel type cellulaire dans le corps. Nous décrivons ici le dosage tératome, qui est utilisé pour démontrer la pluripotence des hPSCs.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes (CSP) ont la caractéristique unique qu'ils peuvent se différencier en cellules de tous les trois feuillets embryonnaires. Cela les rend un outil potentiellement précieux pour le traitement de nombreuses maladies différentes. Avec l'avènement de cellules souches pluripotentes induites (CISP) et de la recherche continue sur les cellules souches embryonnaires (CSEh) il ya un besoin pour des essais qui peuvent démontrer que d'une lignée cellulaire donnée est pluripotentes. La transmission germinale a été l'étalon-or pour démontrer la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris (CESM) lignes 1,2,3. L'utilisation de ce test, les chercheurs peuvent montrer qu'une ligne MESC peut faire tous les types de cellules dans l'embryon, y compris les cellules germinales 4. Avec la nouvelle génération de CSE humaines lignes 5,6, le dosage approprié pour prouver pluripotence de ces cellules était pas claire, car les CES de l'homme ne peut pas être testé pour la transmission germinale. Comme une mère porteuse, le dosage tératome est actuellement utilisé pour démontrer la pluripotrence des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) 7,8,9. Bien que ce test a récemment fait l'objet de contrôle et de nouvelles technologies sont actuellement à l'étude, le dosage tératome est l'étalon-or actuel 7. Dans cet essai, les cellules en question sont injectés dans une souris immunodéprimées. Si les cellules sont pluripotentes, un tératome finiront par développer et les articles de la tumeur montrent les tissus de tous les 3 couches germinales 10. Dans le dosage tératome, hPSCs peut être injecté dans différentes zones de la souris. Les sites d'injection les plus courants sont la capsule du testicule, de la capsule du rein, le foie, ou dans la jambe soit sous-cutanée ou intramusculaire 11. On décrit ici un protocole robuste pour la génération des tératomes de hPSCs utilisant la capsule testicule comme site de croissance de la tumeur.
Protocol
Remarque: Toutes les procédures d'animaux doit être approuvé par IACUC ou équivalent.
Tous les équipements chirurgicaux doivent être stérilisés avant la chirurgie. Des gants stériles, les rideaux de gaze et doit être utilisé.
1. Préparation avant la chirurgie
- Obtenir 6 semaines vieilles Mus musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J chez les souris mâles ou d'autres déformations de la souris immunodéprimée.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux, des gants et gaze.
- Dissocier hPSCs être injectés avec accutase.
- Compter les cellules et remettre en suspension 1.000.000 cellules par 20-30 uL dans matrigel dilué 1:1 dans DMEM/F-12. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à la fin.
- Notez que souvent, il est utile de faire une course à travers de l'expérience où Trypan bleu est injecté. Cela aidera à identifier les problèmes potentiels avant que les cellules sont gaspillées.
- Dans le vivarium, anesthésier votre souris selon les procédures acceptées à votre institution. Dans nos expériences, nous avons utilisé un Anesthmachine à EIES avec l'isoflurane. Les souris ont été d'abord mis dans une chambre d'induction avec de l'oxygène 1l/min et de 3-4% l'isoflurane. Une fois anesthésié, un cône de nez avec de l'oxygène 1l/min et 2-3% d'isoflurane a été utilisé.
- Rasage de l'abdomen avec une tondeuse, et nettoyer la paroi antérieure de l'abdomen de la souris, à partir du centre de l'abdomen et de travail dans le sens horaire vers l'extérieur. Première utilisation de povidone-iode solution puis laver avec de l'éthanol 70%. Répétez 3 fois, en changeant à chaque fois des écouvillons. Transfert de l'animal à un coussin chauffant pour garder l'animal chaud à l'intérieur d'une culture tissulaire ou le capot de dissection.
- Faire une incision de 1 cm longitudinale à travers la peau et le péritoine d'stériles ciseaux chirurgicaux juste en dessous du niveau de l'articulation de la hanche.
- Tout en maintenant le péritoine avec des pinces, atteindre vers le bas vers la hanche droite avec un autre forcept stérile et retirer le tissu blanc gras avec des testicules attachés.
- Placez les testicules sur de la gaze stérile.
- Remplissez une tuberculine ou à Hamilton (1cc) seringue wie les hPSCs à injecter. Notez que c'est une bonne idée d'inclure une ligne de commande HPSC que vous savez pluripotentes comme les WA09 (également connu sous le nom H9). De cette façon, vous avez un contrôle positif qui vous pouvez utiliser pour déterminer si l'injection ou la chirurgie était viciée.
