图案的使用生物倒装芯片的胚胎干细胞

Summary

我们证明一个简单的方法，放置在基板上的细胞所需的位置。这种方法模式翻转含有一个硅芯片与基板上的细胞充满微孔的细胞。这种方法提供了一种新的方式来调节细胞之间的可传播的juxtacrine信号。

Abstract

在许多生物过程，如肿瘤的生长，干细胞的分化，干细胞的自我更新和扩散信号的细胞 - 细胞接触（juxtacrine信令）组成的细胞间的相互作用是重要的。目前的一些方法存在调节体外细胞信号。扩散信号调制总额的方法之一，是细胞种植密度，在文化的不同而有所差异。由于细胞种植，结果在实际的细胞与细胞间的间距和细胞 - 细胞接触的数量相当大的变化，并不能规定当地环境的随机性质。一个调节细胞信号的更具体的方法是使用分子抑制剂或基因的方法，打倒特定的信号蛋白，但是这两种方法是最适合操纵小分子。在这里，我们展示了一种新的方法来调节细胞 - 细胞信号调制在所需的位置放置在基板上不同的细胞群的细胞当地环境。这种方法提供了一种互补的方式来控制细胞之间的信号的地方可扩散和juxtacrine。我们的方法使使用的生物覆晶（BFC），一个微型硅芯片，含有微孔，每个大小数百到数千持有一个单一的单元格或小的数字。我们只需加载吹打到井阵列和洗衣机关闭阵列卸载细胞与细胞的芯片。该芯片然后翻转到基板上，使细胞的水井和基板上掉下来，维护他们的图案。细胞附着后，芯片可以被删除（或左）。这种细胞图案的方法是独特之处在于：1）不改变基板的化学成分，从而使细胞的增殖和迁移; 2）允许到任何基材上的图案，包括组织培养聚苯乙烯，玻璃，基质胶，和甚至馈线细胞层和3）是与传统的微接触印刷兼容，使创建与这些岛屿内放置的细胞外基质的岛屿。在这段视频中，我们表现出的图案的鼠标到组织培养聚苯乙烯胚胎干细胞BFC。

Protocol

制作一个BFC

BFCs超过4个“四主晶圆成型聚二甲基硅氧烷（PDMS）是由。

使主晶片

1. 开始脱水硅片为30分钟，在130 ° C。
2. 晶圆放置在一个旋转涂布机，倒到晶圆SU8 - 2050（Microchem），坡道从3000-4000转300转/秒，以及30秒的旋转产生功能高度40-30毫米，分别。
3. 纺纱后，放置在65℃烤盘晶圆，立即提升温度至95 ° C为5-6分钟，然后斜下来到65 ° C。
4. 公开的晶圆到200兆焦耳/厘米^2，在接触使用暗视野面罩对准的紫外线剂量。
5. 将晶圆上65℃烤盘，立即提升温度至95 ° C为4-5分钟，然后斜下来到65 ° C。
6. 发展在PM醋酸和异丙醇晶圆。
7. Silanize晶圆为30分钟，使用六甲基二硅氧烷（信越MicroSi），或（Tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahydrooctyl）- 1 -三氯硅烷（t2492 -公斤，开普敦大学专科，布里斯托尔，PA），以防止PDMS从坚持“四主晶圆。

成型芯片

1. PDMS（道康宁，Sylgard 184）10:1的比例混合，倒在主硅晶圆每片晶圆（约15克），并让它一夜之间在室温下固化。
2. 剥离固化硅晶片上的PDMS和使用刀片切割出每个芯片。
3. 债券每个芯片的一个1x1厘米的切割，易于处理的显微镜幻灯片。

准备使用的BFC

1. 浸泡在PBS BFC过夜，以防止媒体在实验过程中吸收到的PDMS。
2. 干与Kimwipe（Kimtech科学）的芯片。
3. 将下降7.5％牛血清白蛋白（BSA），（〜200毫升）的BFC图案的表面，然后刮去，用枪头驱散BSA和删除任何气泡从水井。
4. BFC表面上保留至少0.5小时的牛血清白蛋白。理想的情况下搅拌BSA每15分钟，以防止结痂。
5. 为了适应在一个35x10毫米的TCPS菜BFC（猎鹰，35-3001），切一个TCPS盘中途轮辋上下，¾“长尾夹（欧迪办公）适合在菜RIM钳芯片菜一起。
6. 剪下从一个硅橡胶垫片板材垫片（框形外缘20'20毫米，15'15毫米内缘，厚度为250-500毫米）（硅特产）或任何其他硅，并将其应用的菜用小镊子。

图案与BFC细胞

1. 消毒1分钟的紫外线光下的菜，垫片，BSA的涂层芯片，和2个长尾夹。
2. 吸BSA和BFC用200 mL PBS冲洗两次。
3. 添加明胶削减TCPS菜，如果需要为您的细胞系。否则，湿与一些媒体的TCPS表面，然后将它应用到芯片（见下文）。这可防止气泡形成在会议厅内。
4. 吸气的PBS后，加入200 mL的细胞溶液（〜1 × ¹⁰ 6细胞/ mL）的BFC表面上。让细胞为5-10分钟解决。
5. 在〜15 °角倾斜的BFC一个角落，慢慢地用200毫升吸管吸管的细胞溶液。然后，将BFC单位，并添加100毫升的PBS或空白媒体到对面的BFC角落。以这种方式冲洗BFC一个额外的2-4倍，在必要时，清除所有细胞间以及区域。
6. 吸取200毫升到芯片表面的媒体。吸明胶/媒体的TCPS。然后反转预湿的菜和BFC起来，慢慢推入菜。
7. 应用粘结剂剪辑，两个腔两侧密封。从长尾夹取出金属耙子，使菜保持水平翻转过来。
8. 最后，快速翻转以上设置，同时避免任何不必要的移动，并放置在孵化器。

Discussion

虽然这里显示的协议和视频描述BFCs使用BFC ¹模式小鼠胚胎干细胞（mESCs），可用于几乎任何细胞类型的利益格局。唯一的变化可能需要改变大小的微孔。根据我们的经验，使用BFC的另一种类型的细胞，微孔直径和高度大于独立的单元直径10微米等于的单细胞模式效果最好。

BFCs也可以被使用到其他基板，包括其他细胞，格局细胞没有在协议中的重大变化。到现有的细胞层的图案是BFC方法比传统的细胞图案的方法，因为某些celltypes，包括mESCs和人类胚胎干细胞，需要支持或饲养层细胞，以保持他们在适当的表型文化的一个优势。

我们追求的BFC的一个应用是使用BFC来研究小鼠胚胎干细胞之间的信号。我们播种在不同的网格间距的正方形格子的单细胞，调节信号分子细胞交换的速度。通过较大的井（直径40微米），我们也可以收集在一个给定的的位置较大的数字（2-10）细胞，改变细胞密度在本地。此外，我们还可以放置在靠近对方的一些小水井，造成地方的细胞密度高，细胞不接触基板模式。在这种方式中，我们可以独立调节细胞之间的可传播的juxtacrine信号。在网格单元也使得它更容易跟踪数天的细胞。我们相信，缓解细胞图案与BFC将鼓励其他研究人员在他们的研究中使用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin