Senza lenti microscopia a fluorescenza su un chip

Summary

Un senza lenti on-chip piattaforma microscopia a fluorescenza è dimostrato in grado di oggetti immagini fluorescenti su un ultra-ampio campo di vista di esempio,> 0,6-8 cm2 con <4 _m risoluzione utilizzando un campionamento di compressione basata algoritmo di decodifica. Tale compattezza e grande campo fluorescente on-chip modalità di imaging potrebbe essere prezioso per high-throughput citometria, rare cellule di ricerca e di analisi dei microarray.

Abstract

On-chip di imaging senza lenti, in generale, mira a sostituire ingombranti microscopi ottici con lenti a base di più semplice e più compatto design, soprattutto per le applicazioni high-throughput screening. Questa piattaforma tecnologia emergente ha il potenziale per eliminare la necessità di componenti ottici ingombranti e / o costose attraverso l'aiuto di nuove teorie e gli algoritmi di ricostruzione digitale. Sulla stessa linea, qui si dimostrano una modalità on-chip microscopia a fluorescenza che può raggiungere ad esempio, <4 _m risoluzione spaziale su un ultra-ampio campo di vista (FOV) di> 0,6-8 cm ² senza l'uso di lenti , meccanico-scansione o film sottile basati filtri interferenziali. In questa tecnica, eccitazione fluorescente è raggiunto attraverso una interfaccia prisma o emisferica di vetro illuminato da una sorgente incoerente. Dopo aver interagito con il volume intero oggetto, questa luce di eccitazione è respinta da total-interno-riflessione (TIR), processo che si sta verificando nella parte inferiore del chip campione di micro-fluidico. L'emissione di fluorescenza dagli oggetti eccitato è poi raccolto da una fibra ottica frontalino o una candela e viene consegnato a una matrice di sensori optoelettronici come un accoppiamento di carica-device (CCD). Utilizzando un algoritmo di compressione-campionamento basato decodifica, l'acquisito lensfree prime immagini fluorescenti del campione può essere rapidamente trattati per produrre ad esempio, <4 _m risoluzione su un campo visivo di> 0,6-8 cm ^2. Inoltre, impilati verticalmente micro-canali separati da esempio, 50-100 micron può essere ripreso con successo utilizzando le stesse lensfree on-chip piattaforma microscopia, che aumenta ulteriormente il throughput complessivo di questa modalità. Questa compatta on-chip piattaforma di imaging fluorescente, con un decoder rapida compressione dietro di esso, potrebbe essere piuttosto utile per high-throughput citometria, rare cellule di ricerca e di analisi dei microarray.

Protocol

In questa sezione passeremo in rassegna i metodi sperimentali della nostra senza lenti on-chip piattaforma di microscopia a fluorescenza ^1-4. Per dimostrare le capacità di questa tecnica, ci mostrerà i risultati on-chip di imaging per le micro-particelle fluorescenti ed etichettato globuli bianchi. Anche se non discusso qui, la stessa piattaforma lensfree microscopia a fluorescenza può essere utilizzato anche per gli animali modello immagine di piccole dimensioni come transgenici C. campioni elegans ^3.

1. Design del senza lenti On-Chip Platform Imaging

La nostra senza lenti on-chip piattaforma di imaging comprende diversi componenti ottici tra cui una serie di sensori digitali (ad esempio, un chip CCD), una fonte di illuminazione incoerente, un prisma, un filtro di assorbimento, a fibre ottiche frontalino o in fibra ottica cono. Come mostrato in Fig.1, questi componenti vengono assemblati con micro-fluidico dispositivi per ottenere immagini a fluorescenza di un volume ampio campione su un chip, senza l'uso di lenti, scanner meccanico o film sottile basati filtri interferenziali.

