Summary
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) असंख्य विभिन्न रोगों के इलाज की क्षमता है. इन कोशिकाओं की उपयोगिता तथ्य यह है कि वे शरीर में किसी भी सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं में निहित है. यहाँ हम teratoma परख, जो लिए hPSCs की pluripotence का प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है का वर्णन.
Abstract
Pluripotent स्टेम सेल (PSCs) अद्वितीय विशेषता है कि वे सभी तीन परतों से रोगाणु कोशिकाओं में अंतर कर सकते है. यह उन्हें कई विभिन्न रोगों के उपचार के लिए एक संभावित महत्वपूर्ण उपकरण है. प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ जारी रखने के अनुसंधान के आगमन के साथ (hESCs) assays कि प्रदर्शित कर सकते हैं कि एक विशेष सेल लाइन है pluripotent है के लिए एक की जरूरत है. Germline प्रसारण माउस भ्रूणीय स्टेम सेल (mESC) लाइनों 1,2,3 की pluripotence प्रदर्शन के लिए स्वर्ण मानक कर दिया गया है. इस परख का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने दिखा सकते हैं कि एक mESC लाइन सहित भ्रूण रोगाणु 4 कोशिकाओं में सभी प्रकार की कोशिकाओं कर सकते हैं. मानव ईएससी 5,6 लाइनों की पीढ़ी के साथ, उपयुक्त परख के लिए इन कोशिकाओं की pluripotence साबित स्पष्ट नहीं था के बाद से मानव ESCs germline प्रसारण के लिए के परीक्षण नहीं किया जा सकता है. एक किराए के रूप में, teratoma परख वर्तमान pluripot प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैमानव pluripotent स्टेम सेल ency (hPSCs) के 7,8,9. हालांकि इस परख हाल ही में जांच के दायरे में आ गया है और नई प्रौद्योगिकियों को सक्रिय रूप से पता लगाया जा रहा है, teratoma परख वर्तमान सोने 7 मानक है. इस परख में, प्रश्न में कोशिकाओं को एक प्रतिरक्षा समझौता माउस में इंजेक्ट कर रहे हैं. यदि कोशिकाओं है pluripotent हैं, एक teratoma अंततः विकास और ट्यूमर के वर्गों के सभी तीन रोगाणु 10 परतों से ऊतकों को दिखा देंगे. Teratoma परख में, hPSCs के माउस के विभिन्न क्षेत्रों में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है. या पैर या तो subcutaneously या intramuscularly 11 में, सबसे आम इंजेक्शन साइटों वृषण कैप्सूल, गुर्दे कैप्सूल, जिगर में शामिल हैं. यहाँ हम ट्यूमर के विकास के लिए साइट के रूप में वृषण कैप्सूल का उपयोग hPSCs से teratomas की पीढ़ी के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं IACUC या समकक्ष द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.
सभी सर्जिकल उपकरण सर्जरी से पहले निष्फल चाहिए. बाँझ दस्ताने, पर्दे और धुंध इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
1. शल्य चिकित्सा के लिए पूर्व तैयारी
- 6 सप्ताह पुरानी मुसलमानों मस्कुलस CbySmn.CB17 Prkdc / SCID जम्मू है नर चूहों या माउस के अन्य प्रतिरक्षा तनाव प्राप्त करते हैं.
- सभी शल्य चिकित्सा उपकरण, दस्ताने, और धुंध जीवाणुरहित.
- को accutase इंजेक्शन के साथ किया जा hPSCs अलग कर देना.
- कोशिकाओं गिनती में 20-30 μL प्रति 1,000,000 कोशिकाओं resuspend Matrigel DMEM/F-12 में 01:01 पतला. बर्फ पर कोशिकाओं तक समाप्त रखें.
- ध्यान दें कि अक्सर यह प्रयोग है जहां Trypan ब्लू इंजेक्शन के माध्यम से एक रन के लिए उपयोगी है. इस से पहले किसी भी कोशिकाओं को बर्बाद कर रहे हैं किसी भी संभावित समस्याओं की पहचान में मदद करेगा.
