Summary
אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) יש פוטנציאל לטפל מספר עצום של מחלות שונות. השירות של תאים אלה הוא בכך שהם יכולים להתמיין לכל סוג תא בגוף. כאן אנו מתארים את assay תפלצת רוחנית, אשר משמש כדי להדגים את pluripotence של hPSCs.
Abstract
בתאי גזע pluripotent (PSCs) יש מאפיין ייחודי כי הם יכולים להתמיין לתאים מכל שלוש שכבות הנבט. זה גורם להם להיות כלי רב ערך פוטנציאלית לטיפול במחלות שונות. עם כניסתו של המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) ומחקר המשך בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש צורך מבחני זה יכול להוכיח כי קו מסוים הוא תא pluripotent. שידור germline כבר את תקן הזהב עבור הוכחת pluripotence של תא גזע עובריים בעכבר (המסקלין) שורות 1,2,3. שימוש assay זה, החוקרים יכולים להראות כי הקו המסקלין יכול לעשות את כל סוגי התאים בעובר כולל בתאי הנבט 4. עם הדור של האדם ESC קווים 5,6, assay המתאים להוכיח pluripotence של תאים אלה לא היה ברור מאז ESCs אדם לא יכול להיבחן לשידור germline. כתחליף, assay תפלצת רוחנית משמשת כיום להפגין pluripotency בתאי גזע האדם גזע pluripotent (hPSCs) 7,8,9. למרות assay זה הגיע לאחרונה תחת בדיקה וטכנולוגיות חדשות נבדקות באופן פעיל, assay תפלצת רוחנית הוא תקן הזהב הנוכחי 7. ב assay זה, התאים המדוברים מוזרקים לעכבר נפגעת מערכת החיסון. אם התאים pluripotent, תפלצת רוחנית בסופו של דבר לפתח קטעי הגידול יראה רקמות מכל 3 שכבות הנבט 10. ב assay תפלצת רוחנית, hPSCs יהיה ניתן להזריק לתוך אזורים שונים של העכבר. האתרים הנפוצים ביותר כוללים הזרקת testis הקפסולה, הקפסולה כליות, כבד, או את הרגל או מתחת לעור או לשריר 11. כאן אנו מתארים את פרוטוקול חזקים עבור הדור של teratomas מ hPSCs באמצעות הקפסולה testis כאתר של הגידול.
Protocol
הערה: כל הנהלים בעלי חיים חייב להיות מאושר על ידי IACUC או שווה ערך.
כל הציוד הכירורגי יש לעקר לפני הניתוח. כפפות סטריליות, וילונות גזה יש להשתמש.
1. הכנה לפני הניתוח
- להשיג 6 בן שבוע מ.א.ס. מאסכאלאס CbySmn.CB17-Prkdc SCID / י עכברים ממין זכר או זן immunocompromised השני של העכבר.
- לעקר את כל מכשירי ניתוח, כפפות, ו גזה.
- לנתק hPSCs להיות מוזרק עם accutase.
- ספירת תאים ו resuspend 1,000,000 תאים לכל μL 20-30 ב matrigel בדילול 01:01 ב DMEM/F-12. שמור על תאים על הקרח עד גמר.
- שים לב כי לעיתים קרובות כדאי לעשות ריצה דרך של ניסוי שבו Trypan כחול מוזרק. זה יעזור לזהות בעיות פוטנציאליות לפני כל התאים מבוזבז.
- ב ביבר, להרדים את העכבר בהתאם לנהלים המקובלים במוסד שלך. בניסויים שלנו, השתמשנו anesthesia מכונה עם isoflurane. העכברים הוכנסו בתחילה עם חמצן 1L/min ו 3-4% isoflurane בתא אינדוקציה. הרדים פעם, חרוט האף עם חמצן 1L/min ו 2-3% isoflurane היה בשימוש.
- לגלח את הבטן עם קוצץ, ולנקות את הקיר הקדמי של הבטן העכבר, החל ממרכז הבטן ועבודה עם כיוון השעון כלפי חוץ. הפתרון הראשון Povidone-יוד השימוש מכן לשטוף עם אתנול 70%. לחזור 3 פעמים, שינוי דגימות בכל פעם. להעביר את בעל החיים משטח חימום כדי לשמור על בעל החיים חם בתוך התרבות רקמות או מכסה המנוע לנתח.
- לעשות חתך אורכי 1 ס"מ דרך העור הצפק עם מספריים כירורגיות סטריליות ממש מתחת לרמה של הירך משותפת.
- תוך כדי לחיצה הצפק עם מלקחיים, להגיע לעבר הירך הימנית עם forcept אחר סטרילית ולשלוף את רקמת שומן לבן יחד עם האשכים המצורפים.
- מניחים את האשכים על גזה סטרילי.
- מלא טוברקולין או המילטון (1cc) מזרק Wiה hPSCs כדי להיות מוזרק. שים לב, זה רעיון טוב לכלול פס בקרה hPSC שאתה יודע שהוא pluripotent כגון WA09 (הידוע גם בשם H9). בדרך זו יש לך ביקורת חיובית שאפשר להשתמש בו כדי לקבוע אם הזריקה שלך או ניתוח היה פגום.
