Безлинзовой флуоресцентной микроскопии на чип

Summary

Безлинзовой на-чипе флуоресцентные платформы микроскопия показала, что может флуоресцентные изображения объектов на ультра-широкое поле сектор обзора, например,> 0.6-8 см2 с <4μm разрешение использования сжатие выборки на основе алгоритма декодирования. Такой компактный и широким полем флуоресцентные на-чипе изображения модальности может быть полезен для высокой пропускной цитометрии, редко-клеточной исследований и микрочипов-анализа.

Abstract

Встроенный в чип безлинзовой изображения в целом направлен на замену громоздкой линзы основе оптических микроскопов с более простой и компактный дизайн, особенно для высокой пропускной способности приложений скрининга. Это новая технология платформы есть потенциал, чтобы исключить необходимость в громоздких и / или дорогостоящих оптических компонентов, благодаря помощи новых теорий и алгоритмов цифровой реконструкции. В том же ключе, то здесь мы демонстрируем на-чипе флуоресцентного метода микроскопии, что можно добиться, например, <4μm пространственным разрешением на ультра-широкое поле сектор обзора (FOV) в> 0.6-8 см ² без использования каких-либо линзы , механического сканирования или тонкопленочные фильтры на основе интерференции. В этой технике, флуоресцентного возбуждения достигается через призму или полусферической-стекло освещенного некогерентного источника. После взаимодействия со всем объемом объекта, это возбуждение света отклоняется полного внутреннего отражения (ПВО) процесс, который происходит в нижней части образца микро-жидкостный чип. Флуоресцентного излучения из возбужденного объекты Затем собранные волоконно-оптической панелью или конические и поставляется на массив оптико-электронных датчиков, таких как зарядовой связью (ПЗС). Используя сжатие выборки основан алгоритм декодирования, приобретенные lensfree сырья флуоресцентные изображения образца может быть быстро обработаны для получения, например, <4μm разрешение в поле зрения> 0.6-8 см ^2. Более того, вертикально друг над другом микро-каналов, которые отделены друг от друга, например, 50-100 мкм, также могут быть успешно отображаемого с использованием тех же lensfree на-чипе микроскопии платформе, что еще больше увеличивает общую пропускную способность этого механизма. Этот компактный встроенный флуоресцентный платформы визуализации, с быстрым сжатие декодер за ней, может быть весьма ценной для высокой пропускной цитометрии, редко-клеточной исследований и микрочипов-анализа.

Protocol

В этом разделе мы рассмотрим экспериментальные методы нашей безлинзовой на-чипе флуоресцентного микроскопа платформы ^1-4. Чтобы продемонстрировать возможности этого метода, мы покажем на-чипе результатов визуализации для флуоресцентной микро-частиц и помечены белой клетки крови. Хотя здесь не обсуждается, то же самое lensfree флуоресцентного микроскопа платформа также может быть использована для изображения мелких животных, таких как модели трансгенных C. Элеганс образцов ^3.

1. Дизайн безлинзовой On-Chip изображений платформы

Наши безлинзовой на-чипе изображений платформа состоит из нескольких компонентов, включая оптический цифровой массив датчиков (например, ПЗС-матрицы), некогерентного источника освещения, призмы, поглощения фильтра, волоконно-оптической панелью или волоконно-оптический клин. Как показано на рис.1, эти компоненты собираются с микро-жидкостный устройств для достижения флуоресцентной визуализации большого объема образца на чипе, без использования каких-либо объективы, механическими сканерами или тонкопленочные фильтры на основе интерференции.