1. Sensore digitale Array: La nostra configurazione di imaging senza lenti utilizza una matrice di sensori optoelettronici per registrare l'emissione fluorescente da bersaglio micro-oggetti. In questa piattaforma, per il rilevamento del segnale di fluorescenza, diversi tipi di sensori, array possono essere utilizzati, come CCD (ad esempio, modelli: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, il tutto da Kodak) e Complementary Metal-Oxide -semiconduttore imager (CMOS, per esempio, Modello: MT9T031C12STCD, da Micron Technologies). Parametri chiave di interesse per questi sensori array includono la dimensione in pixel (ad esempio, 5.4 micron, 9 micron, 6,8 micron e 3,2 micron per il KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 e MT9T031C12STCD, rispettivamente) e l'area di imaging attiva ( ad esempio, 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² e 32 mm ² per KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 e MT9T031C12STCD, rispettivamente). Per lensfree on-chip di imaging, i sensori CCD può in generale essere preferito per raggiungere un throughput più elevato (più ampia area attiva) e una migliore sensibilità, mentre i sensori CMOS può essere preferito per i disegni di peso relativamente meno costosi e più leggeri (per esempio per l'uso sul campo).
2. Sorgenti: Nella nostra piattaforma, una sorgente di luce incoerente, ad esempio, un semplice diodo ad emissione luminosa (LED, per esempio, da Thorlabs, M455L2-C2 e LEDD1B), può essere utilizzato per l'eccitazione di fluorescenza. Nel set-up sperimentale mostrato in fig. 1, un multi-mode cavo in fibra ottica (Thorlabs, BFH37-1000) con 1 mm di diametro di base è testa a testa accoppiato ad una sorgente LED (senza l'uso di lenti ottiche o accoppiamento) e la luce di eccitazione viene poi consegnato al volume del campione attraverso l'apertura di uscita di questa fibra. In questo sistema, i livelli di potenza di eccitazione di fluorescenza dovrebbe essere di circa ~ 0,2-5 mW per un FOV di> 2-8 cm ² all'uscita della fibra di illuminazione, tuttavia, i LED dovrebbe essere in grado di emettere ~ 5mW-1W livelli di potenza come il testa a testa di accoppiamento approccio è notevolmente con perdita che diminuisce la potenza di eccitazione all'uscita della fibra. Per raggiungere l'eccitazione di coloranti diversi, i LED colore diverso può anche essere multiplex utilizzando un accoppiatore in fibra ottica.
   Oltre a on-chip di imaging fluorescente, lensfree immagini olografiche di trasmissione dello stesso campione può essere ottenuto anche con questa piattaforma utilizzando una fonte di illuminazione verticale come illustrato in figura. 2. A differenza delle fibre di eccitazione di fluorescenza, per l'acquisizione di un'immagine olografica, un altro cavo in fibra ottica con una dimensione nucleo più piccolo (ad esempio, ~ 50-400 micron) è culo accoppiato ad un'altra sorgente LED (Mightex, FCS-0625-000). Questa luce illuminazione verticale, dopo l'uscita della fibra-end, inizia ad acquisire parziale coerenza spaziale, come si propaga verso il campione. Il diametro di questa regione spazialmente coerenti è proporzionale alla distanza che la luce viaggia ed è inversamente proporzionale alla dimensione uscire apertura della fibra. Finché questo diametro coerenza spaziale sul piano del campione è più grande della dimensione di diffrazione di ciascun campione sul piano del sensore, la luce diffusa da ogni oggetto può fedelmente interferire con la luce di sfondo, creando un lensfree in linea ologramma del campione. Questi ologrammi acquisito lensfree possono poi essere rapidamente trattati con metodi iterativi fase di recupero di ricostruire un campo chiaro trasmissione delle immagini del volume del campione ^5-7. Per questo fine illuminazione olografico, una lunghezza d'onda del LED (ad esempio, ~ 625-700 nm) è stato selezionato in quanto i filtri di assorbimento, che sono utilizzati per bloccare la luce di eccitazione sono filtri passa-alto con il tipico taglio di lunghezze d'onda ad esempio, 500-600nm , che permette l'acquisizione di trasmissione in linea ologrammi dei campioni senza un problema.
