Summary
Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) обладают потенциалом для лечения множества различных заболеваний. Полезность этих клеток заключается в том, что они могут дифференцироваться в любой тип клеток в организме. Здесь мы описываем тератома анализа, которые используются для демонстрации pluripotence из hPSCs.
Abstract
Плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) имеют уникальные характеристики, что они могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков. Это делает их потенциально ценный инструмент для лечения различных заболеваний. С появлением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) и продолжение исследований с человеческими эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) необходимо для анализов, которые могут продемонстрировать, что определенная линия клеток плюрипотентные. Половые передачи был золотой стандарт для демонстрации pluripotence из мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) линии 1,2,3. С помощью этого анализа, исследователи могут показать, что мЭСК линия может сделать все типы клеток эмбриона в том числе половых клеток 4. При генерации линий ЭСК человека 5,6, соответствующего анализа, чтобы доказать pluripotence этих клеток было неясно, поскольку человеческие эмбриональные клетки не могут быть проверены на передачу зародышевой линии. Как суррогат, тератома анализа в настоящее время используется, чтобы продемонстрировать pluripotпрозрачность в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) 7,8,9. Хотя этот анализ в последнее время объектом пристального внимания и новые технологии осваиваются, тератома анализа является текущим золотой стандарт 7. В данном анализе клеток в вопросе вводят в иммунной угрозу мыши. Если плюрипотентные клетки, тератомы, в конечном счете разработать и участки опухоли покажет тканей все 3 зародышевых листков 10. В тератома анализа, hPSCs может быть введен в различных областях мыши. Наиболее распространенные места инъекции включают капсулы яичка, почечную капсулу, печени, или в ногу подкожно или внутримышечно 11. Здесь мы опишем надежный протокол для создания тератомы с использованием hPSCs яичка капсулы в качестве площадки для роста опухоли.
Protocol
Примечание: Все животные процедуры должны быть одобрены IACUC или эквивалент.
Все хирургические инструменты должны стерилизоваться перед операцией. Стерильные перчатки, марлевые шторы и должны быть использованы.
1. Подготовка перед операцией
- Получить 6-недельных Муз мышцы CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J самцов мышей или других иммунитетом мышах.
- Стерилизовать всех хирургических инструментов, перчаток и марлю.
- Диссоциируют hPSCs, который будет введен с accutase.
- Граф клеток и ресуспендируют 1000000 клеток на 20-30 мкл в матригелем разбавляют 1:1 в DMEM/F-12. Держите клеток на льду пока не закончено.
- Обратите внимание, что часто бывает полезно сделать пробегают эксперимента, где Голубой Трипан вводится. Это поможет определить любые потенциальные проблемы до того, как клетки впустую.
- В виварии, анестезию мыши в соответствии с принятыми процедурами в вашем учреждении. В наших экспериментах мы использовали AnesthОВОСС машины с ИФ. Мыши были изначально заложенных в камере с индукцией 1L/min кислорода и 3-4% в ИФ. После наркоза, носовой конус с 1L/min кислорода и 2-3% ИФ был использован.
- Бритье живота с ножницами, и очистить переднюю стенку брюшной полости мышей, начиная от центра живота и рабочих часовой стрелке наружу. Первое использование повидон-йод раствор затем вымыть с 70% этанола. Повторите 3 раза, меняя тампоны каждый раз. Передача животного грелку держать животное в теплой культуре ткани или рассечения капюшона.
- Сделать 1 см продольный разрез через кожу и брюшину с стерильные хирургические ножницы чуть ниже уровня тазобедренного сустава.
- Удерживая брюшины щипцами, спускаются к правому бедру с другой стерильной forcept и вытащить белую жировую ткань вместе с прикрепленными яичек.
- Поместите яички на стерильную марлю.
- Заполните туберкулин или Гамильтон (1cc) шприц шм hPSCs для инъекций. Обратите внимание, что это хорошая идея включить линию контроля HPSC, что вы знаете, такие, как плюрипотентные WA09 (также известный как H9). Таким образом, у вас есть положительный контроль, который можно использовать для определения вашего места инъекции или операции были допущены нарушения.