1. Цифровой массив датчиков: Наши безлинзовой конфигурации визуализации используется массив оптико-электронных датчиков для записи флуоресцентного излучения от мишени микрообъектов. В этой платформе, для обнаружения сигнала флуоресценции, различные типы датчиков-массивов могут быть использованы, например, ПЗС-матрицы (например, модели: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, всего от KODAK) и комплементарных металло-оксидных -полупроводник тепловизоры (CMOS, например, модель: MT9T031C12STCD, от Micron Technologies). Основные параметры, представляющие интерес для этих датчиков-массивов включают размер пикселя (например, 5,4 мкм, 9 мкм, 6,8 мкм и 3,2 мкм для KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 и MT9T031C12STCD, соответственно) и активной области изображения ( например, 2,4 ² см, 8 см ^2, 18 см ² и 32 мм ² для KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 и MT9T031C12STCD, соответственно). Для lensfree на-чипе обработки изображений, CCD датчики могут в целом предпочтительнее для достижения более высокой пропускной способности (более широкий активная область) и лучшую чувствительность, в то время КМОП датчики могут быть предпочтительнее для относительно дешевых и легких конструкций весом (например, для использования в полевых условиях).
2. Источники света: В нашей платформе, некогерентного источника света, например, простой светоизлучающих диодов (СИД, например, от Thorlabs, M455L2-C2 и LEDD1B), могут быть использованы для возбуждения флуоресценции. В экспериментальной установки показана на рис. 1, многомодовый волоконно-оптический кабель (Thorlabs, BFH37-1000) с 1 размер основного мм стыковой связан с светодиодного источника (без использования каких-либо линзы или связь оптики) и свет возбуждения затем доставляется объем пробы через выходное отверстие этого слоя. В этой системе, необходимый уровень мощности возбуждения флуоресценции должно быть около ~ 0,2-5 мВт поле зрения> 2-8 см ² на выходе из волокна освещения, однако светодиоды должны иметь возможность выхода ~ 5 мВт-1W уровнях мощности, как приклад связи подход значительно потерями, что снижает мощность возбуждения на выходе волокна. Чтобы добиться возбуждения различных красителей, различные светодиоды Цвет может быть мультиплексированы с использованием волоконно-оптического ответвителя.
   В дополнение к встроенной флуоресцентные изображения, голографические lensfree передачи изображений одного и того же образца могут быть получены с этой платформой, используя вертикальные источник освещения, как показано на рис. 2. В отличие от флуоресценции волокна возбуждения, для голографических захвата изображений, различных волоконно-оптического кабеля с меньшим размер ядра (например, ~ 50-400 мкм) прикладом сцепляться с другой светодиодный источник (Mightex, FCS-0625-000). Этот вертикальный свет освещения, после выхода из волоконно-конца, начинает приобретать частичной пространственной когерентностью по мере его распространения по отношению к образцу. Диаметр этого пространственно-когерентного области пропорционален расстоянию, которое свет проходит и обратно пропорциональна размеру выходной апертуры волокна. Пока эта пространственного диаметра согласованности на плоскости образца больше дифракционного размера каждого образца в плоскости сенсора, рассеянный свет от каждого объекта может точно мешать фоновый свет, создавая lensfree в линию голограмму образца. Эти приобретенные lensfree голограмм может быть быстро обработаны с использованием итерационного подхода фазы восстановления для восстановления передачи светлого поля изображение образца объемом ^5-7. Для этого голографического конце освещения, большей длиной волны светодиода (т.е. ~ 625-700 нм) выбирается с поглощением фильтры, которые используются для блокировки возбуждающего света высокой фильтров с типичными отсечка длины волн, например, 500-600 нм , что позволяет приобретение передачи в линию голограмм образцы без вопроса.
3. Другие оптические компоненты: в этом на-чипе флуоресцентного микроскопа платформы, два разных возбуждения методов фильтрации используются параллельно для создания требуемых темного поля фона, как показано на Рис.2. Во-первых, стеклянную призму (например, ЭдмундОптика, ромбовидной или голубя призмы) или стекла полушарии используется для создания полного внутреннего отражения (для возбуждения светом) на нижней поверхности микро-жидкостный чип, который размещается образцы интерес. Параллельно с этим, недорогой фильтр поглощения (например, от Roscolux) используется удалить слабо рассеянные возбуждения светом, который не подчиняется МДП процесса. После успешного отказа от возбуждения с помощью этих двух механизмов, только флуоресцентного свечения образцов приобретается в плоскости детектора. Отметим здесь, что некоторая доля испускаемого флуоресцентного сигнала также испытывает МДП в тот же интерфейс. Однако, это только ограничивает обнаружение числовой апертурой этой lensfree на-чипе подход изображений до ~ 1.0, так что только косые лучи над такой высокий уровень распознавания числовой апертуры остаются в ловушке в микро-чип, а остальные флуоресцентные лучи могут по-прежнему хит активная область датчика-массив для пробы его пикселей.