3. Altri componenti ottici: In questa piattaforma on-chip microscopia a fluorescenza, due metodi diversi di eccitazione di filtraggio sono utilizzati in parallelo per creare il necessario campo scuro dello sfondo, come in Fig.2. In primo luogo, un prisma di vetro (ad esempio, EdmundOttica, romboidale o prismi colomba) o un bicchiere semi-sfera è usato per creare riflessione interna totale (per la luce di eccitazione) sulla superficie inferiore del micro-fluidico chip che ospita i campioni di interesse. In parallelo a questo, un filtro di assorbimento economico (ad esempio, da Roscolux) è utilizzato rimuovere la luce di eccitazione debolmente sparsi che non obbedisce il processo di TIR. Al rifiuto di successo dell'eccitazione utilizzando questi due meccanismi, solo l'emissione di fluorescenza dei campioni è acquisito sul piano del rivelatore. Si noti qui che una certa frazione del segnale emesso fluorescente esperienze anche TIR presso la stessa interfaccia. Tuttavia, questo limita solo l'apertura di rilevamento numerico di questo lensfree on-chip approccio di imaging a ~ 1.0, in modo che solo i raggi obliqui sopra una apertura di rilevamento numerico rimangono intrappolati all'interno del micro-chip, mentre il resto dei raggi fluorescenti può ancora ha colpito la zona attiva del sensore-array da campionare dai suoi pixel.
   Nonostante l'apertura di rilevamento di grandi dimensioni numeriche, le prime macchie fluorescenti al sensore-array diventano piuttosto ampia (ad esempio, ~ 150-200 micron), dal momento fluorescente di emissione non è direzionale e quindi in rapida diverge. Per progettare e controllare meglio la diffusione spaziale di questo segnale fluorescente nella nostra piattaforma senza lenti, abbiamo utilizzato un componente ottico planare, cioè una fibra ottica frontale (ad esempio, Edmund Optics, NT55-142), che si trova tra l'oggetto e la Sensore di aerei. Una fibra ottica frontalino è composto da una serie 2D di cavi in ​​fibra ottica che trasportano le informazioni ottiche intensità da un lato del dispositivo all'altro. La sua funzione principale nel nostro lensfree on-chip microscopia set-up è di accoppiare il libero spazio modalità di emissione fluorescente dal volume campione in ottica guidata onde che viaggiano senza diffusione spaziale all'interno di ogni fibra, che può in parte limitare il punto lensfree fluorescente -funzione di diffusione (PSF) tra l'oggetto e gli aerei rivelatore. Questo aumenta ulteriormente il nostro rapporto segnale-rumore (SNR), così come la risoluzione spaziale che può essere raggiunto utilizzando la nostra piattaforma senza lenti.
   In alternativa a un faceplate regolare, possiamo anche utilizzare nel nostro on-chip piattaforma di imaging una "conica" in fibra ottica frontale che ha una densità molto maggiore di cavi in ​​fibra ottica sul suo aspetto superiore rispetto a quello inferiore. Tale un faceplate conica non solo aiuta a raggiungere una migliore PSF, ma può anche introdurre ingrandimento nella nostra piattaforma (per esempio,> 2-3X) che ha ulteriormente ci aiutano a migliorare la nostra risoluzione senza lenti verso il basso, ad esempio, <4 micron. Dobbiamo anche notare che il campo di vista di un tale disegno affusolato è ridotta di almeno il quadrato del fattore di ingrandimento introdotto quando rispetto ad un normale sistema di imaging basato frontale, che può costituire una riduzione di esempio, da ~ 8 centimetri ² FOV inizialmente (CCD: KAI-11002) fino a <2 cm ² e il cono.
