Summary
एक lensless पर चिप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी मंच का प्रदर्शन है कि उदाहरण के एक अति विस्तृत क्षेत्र के दृश्य पर छवि फ्लोरोसेंट वस्तुओं कर सकते हैं, 0.6-8> <4μm एक compressive आधारित नमूने decoding एल्गोरिथ्म का उपयोग कर संकल्प के साथ cm2. इस तरह के एक कॉम्पैक्ट और व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट इमेजिंग चिप पर साधन उच्च throughput cytometry, दुर्लभ सेल अनुसंधान और माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए मूल्यवान हो सकता है.
Abstract
पर चिप सामान्य में lensless इमेजिंग उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से सरल और अधिक कॉम्पैक्ट डिजाइन के साथ भारी लेंस आधारित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप, जगह करना है. यह उभरते प्रौद्योगिकी मंच उपन्यास सिद्धांतों और डिजिटल पुनर्निर्माण एल्गोरिदम की मदद के माध्यम से भारी और / या महँगा ऑप्टिकल घटकों के लिए आवश्यकता को समाप्त करने की क्षमता है. एक ही लाइनों के साथ, हम यहाँ पर एक चिप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी साधन है कि 0.6-8 2 सेमी <एक अल्ट्रा चौड़ा क्षेत्र के दृश्य (FOV) पर 4μm स्थानिक संकल्प> किसी भी लेंस के उपयोग के बिना उदाहरण के लिए, प्राप्त कर सकते हैं प्रदर्शन यांत्रिक स्कैनिंग या पतली फिल्म आधारित हस्तक्षेप फिल्टर. इस तकनीक में, फ्लोरोसेंट उत्तेजना एक चश्मे या अर्धगोल गिलास एक बेतुका स्रोत द्वारा प्रबुद्ध इंटरफ़ेस के माध्यम से हासिल की है. पूरे वस्तु की मात्रा के साथ बातचीत करने के बाद, इस उत्तेजना प्रकाश (TIR) कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रक्रिया है कि नमूना सूक्ष्म fluidic चिप के नीचे में होने वाली है द्वारा अस्वीकार कर दिया है. उत्साहित वस्तुओं से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन तो faceplate फाइबर ऑप्टिक या एक शंकु द्वारा एकत्र की है और एक optoelectronic एक प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) के रूप में संवेदक सरणी के लिए दिया है. एक compressive नमूने आधारित decoding एल्गोरिथ्म का उपयोग करके, नमूने के अधिग्रहण lensfree कच्चे फ्लोरोसेंट छवियों को तेजी से हो सकता है जैसे उपज संसाधित कर सकते हैं, के एक FOV पर 0.6-8 2 सेमी <संकल्प 4μm >. इसके अलावा, खड़ी खड़ी सूक्ष्म चैनलों कि उदाहरण के द्वारा अलग कर रहे हैं, 50-100 सुक्ष्ममापी भी सफलतापूर्वक वही lensfree पर चिप माइक्रोस्कोपी मंच, जो आगे इस साधन के समग्र throughput बढ़ जाती है का उपयोग कर सकते हैं imaged किया जा. इस कॉम्पैक्ट पर चिप फ्लोरोसेंट इमेजिंग मंच, इसके पीछे एक तेजी से compressive विकोडक के साथ, बल्कि उच्च throughput cytometry, दुर्लभ सेल अनुसंधान और माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए मूल्यवान हो सकता है.
Protocol
इस खंड में, हम हमारे lensless पर चिप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 1-4 मंच के प्रयोगात्मक विधियों की समीक्षा करेंगे. इस तकनीक की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट सूक्ष्म कणों और लेबल सफेद रक्त कोशिकाओं के लिए पर चिप इमेजिंग परिणाम दिखाई देंगे. हालांकि चर्चा यहाँ नहीं, एक ही lensfree फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी मंच भी छवि ट्रांसजेनिक सी. जैसे छोटे मॉडल पशुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस नमूने 3.