   Несмотря на такие большие обнаружения числовой апертурой, сырые пятна на флуоресцентных датчиков массив стать довольно широким (например, ~ 150-200 мкм), так как флуоресцентного свечения не направленный, и поэтому быстро расходится. Для инженера и лучше контролировать пространственное распространение этого флуоресцентного сигнала в нашей безлинзовой платформы, мы использовали плоский оптический компонент, т.е. волоконно-оптической лицевой панели (например, Эдмунд оптики, NT55-142), который помещен между объектом и Датчик самолетов. Волоконно-оптическая лицевая панель состоит из 2D массив волоконно-оптических кабелей, которые несут оптической информации интенсивности с одной стороны устройства к другому. Его основная функция в нашей lensfree на-чипе микроскопии настройка заключается в пару свободном пространстве режимов флуоресцентного излучения из объема образца в руководствоваться оптических волн, распространяющихся без пространственного распространения в пределах каждого слоя, который может частично сузить lensfree люминесцентные точки функции рассеяния (НПФ) между объектом и детектором самолетов. Это еще больше увеличивает наше отношение сигнал-шум (SNR), а также пространственное разрешение, которое может быть достигнуто с помощью нашей безлинзовой платформы.
   В качестве альтернативы регулярным лицевой панели, мы также можем использовать в наших на-чипе изображений платформы "коническая" волоконно-оптических лицевая панель которого имеет значительно большую плотность волоконно-оптических кабелей на ее вершине аспект по сравнению с нижней. Такая коническая передняя панель не только поможет нам в достижении лучшего PSF, но также можно ввести в увеличении нашей платформе (например,> 2-3х), которая в дальнейшем помогает нам улучшить наш безлинзовой разрешением до например, <4 мкм. Следует также отметить, что поле сектор обзора таких конический дизайн снижена не менее чем квадрат введен коэффициент увеличения по сравнению с регулярными лицевая панель визуализации основана система, которая может представлять собой снижение например, от ~ 8 см ² FOV изначально (CCD: KAI-11002) до <2 см ² с конусом.
   Наконец, следует также отметить, что использование волоконно-оптической панелью или конические искажает lensfree голограмм образца из-за различных оптических мод волоконно-оптических массив ^3. Хотя такие искаженные lensfree моделей на детекторе массив может быть полезно для некоторых приложений отношению цитометрии, для голографической реконструкции передачи изображений, волоконно-оптических массив (например, лицевая панель или конус) должна быть удалена из на-чипе сборки за счет несколько снижена пространственным разрешением в ³ флуоресцентные режиме.
4. Микро-жидкостный Чипы: микро-жидкостный чипов, которые используются в нашей платформы изготовлены с использованием PDMS (Полидиметилсилоксан) стен размещены на стеклах создания микро-каналов, которые необходимы для на-чипе изображений. Для изготовления этих микро-жидкостный каналам мы преследуем следующий рецепт:
   1. PDMS и В эластомеров равномерно смешивается и перемешивается с 1:10 соотношение объема.
   2. Как только это гетерогенный раствор выливают в чашку Петри, она лечится при 65 ° С в течение 2 часов.
   3. Использование X-Acto нож, требуемый размер и форму микро-жидкостный канал стене извлекается из чашки Петри.
   4. Устройства связи, затем достигается с помощью высокочастотной плазмы генератора (Electro-Technic продактс инк, BD-10aS), который должен предоставить обе крышки стеклах и PDMS связей области.
   5. После такой обработки плазмы, устройство помещается внутри духовке в течение ~ 40-50 минут при температуре 70 ° C по укреплению связей.
5. Ассамблеи и выравнивание безлинзовой на-чипе микроскопии платформы:
   Сборка процедур для наших lensfree на-чипе изображений платформа может быть подробным, как:
   1. Обложка стакан оптико-электронных датчиков массива удаляется.
   2. Использование вакуумных перо (Эдмунд оптики, NT57-636), фильтр тонкой очистки поглощения аккуратно размещены на верхней части активной области детектора.
   3. Волоконно-оптической панелью или конус расположен в верхней части этого поглощения FМСДЭНИ.
   4. Сфабрикованы микро-жидкостный чип затем непосредственно размещены на верхней части волоконно-оптической массива.
   5. Призму стекла или полушарии собирается выше микро-жидкостный чип с использованием индекса сопоставления нефти (Cargille, иммерсионного масла серии 300), что показатель преломления интерфейс сочетается с показателем преломления стекла.
   6. Волокна боковом освещении перемещается ближе к призме (или полушарии) и его угол регулируется, чтобы полного внутреннего отражения происходит на стекло-воздух соответствует нижней подложки микро-жидкостный чипа. Вертикального освещения (для передачи изображений lensfree) выравнивается быть перпендикулярна к детектору-массив, а сосредоточен на нужное поле сектор обзора.
   7. Боковые и вертикальные источников света последовательно включаться / выключаться, чтобы достигнуть и флуоресцентные изображения и светлого поля передачи изображений, используя тот же на-чипе платформы.
   8. Lensfree сырые изображения потом, приобретенный с помощью специально разработанных Labview интерфейс, с помощью компьютера (например, 3,2 ГГц процессор Intel Core).