   Infine, dobbiamo anche notare che l'uso di una fibra ottica frontalino o un cono distorce gli ologrammi lensfree del campione a causa delle diverse modalità ottica della fibra ottica serie ^3. Mentre tali modelli distorti lensfree al rivelatore a serie può essere ancora utile per alcune applicazioni relazione citometria, per la ricostruzione olografica di immagini di trasmissione, la fibra ottica array (ad esempio, il frontalino o la conicità) deve essere rimosso dalla on-chip di assemblaggio al costo di poco ridotta risoluzione spaziale nelle ³ modalità fluorescente.
4. Micro-fluidico Chips: I micro-fluidico chip che vengono utilizzati nella nostra piattaforma sono fabbricati con PDMS (Polidimetilsilossano) pareti immessi sul vetrino creazione di micro-canali che sono necessari per on-chip di imaging. Per fabbricare questi micro-fluidico canali perseguiamo la seguente ricetta:
   1. PDMS A e B elastomeri sono uniformemente mescolati e mescolato con rapporto di volume 1:10.
   2. Una volta che questa soluzione eterogenea si riversa in una capsula di Petri, è curata a 65 ° C per 2 ore.
   3. L'utilizzo di un X-acto coltello, la dimensione necessaria e la forma della micro-fluidico canale muro viene estratto dal piastra di Petri.
   4. Il legame dispositivo è quindi realizzato usando ad alta frequenza, generatore di plasma (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), che deve esporre sia le diapositive vetro di copertura e la zona di incollaggio PDMS.
   5. Dopo questo trattamento al plasma, il dispositivo è inserito all'interno di un forno per ~ 40-50 minuti a 70 ° C per rafforzare il legame.
5. Assemblaggio e allineamento dei senza lenti on-chip piattaforma microscopia:
   Le procedure di assemblaggio per il nostro lensfree on-chip della piattaforma di imaging possono essere così dettagliate:
   1. Coperchio in vetro del sensore opto-elettronico-array viene rimosso.
   2. Usando una penna a vuoto (Edmund Optics, NT57-636), un filtro assorbimento sottile si posa delicatamente sulla parte superiore della zona attiva del rivelatore.
   3. Una fibra ottica frontalino o un cono è posizionato in cima a questa f assorbimentoilter.
   4. Il fabbricato micro-fluidico chip è poi direttamente posto sulla cima della fibra ottica array.
   5. Un prisma di vetro o di una semi-sfera è montato sopra il micro-fluidico di chip utilizzando un indice di abbinamento olio (Cargille, Olio di immersione serie 300) in modo che l'indice di rifrazione l'interfaccia è abbinato al indice di rifrazione del vetro.
   6. Illuminazione di fibra lato viene spostato più vicino al prisma (o il semi-sfera) e il suo angolo è adeguata per garantire che la riflessione interna totale-si verifica al vetro-aria corrispondente al substrato di fondo il micro-fluidico chip. L'illuminazione verticale (per lensfree trasmissione di immagini) e quella di essere perpendicolare al rivelatore-array ed è centrata ad una desiderata campo di vista.
   7. Laterale e verticale sorgenti di luce sono in sequenza acceso / spento per ottenere sia immagini fluorescenti e luminose campo dell'imaging trasmissione utilizzando lo stesso on-chip piattaforma.
   8. Lensfree prime immagini vengono poi acquisiti utilizzando una interfaccia personalizzata sviluppata Labview tramite PC (ad esempio, processore da 3,2 GHz, Intel Core).