1. Lensless इमेजिंग चिप पर प्लेटफार्म के डिजाइन
हमारे lensless इमेजिंग पर चिप मंच एक डिजिटल सेंसर सरणी (जैसे, एक सीसीडी चिप), एक बेतुका रोशनी स्रोत, एक चश्मे, एक अवशोषण फिल्टर, एक फाइबर ऑप्टिक faceplate या एक फाइबर ऑप्टिक शंकु सहित कई ऑप्टिकल घटकों शामिल हैं. Fig.1 में दिखाया गया है, इन घटकों सूक्ष्म fluidic उपकरणों के साथ इकट्ठा कर रहे हैं एक चिप पर एक बड़ा नमूना मात्रा के फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्राप्त करने के किसी भी लेंस, यांत्रिक स्कैनर या पतली फिल्म आधारित हस्तक्षेप फिल्टर के उपयोग के बिना.
- डिजिटल सेंसर ऐरे: हमारे lensless इमेजिंग विन्यास एक optoelectronic सेंसर सूक्ष्म वस्तुओं के लक्ष्य से सरणी फ्लोरोसेंट उत्सर्जन रिकार्ड का इस्तेमाल. और पूरक धातु ऑक्साइड: इस मंच में, प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के के लिए सेंसर arrays के विभिन्न प्रकार (KAF-8300, काई +११००२, KAF-39,000, कोडक से सभी उदाहरण के लिए, मॉडल) CCDs जैसे, इस्तेमाल किया जा सकता है imagers अर्धचालक (MT9T031C12STCD माइक्रोन टेक्नोलॉजीज से, CMOS, उदाहरण के लिए, मॉडल). इन सेंसर arrays के लिए ब्याज की कुंजी पैरामीटर पिक्सेल आकार (उदाहरण के लिए, 5.4 सुक्ष्ममापी, 9 सुक्ष्ममापी, 6.8 KAF-८३०० के लिए और सुक्ष्ममापी 3.2 सुक्ष्ममापी, काई 11,002, KAF 39,000 MT9T031C12STCD और, क्रमशः) और सक्रिय इमेजिंग क्षेत्र शामिल हैं ( उदाहरण के लिए, 2.4 सेमी 2, 8 2 सेमी, 18 2 सेमी और 32 मिमी KAF-८,३०० के लिए 2, काई +११,००२, KAF 39,000 MT9T031C12STCD और, क्रमशः). Lensfree लिए इमेजिंग चिप पर, सीसीडी सेंसर सामान्य रूप में उच्च (व्यापक सक्रिय क्षेत्र) throughput और बेहतर संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए पसंद किया जा सकता है, जबकि CMOS सेंसर अपेक्षाकृत सस्ता है और हल्के वजन डिजाइन के लिए पसंद किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फ़ील्ड का उपयोग करने के लिए).
- हल्की स्रोत: हमारे मंच, एक बेतुका प्रकाश स्रोत, जैसे, एक साधारण प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी, उदाहरण के लिए, Thorlabs, M455L2 C2 और LEDD1B से), प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . प्रयोगात्मक में सेट अप छवि में दिखाया गया है. 1, 1 मिमी मूल आकार के साथ एक बहु मोड फाइबर ऑप्टिक केबल (Thorlabs, BFH37-1000) बट एक एलईडी (किसी भी लेंस या युग्मन प्रकाशिकी के उपयोग के बिना) स्रोत और उत्तेजना प्रकाश युग्मित है तो के लिए दिया जाता है इस फाइबर के निकास एपर्चर के माध्यम से नमूना मात्रा. इस प्रणाली में, प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए आवश्यक शक्ति स्तर ~> फाइबर की रोशनी बाहर निकलने पर 2-8 2 सेमी की एक FOV के लिए मेगावाट 0.2 5 के आसपास होना चाहिए, लेकिन, एल ई डी ~ उत्पादन 5mW-1W करने में सक्षम होना चाहिए बट युग्मन दृष्टिकोण के रूप में सत्ता के स्तर काफी हानिपूर्ण है जो फाइबर के उत्पादन में उत्तेजना की शक्ति कम हो जाती है है. विभिन्न रंगों की उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए, अलग अलग रंग के एल ई डी भी एक फाइबर ऑप्टिक युग्मक का उपयोग करके मल्टिप्लेक्स जा सकता है.