2. Подготовка образцов

Мы использовали флуоресцентные микрошарики (например, Invitrogen, Fluospheres) для калибровки изображения нашей платформе, путем измерения его lensfree системы точка распространения-функции (НПФ). После этого начального измерения PSF будет сделано, различных клеток или мелких животных, модели (например, трансгенные C. Элеганс образцов) могут быть отображены с использованием тех же на-чипе платформы.

Начиная со следующего подраздела, мы предоставим более подробную информацию о наших шагов пробоподготовки.

1. Флуоресцентные микрошарики:
   1. Сырье флуоресцентного шарик решения в сочетании с водой Д. И. оптимизировать концентрацию образцов.
   2. ~ 10 мкл флуоресцентного шарик раствор смешивают с 40 мкл, 5 мл и 20 мл воды DI на 10 мкм, 4 мкм и 2 мкм в диаметре бисером, соответственно. Гетерогенных решений различных бус (например, не-люминесцентные и флуоресцентные) готовятся по мере необходимости, смешивая различные бусины решений друг с другом.
   3. Окончательное решение образец затем вводится в микро-жидкостный чип от боковых стен PDMS использованием острой иглой шприца (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Иглы, 14-826 серии)
2. Белые маркировки клеток крови:
   1. Объемом ~ 100 мкл цельной крови смешивается с ~ 1 мл эритроцитов лизирующего буфера (eBioscience).
   2. После инкубации в течение ~ 3 мин, лизировали решение кровь центрифугируют и слой осадок ресуспендируют в ~ 200 мкл PBS (фосфатно-солевым буфером).
   3. Чтобы пометить нуклеиновых кислот клеток с флуоресцентными красителями, 5 мкл 1 мМ SYTO 16 добавляется к 200 мкл ресуспендирования, после чего образец инкубировали в течение ~ 30 мин в темноте при комнатной температуре.
   4. Второй центрифугирования применяется к этому помечены образца, где супернатант удаляют снизить фоновый шум из-за флуоресцентного излучения от несвязанных красителей.
   5. Белые клетки крови гранул слой ресуспендировали в ФБР, которые затем могут быть переданы в микро-жидкостный чип для lensfree на-чипе флуоресцентного изображения (см., например, рисунок 7).

3. Цифровая обработка приобрел безлинзовой флуоресцентные изображения

В этом безлинзовой платформы визуализации, две разные алгоритмы используются для цифрового увеличения разрешающей способности системы, а именно Люси-Ричардсона деконволюции и сжатие выборки на основе декодирования. Благодаря использованию этих методов цифровой обработки, мы количественно увеличения разрешения, что может быть достигнуто с каждого подхода, решая плотно упакованных бусинка-пар (см. рис. 5-6). Реконструированы lensfree флуоресцентные изображения могут быть pseudocolored (по желанию), чтобы выделить естественный цвет микрообъектов, которые, безусловно, требует предварительных знаний о длине волны флуоресцентного сигнала, если цвет (например, RGB: красный-зеленый-синий CCD / CMOS) сенсор-чип используется. Для этих методов цифровой обработки, специально разработанные алгоритмы используются, которые требуют только CPU (например, 3,2 ГГц процессор Intel Core). Потенциально, в следующем поколении графических процессоров (GPU) может быть также использован для ускорения обработки. В дополнение к визуализации, при необходимости, расшифрованный люминесцентные объекты могут также автоматически учитывается использованием специально разработанные интерфейс (см. рис. 8) для на-чипе приложений цитометрии.