2. Preparazione del campione

Abbiamo usato fluorescenti microsfere (ad esempio, Invitrogen, Fluospheres) per calibrare la nostra piattaforma di imaging, misurando il suo sistema lensfree point-spread-funzione (FPF). Dopo questa valutazione iniziale PSF è fatto, varie cellule o animali modello piccolo (ad esempio, campioni transgenici C. elegans) è possibile creare immagini utilizzando la stessa piattaforma on-chip.

A partire dal prossimo sotto-sezione, forniremo maggiori dettagli di passi campione nostra preparazione.

1. Fluorescenti micro-perle:
   1. Prime soluzioni fluorescenti tallone sono combinati con acqua deionizzata per ottimizzare la concentrazione dei campioni.
   2. ~ 10 ml di soluzione fluorescente perla è mescolato con 40 microlitri, 5 ml e 20 ml di acqua deionizzata per 10 micron, 4 micron di diametro e 2 perline micron, rispettivamente. Soluzioni eterogenee di perline varie (per esempio, non fluorescente e fluorescente) sono preparati in base alle esigenze mescolando diverse soluzioni tallone con l'altro.
   3. La soluzione campione finale viene poi iniettato nel micro-chip di fluidico dalle pareti laterali PDMS usando un ago affilato siringa (Fisher Scientific, BD Aghi PrecisionGlide, 14-826 Series)
2. Etichettatura delle cellule bianche del sangue:
   1. Un volume di circa 100 microlitri di sangue intero viene miscelato con ~ 1 ml di tampone di lisi delle cellule rosse del sangue (eBioscience).
   2. Dopo l'incubazione per ~ 3 min, la soluzione sangue lisato viene centrifugato e lo strato di pellet è risospeso in circa 200 ml di PBS (tampone fosfato salino).
   3. Per etichettare l'acido nucleico delle cellule con coloranti fluorescenza, 5 ml di 1 mM SYTO 16 è aggiunto il 200 microlitri di risospensione, dopo di che il campione è incubato per circa 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
   4. Centrifugazione secondo è applicato a questo esempio di etichetta, in cui il sopranatante viene rimosso per diminuire il rumore di fondo a causa di emissione fluorescente da coloranti non legati.
   5. Globuli bianchi pellet strato è risospeso in PBS che possono poi essere trasferiti ad un micro-chip per fluidico lensfree on-chip di imaging fluorescente (si veda ad esempio, Figura 7).

3. L'elaborazione digitale delle immagini acquisite senza lenti fluorescente

In questa piattaforma di imaging senza lenti, due diversi algoritmi sono utilizzati per aumentare digitalmente la risoluzione del sistema, cioè la Lucy-Richardson deconvoluzione e campionamento a compressione basata decodifica. Attraverso l'uso di questi metodi di elaborazione digitale, abbiamo quantificato il miglioramento della risoluzione che si possono ottenere con ogni approccio, risolvendo stipati bead-coppie (vedi fig. 5-6). Le immagini ricostruite lensfree fluorescenti possono essere pseudocolored (se necessario) per evidenziare il colore naturale dei micro-oggetti, che richiede sicuramente conoscenza preventiva della lunghezza d'onda del segnale fluorescente, a meno che un colore (per esempio, un RGB: rosso-verde-blu CCD / CMOS) sensore chip viene utilizzato. Per questi metodi di elaborazione digitale, su misura sviluppato algoritmi sono utilizzati che richiedono solo una CPU (ad esempio un processore da 3,2 GHz, Intel Core). Potenzialmente, di nuova generazione unità di elaborazione grafica (GPU) potrebbe anche essere utilizzato per una più rapida elaborazione. In aggiunta alle immagini, se necessario, gli oggetti fluorescenti decodificato può essere contato automaticamente utilizzando un interfaccia personalizzata sviluppata (vedi fig. 8) on-chip per applicazioni di citometria.