पर चिप फ्लोरोसेंट इमेजिंग के अलावा, एक ही नमूने के lensfree holographic ट्रांसमिशन छवियों छवि में सचित्र रूप में एक ऊर्ध्वाधर रोशनी स्रोत का उपयोग करके भी कर सकते हैं इस मंच के साथ प्राप्त किया जा. 2. प्रतिदीप्ति उत्तेजना फाइबर के विपरीत, holographic छवि अधिग्रहण के लिए, एक छोटे मूल आकार (जैसे, ~ 50-400 सुक्ष्ममापी) के साथ एक अलग फाइबर ऑप्टिक केबल एक और एलईडी स्रोत (Mightex, FCS-+०,६२५-000) के लिए मिलकर बट है. यह ऊर्ध्वाधर रोशनी प्रकाश, फाइबर के अंत में बाहर निकलने के बाद, आंशिक स्थानिक जुटना अधिग्रहण शुरू होता है के रूप में यह नमूना ओर propagates. इस spatially सुसंगत क्षेत्र के व्यास दूरी है कि प्रकाश यात्रा और inversely फाइबर के बाहर निकलें एपर्चर आकार के आनुपातिक है आनुपातिक है. के रूप में लंबे समय के रूप में नमूना विमान पर इस स्थानिक जुटना व्यास सेंसर विमान में विवर्तन प्रत्येक नमूने के आकार से बड़ा है, प्रत्येक वस्तु से बिखरे हुए प्रकाश ईमानदारी पृष्ठभूमि प्रकाश के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं एक नमूना की लाइन में होलोग्राम बनाने lensfree. इन अधिग्रहीत lensfree होलोग्राम तो तेजी चरण वसूली दृष्टिकोण चलने का नमूना मात्रा के एक संचरण छवि उज्ज्वल मैदान 5-7 के पुनर्निर्माण का उपयोग संसाधित किया जा सकता है . इस holographic रोशनी अंत के लिए, एक लंबी तरंग दैर्ध्य एलईडी (यानी, ~ 625-700 एनएम) के बाद अवशोषण फिल्टर है कि उत्तेजना प्रकाश ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता है उदाहरण के विशिष्ट काट - तरंग दैर्ध्य के साथ उच्च पास फिल्टर कर रहे हैं चयनित है, 500 600nm है, जो में लाइन के नमूनों की होलोग्राम संचरण के एक मुद्दे के बिना अधिग्रहण परमिट. - अन्य ऑप्टिकल घटकों: इस पर चिप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी मंच में, दो अलग अलग तरीकों फ़िल्टरिंग उत्तेजना समानांतर में इस्तेमाल किया जाता है के लिए आवश्यक पृष्ठभूमि काले क्षेत्र बनाने के रूप में Fig.2 में दिखाया गया है. सबसे पहले, एक गिलास चश्मे (उदाहरण के लिए, एडमंडप्रकाशिकी विषमकोण, या कबूतर prisms) या एक Hemi क्षेत्र कांच सूक्ष्म fluidic चिप जो ब्याज के नमूने मेजबान के नीचे सतह पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब (उत्तेजना प्रकाश के लिए) बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस के समांतर, एक सस्ती अवशोषण फिल्टर (जैसे Roscolux से) प्रयोग किया जाता है दुर्बलता से बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश कि TIR प्रक्रिया का पालन नहीं करता हटायें. इन दोनों तंत्र का उपयोग कर उत्तेजना का सफल अस्वीकृति पर, केवल नमूने के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन डिटेक्टर विमान में अधिग्रहण कर लिया है. यहाँ ध्यान दें कि उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत की एक निश्चित अंश भी एक ही इंटरफेस में TIR अनुभवों है. बहरहाल, यह केवल इस lensfree का पता लगाने के संख्यात्मक एपर्चर सीमा इमेजिंग 1.0 ~, दृष्टिकोण चिप पर ऐसी है कि केवल इस तरह के एक उच्च पता लगाने संख्यात्मक एपर्चर के ऊपर परोक्ष किरणों के माइक्रो चिप के भीतर फंसे रहते हुए फ्लोरोसेंट किरणों के बाकी अभी भी कर सकते हैं अपने पिक्सल द्वारा जांचा जा संवेदक सरणी के सक्रिय क्षेत्र मारा.