1. Измерение системы точка-функции рассеяния (НПФ):
   До какой-либо цифровой обработки для решения улучшения (такие, как деконволюции или сжимающих декодирование), некогерентного точки распространения функции на-чипе система должна быть оценена, которая может быть достигнута путем усреднения нескольких измеренных lensfree флуоресцентные моделей созданных изолированных небольших флуоресцентных бусин расположен на определенной высоте от датчика-чип. Этииндивидуальный люминесцентные образцы затем выравниваются по отношению к их центра масс координаты усредняются после соответствующей ^1,2 нормализации интенсивности. Это усредненная картина lensfree могут быть затем использованы в качестве флуоресцентных точки распространения функция нашего на-чипе микроскопом.
2. Люси-Ричардсона деконволюции ^1: Для цифрового улучшения пространственного разрешения нашу платформу, мы кормим сырой приобрел флуоресцентные изображения и измеряется некогерентного точки функции рассеяния в ускоренной Люси-Ричардсона ^8-10 алгоритма. Применяя теоремы Байеса, Люси-Ричардсона алгоритм использует измеренной точки функции рассеяния для итеративного уточнения максимального правдоподобия оценки флуоресценции распределения источника в плоскости объекта ^8,9. Итерационный процесс прекращается как правило, после нескольких сотен циклов до появления шума усиления для обеспечения минимального погрешность между прогнозируемой и измеренной lensfree люминесцентные образцы. Сходимости этого алгоритма деконволюции был также ускорен векторного метода экстраполяции, чтобы сократить время вычислений ^10. Чтобы дать представление: этот алгоритм обеспечивает эффективное пространственное разрешение ~ 20 мкм (с помощью CCD / CMOS-чипов с размером пикселя, например, ~ 9μm) и может deconvolve поле зрения ~ 8 см ² в течение нескольких десятков минут обычный компьютер, работающий под управлением Matlab ^1. Обратите внимание, что то же самое время вычислений падает до всего несколько секунд, например, ~ 1 мм ² FOV что сопоставимо с FOV типичного 10х объектив.
3. Сжатие выборки / зондирования основан разреженных декодирования сигнала ^2: Дальнейшее улучшение разрешения (вплоть до <4 мкм) ⁴ могут быть достигнуты с помощью сжатие зондирования / выборки алгоритмы декодирования ^11,12. Отбор проб на сжатие / зондирования обеспечивает недавно новые теоретические рамки ^13-15, который направлен на восстановление редких сигнал с гораздо меньшим количеством сэмплов, чем это требуется в соответствии с теоремы отсчетов. Хотя в целом, восстановление сигнала из-под-пробы измерений некорректной задачи, для определенного класса функций (а именно для разреженных функций), известные теоремы отсчетов и ее представление является основой недавно показали весьма неэффективно с точки зрения от числа измерений, которые необходимы, т. е. такой же редкий сигнал может вообще однозначно восстанавливается по очень мало по сравнению с образцами классической теории выборки.
   Безлинзовой флуоресцентные изображения, записанные нашими на-чипе микроскоп по своей сути удовлетворить важное требование при сжатии Расшифровка: Для приложений, которые представляют интерес для этой работы, таких как широкого поля флуоресцентные цитометрии, редкие анализа клеток и высокой пропускной микро-массивов изображений, флуоресцентных объектов, представляющих интерес может считаться уже редко. Поэтому, на наш безлинзовой флуоресцентного микроскопа, расшифровка распределения и относительные преимущества люминесцентные излучатели расположены в плоскости объекта могут быть смоделированы как крупномасштабные л _{1-Регуляризованные} задачи наименьших квадратов, которые могут быть решены с помощью, например, интерьер- точка метод ^2,12. Это задача оптимизации может быть математически выражена следующим образом:
   