1. Misura del sistema Point-Spread Function (PSF):
   Prima di qualsiasi elaborazione digitale per la risoluzione di miglioramento (come deconvoluzione compressione o la decodifica), l'incoerente punto-funzione di diffusione del sistema on-chip ha bisogno di essere stimato, che può essere ottenuto facendo la media misurata diversi modelli lensfree fluorescente creato da isolati fluorescente piccoli perline trova ad una certa altezza dal sensore-chip. Questesingoli modelli fluorescenti sono poi allineati rispetto al loro centro di coordinate massa da media dopo ^1,2 appropriato normalizzazione intensità. Questo modello di media lensfree può essere quindi utilizzato come punto di fluorescenza diffusa funzione del nostro on-chip microscopio.
2. Lucy-Richardson deconvoluzione ^1: Per migliorare digitalmente la risoluzione spaziale della nostra piattaforma, nutriamo la prima immagine acquisita fluorescenti e il misurato incoerente punto-funzione di diffusione in un accelerato Lucy-Richardson ^8-10 algoritmo. Applicando il teorema di Bayes ', la Lucy-Richardson algoritmo utilizza il punto misurato diffusa funzione per raffinare iterativamente la stima di massima verosimiglianza della distribuzione dei sorgenti di fluorescenza sul piano oggetto di ^8,9. Il processo di iterazione termina in genere dopo poche centinaia di cicli prima della nascita di amplificazione del rumore per assicurare minimo errore quadratico medio tra la proiezione e il misurato modelli lensfree fluorescenti. La convergenza di questo algoritmo di deconvoluzione è stato accelerato da un metodo di estrapolazione vettoriale per abbreviare il tempo di calcolo ^10. Per dare un'idea: questo algoritmo fornisce una risoluzione effettiva spaziale di circa 20 micron (utilizzando un CCD / CMOS chip con una dimensione dei pixel di esempio, ~ 9μm) e può deconvolve un FOV di ~ 8 cm ² entro poche decine di minuti a un normale PC che esegue Matlab ^1. Si noti che il tempo di calcolo stesso scende a pochi secondi per esempio, ~ 1mm ² FOV che è paragonabile al FOV di un obiettivo tipico obiettivo 10X.
3. Compressione di campionamento / rilevamento basato sparse-decodifica del segnale ^2: miglioramento Ulteriori risoluzione (fino a <4 micron) ⁴ può essere ottenuto utilizzando compressione di rilevamento / campionamento basato algoritmi di decodifica ^11,12. Campionamento compressione / Sensing offre un quadro teorico ^13-15 recentemente emergente che mira a ricuperare un segnale di scarsa da campioni molto meno di ciò che è richiesto in base al teorema del campionamento. Mentre in genere, il recupero del segnale sotto-campionato misure è un problema mal posto, per una specifica classe di funzioni (in particolare per le funzioni sparse), il noto teorema del campionamento e la sua base rappresentazione è recentemente dimostrato di essere molto inefficiente in termini del numero di misure che sono necessarie, vale a dire, lo stesso segnale sparse in generale può essere univocamente recuperato da campioni molto pochi rispetto alla classica teoria del campionamento.
   Senza lenti immagini fluorescenti registrato dal nostro on-chip microscopio intrinsecamente soddisfare un requisito importante di compressione decodifica: Per le applicazioni che sono di interesse per questo lavoro, come il grande campo citometria a fluorescenza, l'analisi di cellule rare e high-throughput micro-array di imaging, oggetti fluorescenti di interesse può essere considerato già sparse. Pertanto, nel nostro microscopio senza lenti a fluorescenza, la decodifica della distribuzione e dei punti di forza relativa delle fonti di emissione fluorescente collocato nel piano oggetto può essere modellato come una grande l _{1-regolarizzati} Least Squares Problema che può essere risolto utilizzando ad esempio, un interno- punto di metodo ^2,12. Questo problema di ottimizzazione può essere matematicamente espressa come:
   