इतनी बड़ी पता लगाने संख्यात्मक एपर्चर के बावजूद, सेंसर सरणी में कच्चे फ्लोरोसेंट धब्बे काफी व्यापक है (उदाहरण के लिए, ~ 150-200 सुक्ष्ममापी) बन के बाद से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन दिशात्मक और तेजी से diverges इसलिए नहीं है. इंजीनियर और बेहतर हमारे lensless मंच में इस फ्लोरोसेंट संकेत के प्रसार स्थानिक नियंत्रण करने के लिए, हम एक planar ऑप्टिकल घटक, यानी, एक फाइबर ऑप्टिक (उदाहरण के लिए, एडमंड प्रकाशिकी, NT55 142) faceplate, कि वस्तु और के बीच रखा गया है का उपयोग किया सेंसर विमानों. एक फाइबर ऑप्टिक faceplate के फाइबर ऑप्टिक केबल है जो डिवाइस के एक पक्ष से दूसरे को ऑप्टिकल तीव्रता जानकारी ले जाने की एक 2d सरणी से बना है. हमारे lensfree में इसका मुख्य समारोह पर चिप माइक्रोस्कोपी निर्देशित ऑप्टिकल प्रत्येक फाइबर, जो आंशिक रूप से नीचे lensfree फ्लोरोसेंट बिंदु को संकीर्ण कर सकते हैं के भीतर स्थानिक फैल बिना यात्रा तरंगों में नमूना मात्रा से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन मुक्त अंतरिक्ष मोड जोड़े को सेट अप है प्रसार वस्तु डिटेक्टर और विमानों के बीच समारोह (पीएसएफ). यह आगे हमारे संकेत से शोर अनुपात (SNR) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानिक संकल्प है कि हमारे lensless मंच का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है बढ़ जाती है.
एक नियमित faceplate के लिए एक विकल्प के रूप में, हम भी हमारे इमेजिंग पर चिप मंच में एक "पतला" फाइबर ऑप्टिक जो faceplate के नीचे एक की तुलना में अपनी शीर्ष पहलू पर फाइबर ऑप्टिक केबल का एक काफी बड़ा घनत्व का उपयोग कर सकते हैं. इस तरह के एक पतला faceplate केवल हमें एक बेहतर पीएसएफ प्राप्त करने में मदद करता है, लेकिन यह भी हमारे मंच में बढ़ाई परिचय (जैसे,> 2-3X) आगे जो हमें नीचे हमारे lensless संकल्प उदाहरण के लिए, <4 सुक्ष्ममापी सुधार करने में मदद करता है सकते हैं. हम यह भी ध्यान दें चाहिए कि क्षेत्र के दृश्य के इस तरह के एक पतला डिजाइन की जब एक नियमित faceplate आधारित इमेजिंग प्रणाली है, जो जैसे की कमी का गठन कर सकते हैं की तुलना में कम से कम शुरू बढ़ाई कारक के वर्ग से कम है, से ~ 8 सेमी 2 शुरू FOV (सीसीडी: काई - +११,००२) <शंकु के साथ 2 2 सेमी नीचे.