   где | | и | | _к = (Σ _я ^н | и _я | ^{к) (1 / к)} и | | и | | _∞ = макс _я | и _я |. Таким образом, мы минимизируем л _{1-регуляризованных} L _2-нормы разности между записан / измеренный (у) и оценкам (Ах) lensfree изображений, где х и представляют собой источник распределения для декодирования и измерения матрице формируется с помощью экспериментальных PSF системы, соответственно. Мы также используем ограничение функции заставляя источником распространения на плоскости объекта должны быть неотрицательными. Этот повторяющийся процесс декодирования сжатие заканчивается, когда значение функции стоимости достигает предопределило значение допуска. Регуляризация (β) и терпимости параметры в целом функции разреженности объекта и измерения уровня шума, и оптимизированы в нашей системе до ~ βmax/10 и ~ 0,01, соответственно.
   На основании изложенных выше численная схема, сжатие декодирование сырых флуоресцентные изображения значительно улучшает способность нашей платформе по урегулированию редкие предметы и экспонаты скорость обработки сравнима с Люси-Ричардсона деконволюции ^2. В дополнение к визуализации одного слоя, флуоресцентный объектов, расположенных на разных глубинах может также декодировать и отделены друг от друга одновременно, запустив тот же алгоритм с использованием всех НПФ, соответствующие различным слоям глубины ^2.
4. Псевдоокрашивания: Пока не фундаментальное ограничение, представленных на чипе изображений платформы основном используется монохромный оптико-электронного себеnsor массивы, которые в целом обеспечивают лучшее отношение сигнал-шум для визуализации биологических образцов. Таким образом, сырье флуоресцентные изображения в оттенках серого приобрел формат, который не содержит реальной информации цвет образцов. Это может быть устранена с помощью цветной CCD / CMOS-чипы в нашей lensfree архитектуры визуализации, такие, что 3 цветовых канала (красный, зеленый и синий), приобретенных в каждом lensfree флуоресцентных измерений. С другой стороны, если маркировка характеристик излучения красителя, уже известны, необработанном формате оттенках серого флуоресцентные изображения монохромный датчик чипа и их расшифрованный / deconvoled версии также могут быть искусственно преобразуется в цвет изображения с помощью псевдоокрашивания алгоритм реализован в, например, MATLAB. Для этого приобрели черно-белые изображения могут быть расширены в 3-мерных данных кубов, где любой цвет интерес может быть синтезирован с помощью соответствующих весовых коэффициентов на каждую псевдо-канал данных куба. В результате этой обработки, монохромный lensfree флуоресцентные изображения могут быть преобразованы (по желанию) до многоканальных изображений, которые предоставляют информацию о цвете известно данного флуоресцентного объекта.
5. Автоматизированная флуоресцентные подсчета ячейки: Для цитометрии приложений, мы также разработали специально разработанный пользовательский интерфейс (см. рис 8.), Который может автоматически подсчитать флуоресцентных объектов / элементов на основе их lensfree изображений, полученных с нашими на-чипе микроскопии платформы. С этой задачей, первоначально мягкие порог применяется для необработанных изображений lensfree, чтобы сузить потенциальные места расположения флуоресцентных объектов. Затем, ряд функций (особенно regionprops) используются для измерения свойств изображения каждого субрегиона интерес, такие как положение, площадь, форму и интенсивность. Используя эти данные объекта, бинарные объекты делятся на подгруппы, такие как клетки, мертвых пикселей, а также пыль или фона автоматического флуоресценции. Как только окончательный результат функции regionprops фильтруется, чтобы показать только клетки интерес, длина результате структура массив может использоваться для получения клеток по всему поля зрения наших lensfree на-чипе тепловизор.

4. Представитель Результаты:

Обзор наших настройки показан на рисунке 1, при этом несколько оптических компонентов, которые используются в сборке. Ключевые особенности наших на-чипе микроскопии платформы объясняется на рисунке 2, в том числе люминесцентные возбуждения и регистрации, полное внутреннее отражение, а также частично-когерентного освещения для голографических изображений передачи на той же платформе. Безлинзовой флуоресцентные на-чипе визуализации результатов гетерогенной смеси, содержащие различные микрочастицы (4 мкм зеленых и 10 мкм зеленый / красный) показаны на рисунках 3-4. Сравнение Люси-Ричардсона деконволюции и сжатие выборки / декодирования зондирования основан предоставляется на рисунке 5 для цифровой повышения разрешения сырья безлинзовой флуоресцентные изображения. Сжатие декодирование включено пространственным разрешением (<4 мкм) количественно на рисунке 6. Безлинзовой на-чипе микроскопии флуоресцентно меченных лейкоцитов показано на рисунке 7, в котором также приводится сравнение снимков, сделанных с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Наконец, наши автоматизированные флуоресцентные интерфейс подсчета объектов показано на рисунке 8.

