Summary
인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 다양한 질병을 치료하기 위해 무수히 많은 가능성이 있습니다. 이러한 세포의 유틸리티들은 신체의 모든 세포 유형으로 구별 수있다는 사실에있다. 여기 hPSCs의 pluripotence을 설명하는 데 사용됩니다 teratoma 분석을 설명합니다.
Abstract
Pluripotent 줄기 세포는 (PSCs)들은 세 배아 레이어의 세포로 구별 수있는 독특한 특성이 있습니다. 이것은 그들 여러 질병의 치료를 위해 잠재적으로 유용한 도구가 있습니다. 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)와 인간 배아 줄기 세포와 지속적인 연구의 출현과 함께 (hESCs) 특정 세포 라인 pluripotent임을 증명할 수있는 assays를위한 필요가있다. Germline 전송 마우스 배아의 줄기 세포 (mESC) 라인 1,2,3의 pluripotence를 시연을위한 황금 표준되었습니다. 이 분석 사용하여 연구자들은 mESC 라인이 배아 세포 네를 포함한 배아에있는 모든 세포 유형을 만들 수있다는 것을 보여줄 수있다. 인간 ESCs가 germline 전송에 대한 검사를받을 수 없기 때문에 인간의 ESC 라인 5,6의 생성을 통해 이러한 세포의 pluripotence 증명할 수있는 적절한 분석은 불분명했습니다. 대리로서 teratoma 분석은 현재 pluripot을 설명하는 데 사용됩니다인간 pluripotent 줄기 세포 ency (hPSCs) 7, 8, 9. 이 분석은 최근 주목 받고왔다하고 새로운 기술을 적극적으로 모색되고 있지만, teratoma 분석은 현재 금 본위 7입니다. 본 분석에서는 문제의 세포는 면역 손상 마우스에 주입된다. 세포 pluripotent 경우 teratoma 결국 개발되고 종양의 섹션은 3 개의 배아 층 10 일부터 조직을 보여줍니다. teratoma 분석에서는 hPSCs는 마우스의 다른 분야로 주입 할 수 있습니다. 또는 다리 중 subcutaneously 또는 intramuscularly 11로, 가장 일반적인 사출 사이트 testis 캡슐, 신장 캡슐, 간 등이 있습니다. 여기에서 우리는 종양 성장을위한 사이트로 testis 캡슐을 사용 hPSCs에서 기형종의 생성을위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
참고 : 모든 동물의 절차 IACUC 또는 동급의 승인을 받아야합니다.
모든 수술 장비는 수술 전에 소독을해야합니다. 멸균 장갑, 커튼과 거즈를 사용해야합니다.
1. 수술에 대한 사전 준비
- 6주 오래된 뮤스 Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J 수컷 마우스 또는 마우스의 다른 immunocompromised 긴장을 구합니다.
- 모든 수술 도구, 장갑, 그리고 거즈를 소독.
- accutase로 주입되는 hPSCs을 떼어 놓다.
- 세포를 세고 matrigel은 DMEM/F-12에서 1:1 희석에서 20-30 μL 당 1,000,000 세포를 resuspend. 완료하기 전까지 얼음 세포를 유지.
- 종종 Trypan 블루가 주입되는 실험을 통해 실행을 할 때 유용합니다. 이것은 모든 세포가 낭비되기 전에 잠재적인 문제를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.
- 동식물 사육장에서 해당 기관의 승인 절차에 따라 마우스를 마취. 우리의 실험에서, 우리는 anesth를 사용isoflurane과 esia 기계. 마우스는 처음 1L/min 산소와 3-4% isoflurane으로 유도 챔버에 넣어되었습니다. 일단 anesthetized, 1L/min 산소와 2-3% isoflurane과 코 콘이 사용되었습니다.
- 가위로 복부를 면도하고, 복부의 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 시계 방향으로 작동, 마우스 복부의 앞부분은 벽을 청소. 처음 사용할 때 Povidone-요오드 용액 후 70 % 에탄올로 씻는다. 면봉 때마다 변화, 3 번 반복합니다. 조직 배양 또는 해부 후드 내부 동물 보온하는 가열 패드로 동물을 전송합니다.
- 단지 공동 고관절의 수준 아래 무균 수술 가위로 피부와 복막을 통해 1cm 세로 절개를합니다.
- 집게와 함께 복막을 누른 상태에서 다른 멸균 forcept과 오른쪽 엉덩이쪽으로 내려 도달 첨부 testes와 함께 흰색 지방 조직을 당겨.
- 멸균 거즈에 testes를 놓습니다.