अंत में, हम यह भी ध्यान रखें कि faceplate फाइबर ऑप्टिक या एक शंकु का उपयोग ऑप्टिक फाइबर सरणी के 3 विभिन्न ऑप्टिकल मोड की वजह से नमूने के lensfree होलोग्राम distorts चाहिए. जबकि डिटेक्तार सरणी में ऐसे विकृत lensfree पैटर्न अभी भी कुछ cytometry संबंध अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी किया जा सकता है संचरण छवियों, ऑप्टिक फाइबर सरणी (जैसे, faceplate या शंकु) के holographic पुनर्निर्माण के लिए, पर चिप विधानसभा से हटा दिया जाना चाहिए थोड़ा कम फ्लोरोसेंट मोड 3 में स्थानिक संकल्प की लागत पर. - माइक्रो चिप्स - fluidic: सूक्ष्म fluidic चिप्स है कि हमारे मंच में उपयोग किया जाता है PDMS (polydimethylsiloxane) कांच सूक्ष्म चैनलों पर चिप इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं बनाने स्लाइड्स पर रखा दीवारों का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं. इन सूक्ष्म fluidic चैनलों बनाना हम निम्नलिखित नुस्खा का पीछा:
- PDMS ए और बी elastomers समान और मिश्रित कर रहे हैं 1:10 मात्रा अनुपात के साथ उभारा.
- एक बार इस विषम समाधान एक पेट्री डिश में डाल दिया है, यह 65 ° 2 घंटे के लिए सी में ठीक हो जाता है.
- एक एक्स - acto चाकू का उपयोग करना, आवश्यक और सूक्ष्म fluidic चैनल दीवार के आकार और आकार पेट्री डिश से निकाला जाता है.
- डिवाइस संबंध तो एक उच्च आवृत्ति प्लाज्मा (इलेक्ट्रो - Technic उत्पाद इंक, BD-10AS) जनरेटर, जो दोनों कवर गिलास स्लाइड और PDMS संबंध क्षेत्र को बेनकाब करने की जरूरत है का उपयोग करके हासिल की है.
- इस प्लाज्मा उपचार के बाद, इस उपकरण में 70 डिग्री सेल्सियस संबंधों को मजबूत करने के लिए ~ 40-50 मिनट के लिए एक ओवन के अंदर रखा गया है.
- विधानसभा और lensless माइक्रोस्कोपी मंच पर चिप के संरेखण:
हमारे lensfree इमेजिंग पर चिप मंच के लिए विधानसभा प्रक्रियाओं के रूप में विस्तृत किया जा सकता है:- ऑप्टो इलेक्ट्रॉनिक सेंसर सरणी के गिलास को कवर हटा दिया है.
- एक वैक्यूम कलम (एडमंड प्रकाशिकी, NT57-636) का उपयोग करना, एक पतली अवशोषण फिल्टर धीरे डिटेक्टर सक्रिय क्षेत्र के शीर्ष पर रखा है.
- एक फाइबर ऑप्टिक faceplate या एक घटना इस अवशोषण च के शीर्ष पर तैनात हैilter.
- माइक्रो - fluidic गढ़े चिप तो सीधे ऑप्टिक फाइबर सरणी के शीर्ष पर रखा है.
- सूक्ष्म fluidic सूचकांक मिलान (Cargille, विसर्जन तेल 300 सीरीज) तेल ऐसी है कि अंतरफलक के अपवर्तक सूचकांक कांच अपवर्तक सूचकांक के लिए मिलान है का उपयोग कर चिप के ऊपर एक गिलास चश्मे या एक Hemi क्षेत्र इकट्ठा किया है.
- साइड रोशनी फाइबर चश्मे (या Hemi - क्षेत्र) के करीब ले जाया जाता है और अपने कोण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कुल आंतरिक प्रतिबिंब गिलास हवा इंटरफ़ेस सूक्ष्म fluidic चिप के नीचे सब्सट्रेट करने के लिए इसी पर होता निकाला जाता है. ऊर्ध्वाधर रोशनी (lensfree संचरण इमेजिंग के लिए) डिटेक्तार सरणी को सीधा करने के लिए गठबंधन किया है और एक वांछित क्षेत्र के दृश्य के लिए केंद्रित है.
- साइड और ऊर्ध्वाधर प्रकाश स्रोतों क्रमिक रूप पर / बंद कर रहे हैं करने के लिए दोनों फ्लोरोसेंट इमेजिंग और उज्ज्वल क्षेत्र संचरण एक ही मंच पर चिप का उपयोग इमेजिंग हासिल है.