- मछली पालने का बाड़ा में अपने संस्थान में स्वीकार किए जाते हैं प्रक्रियाओं के अनुसार अपने माउस असंवेदनता उत्पन्न करना. हमारे प्रयोगों में, हम एक anesth इस्तेमाल कियाesia isoflurane साथ मशीन. चूहे शुरू 1L/min ऑक्सीजन और isoflurane 3-4% से एक प्रेरण कक्ष में रखा गया. एक बार संवेदनाहृत, नाक शंकु 1L/min ऑक्सीजन और 2-3% isoflurane द्वारा इस्तेमाल किया गया था.
- कतरनी के साथ पेट में दाढ़ी है, और माउस पेट के पूर्वकाल दीवार को साफ करने के लिए, पेट के केंद्र से शुरू और दक्षिणावर्त जावक काम कर. पहले उपयोग के समाधान पॉवीडान - आयोडीन तो 70% इथेनॉल के साथ धो लो. 3 बार दोहराएँ, swabs हर समय बदल रहा है. पशु ऊतक संस्कृति या विदारक हुड के अंदर गर्म रखने के लिए एक हीटिंग पैड के लिए पशु स्थानांतरण.
- त्वचा और कूल्हे के स्तर के नीचे पेरिटोनियम बाँझ शल्य कैंची के साथ के माध्यम से 1 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा.
- हालांकि संदंश साथ पेरिटोनियम पकड़े, सही हिप ओर नीचे अन्य बाँझ forcept के साथ और बाहर तक पहुँचने के साथ संलग्न वृषण सफेद वसा ऊतकों को खींच.
- बाँझ धुंध पर testes रखें.
- Tuberculin या हैमिल्टन सिरिंज (1cc) के वाई भरेंवें hPSCs अंतःक्षिप्त किया जाना है. ध्यान दें कि यह एक अच्छा विचार के लिए एक नियंत्रण hPSC लाइन है कि आप जानते हैं कि WA09 (H9 के रूप में भी जाना जाता है) के रूप में pluripotent है शामिल है. इस तरह आप एक सकारात्मक नियंत्रण है जो आप के लिए तय है कि आपके इंजेक्शन या सर्जरी त्रुटिपूर्ण था का उपयोग कर सकते हैं.
- HPSCs (20-30 μL) धीरे धीरे वृषण कैप्सूल के केंद्र में किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं से दूर, इंजेक्षन रोक अगर वृषण कैप्सूल प्रफुल्लित करने के लिए शुरू होता है.
- कोशिकाओं के भाटा से बचने के सुई धीरे धीरे निकालें.
- संदंश का प्रयोग, पेट में अपनी मूल स्थिति के लिए वृषण और वसा ऊतकों वापस हस्तांतरण.
- 2 या 3 reabsorbable sutures के साथ पेरिटोनियम बंद करो और autoclips साथ त्वचा को बंद करें.
- माउस गर्म रखा जाना चाहिए जब तक यह ठीक नहीं है और सर्जरी के बाद एनाल्जेसिक के कुछ फार्म (देखें क्या आपके मछली पालने का बाड़ा में स्वीकार किया जाता है) 1-2 दिनों के लिए दो बार एक दिन दिया.
ध्यान दें कि न तो संवेदनाहारी और न ही साथ एनाल्जेसिक ट्यूमर के विकास के साथ हस्तक्षेप. - वें मॉनिटर6-12 सप्ताह के लिए ट्यूमर के विकास के लिए ई पशु. शायद ही कभी, ट्यूमर से पहले 6 सप्ताह के इंजेक्शन के बाद आकार में 5 मिमी लंबी हो सकती है, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है के लिए पशुओं की निगरानी. यदि ऐसा होता है, जानवरों और euthanized किया जाना चाहिए ट्यूमर संसाधित और सामान्य रूप से विश्लेषण किया है.