Рисунок 1. Обзор наших безлинзовой на-чипе визуализации настройки показан с различных оптических компонентов, которые используются в его сборки.

Рисунок 2. Схема на-чипе lensfree флуоресцентные платформы визуализации показано на рисунке (слева). Флуоресценция возбуждения достигается через боковую грань призмы ромбовидной использовании некогерентного источника. Экспериментальной установки нашего на-чипе флуоресцентные платформы визуализации также показано (справа). Всего образцов крови в течение микрожидкостных чипов (размеры: 2,5 х 3,5 х 0,3 см) возбуждался через призму интерфейс, в котором индекс, соответствующий нефти была использована для сборки микросхем и призмы. После отказа от возбуждения света МДП, и цветной фильтр, только флуоресцентного свечения из меченых клеток крови было зафиксировано нашими CCD-датчик чипа (KODAK 11002) по сравнению с FOV ~ 2,5 х 3,5 см.

Рисунок 3. Широкое поле безлинзовой флуоресцентные на-чипе изображений смеси, содержащей 4 мкм и 10 мкм зеленый флуоресцентный частиц показано на рисунке. Для сравнения, 10X изображения микрообъектива также предоставляются, которые хорошо согласуются с нашими безлинзовой флуоресцентные изображения.

Рисунок 4.

Рисунок 5. Сравнение производительности от Люси-Ричардсона (LR) деконволюции и сжатия выборки (CS) на основе алгоритмы декодирования обеспечивается, для работы с изображениями различных 10 мкм шарик-пар. Верхняя строка показывает безлинзовой сырья флуоресцентные изображения. Вставка изображений в верхнем ряду показать микроскоп сравнения те же частицы, которые получаются с использованием 10х объектив. Средний ряд демонстрирует наше сжатие результатов декодирования в то время как нижний ряд иллюстрирует Люси-Ричардсона результаты деконволюции. D, D _CS, и г _LR см. от центра до центра расстояния в микроскопе изображение, CS декодированных безлинзовой изображений и LR deconvolved безлинзовой изображения, соответственно.

Рисунок 6. Цифровая обработка безлинзовой флуоресцентные необработанных изображений иллюстрирует. Сжатие выборки основан алгоритм используется для достижения <4 мкм Пространственное разрешение путем разрешения плотно упакованных 2 мкм в диаметре шарик пар. Вставками также показывают, 40X объектива микроскопа сравнения, которые очень хорошо согласуются с декодированного флуоресцентные изображения. Здесь г относится к от центра до центра расстояния в микроскопе изображение, в то время как г _CS относится к от центра до центра расстояния в CS декодированных безлинзовой флуоресцентные изображения.

Рисунок 7. Безлинзовой изображений флуоресцентно (SYTO 16) помечены белыми клетками крови показано на рисунке. Сырые изображения lensfree быстро декодировались CS основана декодер, который очень хорошо согласуется с обычным микроскопом изображение одного и того же образца, полученные с 10х объектив.

Рисунок 8. Специально разработанных автоматизированных флуоресцентные интерфейс подсчета объект (в MATLAB) иллюстрируется.

Discussion

Мы показали на-чипе флуоресцентного микроскопа платформу, которая может достигать, например, <4μm пространственным разрешением более например,> 0.6-8 см ² поля-обзора, без использования каких-либо линзами, механическим сканированием или тонкопленочных помех фильтров. В этой технике, с использованием волоконно-оптической панелью или конические, люминесцентные излучения объектов, собранных с помощью 2D-массив волоконно-оптических кабелей до доставляются в оптико-электронных датчиков, таких как массив CCD / CMOS чипа. Эти приобретенные lensfree изображения затем быстро обрабатываются для получения <4μm разрешение на> 0.6-8 см ² поля-обзора использованием сжатия выборки / зондирования основан алгоритм декодирования. Такой компактный и широким полем флуоресцентные платформы визуализации может быть весьма полезным для высокой пропускной цитометрии, редко-клеточного исследования, а также для микрочипов-анализа.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184