- 투베르쿨린 또는 해밀턴 (1cc) 주사기 WI를 채우hPSCs가 주입되는 전 ... 당신 같은 WA09 (또한 H9라고도 함)로 pluripotent 알고있는 컨트롤 hPSC 라인을 포함하는 것이 좋습니다합니다. 이렇게 당신은 당신의 주입이나 수술 결함 여부를 확인하는 데 사용할 수있는 긍정적인 제어할 수 있습니다.
- 천천히 고환 캡슐이 팽창하기 시작하면 중지, 주요 혈관에서 떨어져 testis 캡슐의 중심에 hPSCs (20-30 μL)을 주입.
- 세포의 역류를 방지하기 위해 천천히 주사 바늘을 제거합니다.
- 집게를 사용하여 복부를 원래 위치로 testes과 지방 조직을 다시 전송합니다.
- 2 ~ 3 reabsorbable 봉합과 복막을 닫고 autoclips으로 피부를 닫습니다.
- 그것이 복구로 1-2 일 동안 하루에 두 번 수술 후 진통제의 일부 형태 (귀하의 동식물 사육장에서 허용되는 참조) 주어진 때까지 마우스는 따뜻한 보관해야합니다.
로 마취도 진통도는 종양 발달을 방해합니다. - 일을 모니터링6-12 주 동안 종양의 성장을위한 전자 동물. 아주 드물게, 종양은 사전에 6주 주입 후의 크기가 5mm로 성장할 수 없습니다, 따라서 그것은 동물을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 경우 동물 euthanized과 종양 처리하고 정상적으로 분석되어야한다.
- 종양이 만져서 알 수있는이고 크기가 약 5mm 도달되면, 마우스를 마취 및 접수 동물 프로토콜 절차에 따라 그것을 희생.
- 이에 따라 종양 및 문서 제거 - 사진, 측정 크기, 무게.
- 작은 조각으로 종양을 잘라 4 % paraformaldehyde 용액에 고정시킨다. 샘플까지 4 % paraformaldehyde의 상점은 sectioning, 염색법 및 분석을 위해 병리학자로 전송됩니다.
2. 대표 검색 결과 :
이 프로토콜이 완료되면 같이 설명하고 주입 세포 라인 pluripotent이며, 만져서 알 수있는, 시각적으로 명백한, 종양이 가장 12 주 이내에 구성해야합니다. WA09 같은 설립 hPSC 라인을 위해, 우리는 일반적으로 볼 수육주 이내에 종양. iPSC 라인의 경우는 8-10주 내에 종양을보고 드문되지 않습니다. 그것은 절차가 올바르게 수행되었는지 확인하기 위해서는, 긍정적인 컨트롤로 pluripotent 것으로 알려져 라인 쥐 주입하는 것이 매우 중요합니다. 종양은 대개 매우 이질적인 모양과 많은 첨부된 cysts (그림 1)가. 병리학자에 의한 종양 샘플의 분석 세 배아 레이어 (그림 2)에서 차별화된 조직을 표시해야합니다.
그림 1. testis 캡슐의 일반 hPSC 파생 teratoma.
설명된 프로토콜에 따라 백만 WA09 세포 면역 훼손 마우스 testis 캡슐에 주입했다. 6 주 후 teratoma가 관찰되었다. ) Teratoma는 마우스에서 가져온. B) teratoma의 사진을 닫습니다. 이질과 낭종 구조를합니다.
그림 2. Hematoxylin과 Eosin teratoma의 스테인드 섹션은 각 세균 층의 조직을 보여줍니다.
고정 따라 teratoma은 Hematoxylin과 Eosin으로 sectioned 및 스테인드했습니다. 병리학자에 의한 분석 3 배아 레이어 각각의 세포의 존재를 공개했다.
Discussion
여기에 제시된 방법은 testis 캡슐에 hPSCs에서 기형 종을 발생시키는 매우 안정적이고 직접적인 수단을 제공합니다. 이 기법의 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. 특히, 그것은 통제와 같은 pluripotent 것으로 알려져 있습니다 hPSC 세포 라인을 주입하는 것이 중요합니다. 다른 중요한 파라미터는 분사와 종양 관찰 사이의 시간 간격이 포함됩니다. WA09 같은 세포 라인의 경우, 기형 종은 6~8주에서 관찰되어야한다. 새로운 iPSC 라인의 경우 우리는 자주 10주이 필요다는 것을 찾을 수 있습니다. 또 다른 우려는 주입된 세포의 숫자입니다. 우리가 백만 세포를 주입했지만 검정은 쉽게 적은 수의 세포로 할 수 있습니다. 또한, 사출 매체는 중요하다. 우리는 PBS 또는 DMEM/F-12 반대로 세포, matrigel과 DMEM/F-12의 1:1 혼합물에 주입 때 우리가 최상의 결과를 얻을 것을 발견했습니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 CIRM 보조금 # TR-1250, RT1-01108 및 CL1-00502에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
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