- एक बार ट्यूमर स्पष्ट है और आकार में लगभग 5mm तक पहुँचता है, माउस असंवेदनता उत्पन्न करना और यह स्वीकार किए जाते हैं पशु प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं के अनुसार बलिदान.
- ट्यूमर और तदनुसार दस्तावेज़ निकालें तस्वीर उपाय, आकार, वजन,.
- ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में काटें और 4% paraformaldehyde समाधान में तय है. नमूने तक 4% paraformaldehyde के में स्टोर सेक्शनिंग धुंधला हो जाना, और विश्लेषण के लिए एक रोगविज्ञानी के लिए भेजा जाता है.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
जब इस प्रोटोकॉल किया जाता है के रूप में वर्णित है और इंजेक्शन सेल लाइन है pluripotent है, एक स्पष्ट, नेत्रहीन स्पष्ट ट्यूमर, अधिक से अधिक 12 हफ्तों के भीतर फार्म चाहिए. WA09 तरह से स्थापित hPSC लाइनों के लिए, हम आम तौर पर देख6 सप्ताह के भीतर ट्यूमर. IPSC लाइनों के लिए यह असामान्य 8-10 सप्ताह के भीतर ट्यूमर को देखने नहीं है. यह बहुत महत्वपूर्ण है कि pluripotent हो जाता है एक पंक्ति के साथ चूहों को इंजेक्षन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, क्रम में करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया सही ढंग से किया गया था. ट्यूमर आमतौर पर बहुत विषम देखो और कई संलग्न अल्सर (चित्रा 1) है. एक पैथोलॉजिस्ट ने ट्यूमर के नमूनों के विश्लेषण तीनों जनन परतों (चित्रा 2) से विभेदित ऊतकों को दिखाना चाहिए.
चित्रा 1 ठेठ वृषण कैप्सूल में hPSC व्युत्पन्न teratoma.
वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, एक मिलियन WA09 कोशिकाओं एक प्रतिरक्षा समझौता माउस के वृषण कैप्सूल में अंतःक्षिप्त थे. छह हफ्ते बाद एक teratoma मनाया गया था. ए) टेराटोमा माउस से खींच लिया. बी) teratoma की तस्वीर बंद है. विविधता और पुटी संरचनाओं नोट.
चित्रा 2. Hematoxylin और teratoma से लाल भामसान रंग दाग वर्गों के प्रत्येक रोगाणु परत से ऊतकों बताते हैं.
निर्धारण के बाद, teratoma sectioned और Hematoxylin और लाल भामसान रंग के साथ सना हुआ था. एक रोगविज्ञानी द्वारा विश्लेषण 3 रोगाणु परतों के प्रत्येक से कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चला.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि वृषण कैप्सूल में hPSCs से teratomas पैदा करने के एक अत्यंत विश्वसनीय, सीधा मतलब है प्रदान करता है. इस तकनीक में कई महत्वपूर्ण मानकों हैं. विशेष रूप में, यह महत्वपूर्ण है कि एक नियंत्रण के रूप में है pluripotent हो जाना जाता है hPSC सेल लाइनों इंजेक्षन. अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर इंजेक्शन और ट्यूमर अवलोकन के बीच समय अंतराल शामिल हैं. WA09 तरह सेल लाइनों के लिए, teratomas 6-8 सप्ताह में मनाया जाना चाहिए. हम नई iPSC लाइनों के लिए लगता है कि अक्सर 10 सप्ताह की आवश्यकता है. एक और चिंता का विषय इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या है. हम एक मिलियन कोशिकाओं इंजेक्षन लेकिन परख आसानी से कम कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है. इसके अलावा, इंजेक्शन मध्यम महत्वपूर्ण है. हम पाते हैं कि हम सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त जब कोशिकाओं Matrigel और DMEM/F-12 की एक 1:1 मिश्रण में इंजेक्ट कर रहे हैं, के रूप में से पीबीएस या DMEM/F-12 करने के लिए विरोध किया.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम सीआईआरएम # TR-1250 अनुदान, RT1 - +०११०८, और CL1 00,502 द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
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