Summary
Мы демонстрируем простой метод для размещения клеток в нужное место на подложке. Этот метод модели клетки, щелкая силиконовых чипов содержащие лунки заполнены клеток на подложке. Этот метод обеспечивает новый способ модуляции диффузии и juxtacrine сигналов между клетками.
Abstract
Межклеточных взаимодействий, состоящий из диффундирующие сигнализации и межклеточных контактов (juxtacrine сигнализации) играют важную роль в многочисленных биологических процессов, таких как рост опухолей, дифференциация стволовых клеток и стволовых клеток самообновлению. Число методов в настоящее время существуют для модуляции клеточной сигнализации в пробирке. Один из методов модуляции общую сумму диффундирующие сигнализация варьировать плотность клеток во время посева культуры. Из-за случайного характера клеточных посева, это приводит к значительному изменению фактического межклеточных расстояние и количество межклеточных контактов и не может предписать местным условиям. Более конкретный подход для режима сигнализации ячейки использовать молекулярные ингибиторы или генетические подходы, чтобы сбить конкретных сигнальных белков, но оба эти методы лучше всего подходят для манипулирования небольшое количество молекул. Здесь мы демонстрируем новый подход к модуляции межклеточной сигнализации, который модулирует локального окружения кластера клеток путем размещения разного числа клеток в нужное место на подложке. Этот метод обеспечивает дополнительный способ управлять местной диффузии и juxtacrine сигналов между клетками. Наш метод позволяет использовать Био Flip Chip (BFC), microfabricated силиконовые чип, содержащий сотни до тысячи лунки, каждый размером провести ни одну ячейку или небольшого числа клеток. Мы загружаем чип с клетками, просто с помощью пипетки их на массиве скважин и стиральные выгружен клетки от массива. Чип затем перевернуть на подложку, в результате чего клетки выходят из колодцев и на подложку, поддерживая их кучность стрельбы. После клетки прилагается, чип может быть удален (или левой далее). Такой подход к ячейке кучность уникален тем, что: 1) не меняет химию подложки, тем самым позволяя клеткам размножаться и мигрировать, 2) позволяет структурирование на любую подложку, в том числе ткани культуры полистирола, стекла, Матригель, и даже фидерных слоев клеток, и 3) совместим с традиционной печати микроконтактной, позволяя создавать внеклеточной матрицы с острова клетки помещаются внутри этих островах. В этом видео, мы демонстрируем структурирование мышиных эмбриональных стволовых клеток на ткани культуры полистирола использованием BFC.
Protocol
Создание BFC
BFCs изготавливаются методом литья полидиметилсилоксан (PDMS) над 4 "пластин мастер Si.
Создание мастер пластин
- Начните с обезвоживания Si пластин в течение 30 мин при температуре 130 ° C.
- Место пластины на спин-для нанесения покрытий, залить SU8-2050 (Microchem) на пластины, рампа от 300 об / с до 3000-4000 оборотов в минуту, и спина в течение 30 с для получения функция высоты 40-30 мм, соответственно.
- После спиннинг, место пластины на 65 ° C плитой, немедленно нарастить температуре до 95 ° С в течение 5-6 мин, после чего рампу его до 65 ° C.
- Expose пластин для УФ дозы 200 мДж / см 2 на контакт Aligner использованием темного поля маски.
- Место пластины на 65 ° C плитой, немедленно нарастить температуре до 95 ° С в течение 4-5 мин, после чего рампу его до 65 ° C.
- Разработка пластин в ацетат ПМ и изопропанола.
- Silanize пластин в течение 30 мин с использованием гексаметилдисилоксан (Shin-Etsu MicroSi), или (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-трихлорсилана (t2492-KG, UCT Специальности, Бристоль, штат Пенсильвания), для предотвращения PDMS от придерживаясь пластины мастер Si.
Молдинг чипов
- Смешайте PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) в соотношении 10:1, залить его на пластину мастер Si (~ 15 г на пластину), и пусть это лекарство в течение ночи при комнатной температуре.
- Пил вылечить PDMS от пластины кремния и вырезали каждого чипов с помощью лезвия бритвы.
- Бонд каждый чип 1х1 см вырезать стекло микроскопа для легкой обработки.
Подготовка BFC для использования
- Замочите на ночь в BFC PBS, чтобы предотвратить поглощение медиа в PDMS в ходе эксперимента.
- Сухой чипов с Kimwipe (KIMTECH наук).