- לאט לאט להזריק את hPSCs (20-30 μL) למרכז הקפסולה testis הרחק מכל כלי הדם הגדולים, לעצור אם הקפסולה האשכים מתחיל להתנפח.
- להוציא את המחט לאט לאט כדי למנוע רפלוקס של התאים.
- באמצעות מלקחיים, להעביר את האשכים והגב רקמת שומן למקומו המקורי בבטן.
- לסגור את הצפק עם 2 או 3 תפרים reabsorbable ולסגור את העור עם autoclips.
- העכבר יש לשמור חם עד שהוא מתאושש וקיבל צורה כלשהי של כאבים (ראה מה שמקובל ביבר שלך) לאחר הניתוח פעמיים ביום במשך 1-2 ימים.
שים לב, לא הרדמה או משכך כאבים עם להפריע להתפתחות הגידול. - צג הדואר חיה על הגידול שבועות 6-12. לעתים נדירות ביותר, גידולים עשוי לגדול ל 5 מ"מ בגודל קודמות עד 6 שבועות לאחר ההזרקה, ולכן חשוב לעקוב אחר בעלי החיים. אם זה יקרה, בעלי החיים צריך להיות מורדמים וגידולים את עיבוד וניתוח כרגיל.
- לאחר הגידול הוא מוחשי ומגיעה בגודל 5 מ"מ בערך, להרדים את העכבר ולהקריב אותו על פי הנהלים המקובלים פרוטוקול של בעלי חיים.
- הסרה של הגידול המסמך בהתאם - גודל, מדד צילום, לשקול.
- גזור הגידול לחתיכות קטנות ולתקן בפתרון paraformaldehyde 4%. חנות paraformaldehyde 4% עד דגימות נשלחות פתולוג עבור מכתים, חתך וניתוח.
2. נציג תוצאות:
כאשר בפרוטוקול זה נעשה כפי שתואר לבין הקו התא שהוחדר הוא pluripotent, מוחשי, ברור מבחינה חזותית, הגידול צריך להקים בתוך 12 שבועות לכל היותר. עבור קווי hPSC שהוקמו כמו WA09, אנו בדרך כלל רואיםגידולים בתוך 6 שבועות. עבור קווי iPSC אין זה יוצא דופן לראות גידולים בתוך 8-10 שבועות. חשוב מאוד להכניס עכברים עם קו זה ידוע pluripotent, כביקורת חיובית, על מנת להיות בטוח כי ההליך בוצע בצורה נכונה. גידולים בדרך כלל נראים הטרוגנית מאוד ויש להם ציסטות מצורפים רבים (איור 1). ניתוח של דגימות הגידול על ידי פתולוג צריך להראות רקמות הבדיל מכל שלוש שכבות הנבט (איור 2).
באיור 1. אופיינית תפלצת רוחנית נגזר hPSC בכמוסה testis.
בעקבות הפרוטוקול המתואר, WA09 מיליון תאים הוזרקו הקפסולה testis של העכבר נפגעת מערכת החיסון. שישה שבועות לאחר מכן נצפתה תפלצת רוחנית. א) משך תפלצת רוחנית של העכבר. ב) תקריב תמונה של תפלצת רוחנית. הערה המבנים ואת ההטרוגניות ציסטה.
איור 2. Hematoxylin וחתכים Eosin מוכתמים מן תפלצת רוחנית להראות רקמות של כל שכבת נבט.
לאחר קיבוע, תפלצת רוחנית נותח ומוכתמים Hematoxylin ו Eosin. ניתוח על ידי פתולוג חשף את נוכחותם של תאים כל אחד 3 שכבות הנבט.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מספקת אמינה מאוד, באמצעים פשוטים של יצירת teratomas מ hPSCs הקפסולה testis. ישנם מספר פרמטרים קריטיים בטכניקה זו. בפרט, חשוב להזריק שורות תאים hPSC שידוע כי הם להיות pluripotent כביקורת. פרמטרים חשובים נוספים כוללים את מרווח הזמן בין הזרקה והתבוננות הגידול. על שורות תאים כמו WA09, teratomas צריך לשמור על 6-8 שבועות. על קווים חדשים iPSC אנו מוצאים כי לעתים קרובות 10 שבועות נדרשים. חשש נוסף הוא מספר התאים המוזרקים. אנחנו מזריקים מיליון תאים, אך assay יכול להיעשות בקלות עם פחות תאים. בנוסף, בינוני זריקה חשובה. אנו מוצאים כי אנחנו מקבלים את התוצאות הטובות ביותר כאשר התאים מוזרקים בתערובת 01:01 של matrigel ו DMEM/F-12, לעומת PBS או DMEM/F-12.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים CIRM # TR-1250, RT1-01108, ו CL1-00502.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-255 (1984).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).
- Downing, G. J., Battey, J. F. Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1145 (1998).
- Reubinoff, B. E. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (2000).
- Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).
- Brivanlou, A. H. Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells. Science. 300, 913-913 (2003).
- Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera. Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).
- Gertow, K. Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice. Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).
- Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).