- Injecter lentement les hPSCs (20-30 pi) dans le centre de la capsule testicule écart des gros vaisseaux sanguins, l'arrêt si la capsule testiculaire commence à gonfler.
- Retirez l'aiguille lentement pour éviter le reflux des cellules.
- En utilisant des pinces, transférer les testicules et le dos du tissu adipeux à sa position initiale dans l'abdomen.
- Fermez le péritoine avec 2 ou 3 points de suture résorbables et fermer la peau avec autoclips.
- La souris doit être gardé au chaud jusqu'à ce qu'il récupère et étant donné une certaine forme d'analgésique (voir ce qui est accepté dans votre vivarium) après la chirurgie deux fois par jour pendant 1-2 jours.
Notez que ni l'anesthésie ni l'analgésie avec interférer avec le développement des tumeurs. - Surveiller eanimale e pour la croissance tumorale pendant 6-12 semaines. Très rarement, les tumeurs peuvent se développer à 5 mm de diamètre dans les 6 semaines après l'injection, il est donc important de surveiller les animaux. Si cela se produit, les animaux doivent être euthanasiés et les tumeurs traitées et analysées comme d'habitude.
- Une fois que la tumeur est palpable et atteint environ 5 mm de taille, anesthésier la souris et le sacrifier selon les procédures acceptées protocole animaux.
- Retirer de la tumeur et le document en conséquence - la taille photographier, de mesurer, peser.
- Couper en petits morceaux la tumeur et de fixer dans une solution de paraformaldéhyde à 4%. Entreposer dans du paraformaldéhyde à 4% avant que des échantillons sont envoyés à un pathologiste pour la coupe, coloration et de l'analyse.
2. Résultats représentatifs:
Lorsque ce protocole est fait tel que décrit et la lignée cellulaire injecté est pluripotentes, une palpable, évidente visuellement, la tumeur doit former dans les 12 semaines au plus. Pour établies lignes HPSC comme WA09, nous observons habituellementtumeurs dans les 6 semaines. Pour les lignes iPSC il n'est pas rare de voir des tumeurs au sein de 8-10 semaines. Il est très important d'injecter des souris avec une ligne qui est connue pour être pluripotentes, comme un contrôle positif, afin d'être sûr que la procédure a été effectuée correctement. Les tumeurs regardent habituellement très hétérogène et ont de nombreux kystes joint (Figure 1). L'analyse des échantillons de tumeurs par un pathologiste doit montrer des tissus différenciés de tous les trois feuillets embryonnaires (Figure 2).
Figure 1. Typique tératome HPSC dérivée dans la capsule du testicule.
En suivant le protocole décrit, un million de WA09 cellules ont été injectées dans la capsule du testicule d'une souris immunodéprimées. Six semaines plus tard, un tératome a été observée. A) Tératome tiré à partir de la souris. B) Gros plan image de la tératome. Notez les structures hétérogénéité et le kyste.
Figure 2. Hématoxyline éosine et les sections colorées de la tératome montrent les tissus de chaque couche de germe.
Après fixation, le tératome a été sectionnée et colorées à l'hématoxyline et l'éosine. Analyse par un pathologiste a révélé la présence de cellules provenant de chacune des 3 couches germinales.
Discussion
La méthode présentée ici offre une grande fiabilité, des moyens simples de générer des tératomes de hPSCs dans la capsule du testicule. Il ya plusieurs paramètres critiques de cette technique. En particulier, il est important d'injecter des lignées cellulaires HPSC qui sont connus pour être pluripotentes comme un contrôle. D'autres paramètres importants comprennent l'intervalle de temps entre l'injection et l'observation des tumeurs. Pour les lignées cellulaires comme WA09, tératomes devrait être observée dans 6-8 semaines. Pour les lignes iPSC nouvelles, nous constatons que souvent 10 semaines sont nécessaires. Une autre préoccupation est le nombre de cellules injectées. Nous injectons un million de cellules, mais le dosage peut se faire facilement avec moins de cellules. En outre, le milieu d'injection est important. Nous constatons que nous obtenons les meilleurs résultats lorsque les cellules sont injectées dans un mélange 1:1 de matrigel et DMEM/F-12, par opposition à PBS ou DMEM/F-12.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions du CIRM # TR-1250, RT1-01108, et CL1-00502.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
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