- Поместите каплю 7,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (~ 200 мл) на узорной поверхности BFC, а затем очистить его с пипетки, чтобы разогнать BSA и удалить все пузырьки из скважин.
- Оставьте на БСА BFC поверхности в течение по крайней мере 0,5 часа. В идеале агитировать BSA каждые 15 мин для предотвращения образования корки.
- Для установки BFC внутри 35x10 мм блюдо ТКТ (Falcon, 35-3001), вырезать ободах ТКТ на полпути блюдо вниз так, что ¾ "зажимы (Office Depot) будет соответствовать по краю блюда, чтобы зажать чип и блюдо вместе.
- Вырезать прокладку прокладка (рама формы с 20'20 мм внешнего края, 15'15 мм, внутренний край, и 250-500 мм толщиной) из листа PDMS (Продукты Силиконовые специальности) или любой другой силикон, и применить его на блюде с помощью пинцета.
Структурирование клеток с BFC
- Стерилизовать блюдо, прокладка, BSA покрытием чип и 2 клипа связующего под ультрафиолетовым светом в течение 1 минуты.
- Аспирируйте BSA и ополосните BFC в два раза с 200 мл PBS.
- Добавить желатин, чтобы блюдо ТКТ вырезать если это требуется для мобильного он-лайн. В противном случае, влажный ТКТ поверхность с некоторыми средствами массовой информации, прежде чем применить его к микросхеме (см. ниже). Это позволяет избежать пузырей в камере.
- После аспирационных PBS, пипеткой 200 мл клеточной решение (~ 1 × 10 6 клеток / мл) на BFC поверхности. Пусть клетки урегулировать в течение 5-10 мин.
- Tilt BFC в один из углов на угол ~ 15 ° и медленно пипетки клетка решение прочь с 200 мл пипетки. Затем поместите BFC плоские и добавить 100 мл ФСБ или пустой носитель в противоположный угол BFC. Промыть BFC таким образом дополнительные 2-4 раза, при необходимости, удалить все клетки межскважинном регионах.
- Внесите 200 мл среды на поверхности чипа. Аспирируйте желатина / СМИ от TCP. Инвертируйте предварительно смачивается блюдо и медленно толкать BFC вверх, в блюдо.
- Применение связующего клипа каждый, чтобы обе стороны камеры, чтобы запечатать его. Удалите металлические зубцы из зажимы так, чтобы блюдо остается уровень, когда перевернулся.
- Наконец, быстро переключаться установку как, избегая ненужных движений, и поместить его в инкубатор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя протокол и видео показано здесь описывать использованием BFC с 1 по шаблону мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), BFCs могут быть использованы для картины практически любой тип клеток, представляющих интерес. Единственное изменение, один, возможно, придется сделать это, чтобы изменить размер лунки. По нашему опыту, использовать BFC, чтобы скопировать отдельные клетки другого типа клеток, диаметр микролуночные и высотой, равной 10 мкм больше, чем одиноких диаметр ячейки работает лучше всего.
BFCs также может быть использована для картины клеток на другие субстраты, в том числе другие клетки, без значительных изменений в протокол. Структурирование на существующий слой клеток является одним преимуществом BFC подход по сравнению с традиционными подходами структурирование ячейки, поскольку некоторые celltypes, в том числе mESCs и человеческие эмбриональные клетки, нуждаются в поддержке или фидерных клеток для поддержания их надлежащего фенотипа в культуре.
Одно из применений BFC, что мы проводим это использовать BFC расследовать сигнализации между мышиных эмбриональных стволовых клеток. По посева отдельных клеток в квадратных решеток с различными интервалами сетку, мы модулировать скорость, с которой сигнальные молекулы обмениваются клетками. Делая большие скважин (с диаметром 40 микрон), мы также можем собирать большие числа (~ 2-10) клеток в данном месте, локально изменяя плотность клеток. Кроме того, мы можем разместить ряд мелких скважин в непосредственной близости друг от друга, в результате чего субстрат шаблон, в котором локальная плотность ячейки высокой клетками не находятся в контакте. В этой моды, мы можем самостоятельно модулировать диффузии и juxtacrine сигналов между клетками. Наличие клеток в сетке также делает его гораздо легче отслеживать клеток в течение нескольких дней. Мы считаем, что простота ячейки узоры с BFC будет поощрять других исследователей, использовать его в своих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант EB007278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