   dove | | u | | _k = (Σ _i ⁿ | u _i | ^{k) (1 / k)} e | | u | | _∞ = max _i | u _i |. Quindi, minimizzare l _1-2-l regolarizzati norma della differenza tra la registrazione / misurato (y) e la stima (Ax) immagini lensfree, dove x e A rappresentano la distribuzione dei sorgenti da decodificare e la matrice di misura formati usando il sperimentale PSF del sistema, rispettivamente. Usiamo anche una funzione di vincolo costringendo la distribuzione dei sorgenti sul piano oggetto che deve essere non negativo. Questo processo iterativo di decodifica compressione termina quando il valore della funzione di costo raggiunge un valore di tolleranza prefissato. Parametri di regolarizzazione (β) e la tolleranza sono le funzioni generali della scarsità oggetto e il livello di rumore di misura, e sono ottimizzati nel nostro sistema a ~ ~ βmax/10 e 0.01, rispettivamente.
   Sulla base del programma sopra delineato numerico, la decodifica di compressione delle materie prime immagini fluorescenti migliora notevolmente la capacità della nostra piattaforma per risolvere gli oggetti sparsi e presenta una velocità di elaborazione paragonabile a Lucy-Richardson deconvoluzione ^2. In aggiunta alle immagini un unico strato, gli oggetti fluorescente collocato a profondità diverse possono anche essere decodificato e separati gli uni dagli altri contemporaneamente eseguendo lo stesso algoritmo utilizzando tutte le PSF corrispondenti a diversi livelli di profondità ^2.
4. Pseudocoloring: Pur non essendo una limitazione fondamentale, ha presentato on-chip piattaforma di imaging impiega per lo più in bianco e nero opto-elettronico searray nsor che in generale fornire un migliore rapporto segnale-rumore per l'imaging di campioni biologici. Pertanto, le immagini raw fluorescenti vengono acquisite in scala di grigi formato, che non contiene le informazioni reali colori dei campioni. Questo potrebbe essere ridotto utilizzando colori CCD / CMOS chip nella nostra architettura di imaging lensfree tale che 3 canali dei colori (rosso, verde e blu) vengono acquisiti in ogni misurazione lensfree fluorescenti. D'altra parte, se le caratteristiche colorante emissione etichettatura sono già noti, formato raw in scala di grigi a fluorescenza di un monocromo sensore-chip e le loro versioni decodificato / deconvoled può anche essere artificialmente convertiti in immagini a colori utilizzando un algoritmo implementato in pseudocoloring ad esempio, MATLAB. A tal fine, le immagini acquisite in scala di grigi può essere ampliato in 3-dimensionale dei dati cubi, dove ogni colore di interesse possono essere sintetizzati utilizzando appropriati fattori di peso per ogni canale pseudo del cubo di dati. Come risultato di questa elaborazione, le immagini monocromatiche lensfree fluorescenti possono essere convertiti (se necessario) a multi-canale immagini che forniscono informazioni di colore conosciuto di un dato oggetto fluorescente.
5. Automatizzato conteggio delle cellule fluorescenti: Per le applicazioni di citometria, abbiamo anche sviluppato un design personalizzato dell'interfaccia utente (vedi Fig. 8.) Che possono contare automaticamente gli oggetti fluorescenti / celle in base al loro lensfree immagini acquisite con la nostra piattaforma on-chip microscopia. Verso questo compito, inizialmente una soglia morbido viene applicato prime immagini lensfree per restringere posizioni potenziale di oggetti fluorescenti. Poi, una serie di funzioni (soprattutto regionprops) sono utilizzati per misurare le proprietà dell'immagine di ogni sotto-regione di interesse, come la posizione, l'area, forma e intensità. Utilizzando questi dati oggetto, oggetti binari sono classificati in sottogruppi, come le cellule, pixel morti, così come automatica della polvere o fluorescenza di fondo. Una volta che il risultato finale della funzione regionprops viene filtrato per mostrare solo le cellule di interesse, la lunghezza della matrice struttura risultante può essere utilizzato per ottenere il numero di cellule nel corso del FOV intera del nostro lensfree on-chip imager.

4. Rappresentante dei risultati:

Una panoramica del nostro set-up è mostrato in Figura 1, con diversi componenti ottici che vengono utilizzati per la sua assemblea. Le caratteristiche principali della nostra piattaforma on-chip microscopia sono spiegate nella Figura 2, tra eccitazione fluorescente e la rilevazione, riflessione interna totale e illuminazione parzialmente coerente per la trasmissione di immagini olografiche sulla stessa piattaforma. Senza lenti fluorescente on-chip risultati di imaging di una miscela eterogenea contenente vari micro-particelle (4 micron e 10 micron verde verde / rosso) sono mostrati nelle Figure 3-4. Confronto di Lucy-Richardson deconvoluzione di campionamento e di compressione / decodifica di rilevamento basata viene fornita in Figura 5 per ritoccare digitalmente la risoluzione delle prime immagini senza lenti fluorescenti. Compressione decodifica abilitato risoluzione spaziale (<4 micron) è quantificato in Figura 6. Senza lenti on-chip di microscopia fluorescente globuli bianchi è illustrato in Figura 7, che fornisce anche le immagini di confronto prese con un microscopio a fluorescenza convenzionale. Infine, la nostra interfaccia di conteggio automatico fluorescente oggetto è mostrata in Figura 8.

Panoramica Figura 1. Dei nostri senza lenti on-chip di imaging set-up è indicato con diversi componenti ottici che vengono utilizzati per la sua assemblea.