- Медленно введите hPSCs (20-30 мкл) в центр капсулы яичка вдали от крупных кровеносных сосудов, остановки, если яичек капсула начинает набухать.
- Вытащите иглу медленно, чтобы избежать рефлюкса клеток.
- Используя щипцы, передает яичек и жирной ткани обратно в исходное положение в области живота.
- Крупным планом брюшины с 2 или 3 reabsorbable швов и закрыть кожу autoclips.
- Мышь должна быть теплой, пока он восстанавливается и с учетом той или иной форме анальгетик (посмотрим, что будет принято в виварии) после операции два раза в день в течение 1-2 дней.
Заметим, что ни анестезии, ни обезболивающим с мешают развитию опухоли. - Монитор-йэлектронной животных для роста опухоли на 6-12 недель. Очень редко, опухоль может вырасти до 5 мм до 6 недель после инъекции, поэтому очень важно следить за животным. Если это произойдет, животные должны быть подвергнуты эвтаназии и опухолей обрабатывается и анализируется, как обычно.
- Как только опухоль ощутима и достигает примерно 5 мм в размерах, анестезию мыши и пожертвовать его в соответствии с принятыми процедурами животных протокола.
- Удаление опухоли и документов соответственно - фотографии, мера размер, вес.
- Вырезать опухоль на мелкие кусочки и зафиксировать в 4% параформальдегид решение. Хранить в 4% параформальдегида до образцы отправляются на патологоанатома для резки, окрашивания и анализа.
2. Представитель Результаты:
При этом протоколе делается, как описано, и вводили клетки линии плюрипотентных, ощутимое, визуально очевидно, опухоль должна стать в течение 12 недель, не больше. Для постоянных HPSC линий, как WA09, мы обычно видимопухоли в течение 6 недель. Для линий IPSC это не редкость увидеть опухоль в течение 8-10 недель. Очень важно для введения мышам линии, которая, как известно, плюрипотентные, в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что процедура была выполнена правильно. Опухоль обычно выглядят очень неоднородны и имеют много прилагается кисты (рис. 1). Анализ образцов опухоли на патологоанатом должен показать дифференцированных тканей из всех трех зародышевых листков (рис. 2).
Рисунок 1. Типичная HPSC полученных тератомы в капсуле яичка.
После описанного протокола, один миллион WA09 клетки вводили в яичках капсулы иммунодефицитом мыши. Шесть недель спустя тератома не наблюдалось. А) тератомы вытащил из мыши. Б) Закрыть картину тератомы. Обратите внимание на неоднородность и кисты структур.
Рисунок 2. Гематоксилином и эозином срезах, окрашенных в тератома показать тканей каждый росток слоя.
После фиксации, тератома была разрезана и окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ патолог показал наличие клетки от каждого из 3-х зародышевых листков.
Discussion
Метод, представленные здесь обеспечивает высокую надежность, просто средством создания тератомы из hPSCs в яичках капсулы. Есть несколько важных параметров, в этой технике. В частности, важно, чтобы придать HPSC клеточных линий, которые, как известно, плюрипотентные в качестве контроля. Другие важные параметры включают в себя интервал времени между введением и опухолевых наблюдения. Для клеточных линий, как WA09, тератомы следует соблюдать в течение 6-8 недель. Для новых линий IPSC мы находим, что нередко в 10 недель не требуется. Еще одной проблемой является количество клеток вводят. Мы вводить один миллион клеток, но анализ можно легко сделать с меньшим количеством клеток. Кроме того, введение среднего важно. Мы считаем, что мы получим лучшие результаты, когда клетки вводятся в смеси 1:1 матригелем и DMEM/F-12, в отличие от ФСБ или DMEM/F-12.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась CIRM гранты # TR-1250, RT1-01108, и CL1-00502.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-255 (1984).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).
- Downing, G. J., Battey, J. F. Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1145 (1998).
- Reubinoff, B. E. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (2000).
- Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).
- Brivanlou, A. H. Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells. Science. 300, 913-913 (2003).
- Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera. Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).
- Gertow, K. Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice. Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).
- Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).