Figura 2. Lo schema della piattaforma on-chip di imaging lensfree fluorescente viene mostrato (immagine a sinistra). Eccitazione di fluorescenza si ottiene attraverso l'aspetto laterale di un prisma romboidale utilizzando una sorgente incoerente. Il set-up sperimentale della nostra piattaforma on-chip di imaging fluorescente è anche mostrato (immagine a destra). Campione di sangue intero all'interno di un chip microfluidica (dimensioni: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) è stato eccitato attraverso l'interfaccia prisma, dove è stato utilizzato olio indice di corrispondenza per montare il chip e il prisma. Al rifiuto della luce di eccitazione da TIR e il filtro colore, solo l'emissione fluorescente dalle cellule del sangue etichettato è stato registrato dal nostro chip del sensore CCD (KODAK 11002) su un campo visivo di circa 2,5 x 3,5 cm.

Figura 3. Grandangolari senza lenti fluorescente su chip di imaging di una miscela contenente 4 micron e 10 micron di particelle verde fluorescente è illustrata. A scopo di confronto, 10X immagini obiettivo microscopio sono forniti anche, che in accordo con le nostre immagini senza lenti fluorescenti.

Figura 4.

Figura 5. Confronto delle prestazioni dei Lucy-Richardson (LR) deconvoluzione e campionamento compressione (CS) in base algoritmi di decodifica è previsto, per l'imaging di vari 10 micron bead-coppie. La riga superiore mostra le prime immagini senza lenti fluorescenti. Le immagini inserite nei riga in alto mostrano i confronti microscopio delle particelle stesse che vengono acquisiti utilizzando una lente 10X obiettivo. La fila centrale dimostra i nostri risultati compressione decodifica mentre la riga inferiore mostra la Lucy-Richardson risultati deconvoluzione. d, d _CS, e d _LR riferimento per il centro a centro distanze in immagini al microscopio, CS decodificato immagini senza lenti, e LR deconvolved immagini senza lenti, rispettivamente.

Figura 6. Elaborazione digitale di immagini fluorescenti senza lenti prima è illustrata. Un algoritmo di compressione di campionamento basato è utilizzato per ottenere <4 risoluzione spaziale micron, risolvendo stipati 2 coppie di diametro tallone micron. I riquadri mostrano anche 40X riscontri oggettivi microscopio, che concordano molto bene con le immagini decodificate fluorescente. D qui si riferisce al centro a centro distanze in immagini al microscopio, mentre d _CS si riferisce al centro a centro distanze nel decodificato CS immagini senza lenti fluorescenti.

Figura 7. Immagini senza lenti di fluorescenza (SYTO 16) etichettato cellule bianche del sangue è illustrata. Le immagini raw lensfree stanno rapidamente decodificato utilizzando un decoder basato CS, che concorda molto bene con una immagine al microscopio convenzionale dello stesso campione che si acquisisce con una lente obiettivo 10X.

Figura 8. Un design personalizzato automatico fluorescenti interfaccia conteggio oggetto (in MATLAB) è illustrato.

Discussion

Abbiamo dimostrato una piattaforma on-chip microscopia a fluorescenza che può raggiungere ad esempio, <4 _m risoluzione spaziale oltre ad esempio,> 0,6-8 cm ² di campo di vista, senza l'uso di lenti, meccanico-scansione o film sottile interferenze filtri. In questa tecnica, con l'utilizzo di una fibra ottica frontalino o un cono, l'emissione fluorescente dagli oggetti viene raccolta con un 2D-array di cavi in ​​fibra ottica prima di essere consegnato ad un sensore opto-elettronico-array come un CCD / chip CMOS. Queste immagini acquisite lensfree vengono poi rapidamente elaborati per produrre <risoluzione 4 _m oltre> 0,6-8 cm ² di campo di vista utilizzando un campionamento di compressione / rilevamento basato algoritmo di decodifica. Tale piattaforma compatta e grande campo di imaging fluorescente potrebbe essere molto utile per high-throughput citometria, rare cellule di ricerca così come per microarray-analisi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184