- Lensfree कच्चे छवियों तो एक पीसी (जैसे, 3.2 गीगा प्रोसेसर, इंटेल कोर) के माध्यम से एक कस्टम विकसित Labview इंटरफ़ेस का उपयोग करने के लिए अर्जित कर रहे हैं.
2. नमूना तैयार
हम फ्लोरोसेंट सूक्ष्म मोती (जैसे, Invitrogen, Fluospheres) का इस्तेमाल अपने lensfree प्रणाली बिंदु फैल समारोह (पीएसएफ) को मापने के द्वारा हमारे इमेजिंग मंच, जांचना. इस प्रारंभिक पीएसएफ माप के बाद किया जाता है, विभिन्न कक्षों या छोटे मॉडल जानवरों (उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस नमूने) में एक ही मंच पर चिप का उपयोग imaged किया जा सकता है.
अगले उपधारा के साथ शुरू, हम हमारे नमूना तैयार चरणों के आगे विवरण प्रदान करेगा.
- प्रतिदीप्त माइक्रो - मोती:
- कच्चे फ्लोरोसेंट मनका समाधान डि पानी के नमूनों की एकाग्रता का अनुकूलन के साथ संयुक्त कर रहे हैं.
- ~ फ्लोरोसेंट मनका समाधान के 10 μL 40 μL, 5 एमएल, 10 सुक्ष्ममापी, 4 सुक्ष्ममापी और 2 सुक्ष्ममापी व्यास मोती, क्रमशः के लिए और डि पानी के 20 एमएल के साथ मिलाया जाता है. विभिन्न मोती (जैसे, गैर फ्लोरोसेंट और फ्लोरोसेंट) की विषम समाधान के रूप में एक दूसरे के साथ अलग मनका समाधान के मिश्रण से तैयार हैं की जरूरत है.
- अंतिम नमूना समाधान तो सूक्ष्म fluidic पक्ष PDMS दीवारों से चिप में अंतःक्षिप्त है एक तेज सिरिंज सुई (फिशर साइंटिफिक, बी.डी. PrecisionGlide सुई, 14-826 श्रृंखला) का उपयोग
- सफेद रक्त कोशिका लेबलिंग:
- ~ 100 μL पूरे रक्त का एक मात्रा ~ लाल रक्त कोशिका lysing बफर (eBioscience) के 1 एमएल के साथ मिलाया जाता है.
- ~ 3 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, lysed रक्त समाधान centrifuged है और गोली परत ~ पीबीएस 200 μL में resuspended है (फास्फेट खारा buffered).
- प्रतिदीप्ति रंजक के साथ कोशिकाओं के न्यूक्लिक एसिड लेबल, 1mm SYTO 16 के 5 μL resuspension के 200 μL जोड़ा जाता है, जिसके बाद नमूना ~ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए incubated है.
- दूसरा centrifuging इस लेबल नमूना करने के लिए लागू है, जहां सतह पर तैरनेवाला अनबाउंड रंगों से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के कारण पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए निकाल दिया जाता है.
- सफेद रक्त कोशिका गोली परत पीबीएस कि तब lensfree पर चिप फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक सूक्ष्म fluidic चिप को हस्तांतरित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 7 चित्रा देखें) में resuspended है.
3. अधिग्रहीत lensless फ्लोरोसेंट छवियों के डिजिटल प्रसंस्करण
इस lensless इमेजिंग मंच में, दो अलग अलग एल्गोरिदम करने के लिए डिजिटल प्रणाली का संकल्प, अर्थात् deconvolution लुसी - रिचर्डसन और compressive decoding आधारित नमूने में वृद्धि करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन डिजिटल प्रसंस्करण विधियों के उपयोग के माध्यम से, हम है कि प्रत्येक दृष्टिकोण के साथ पैक निकट मनका जोड़े को हल करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (अंजीर देख 5-6) संकल्प वृद्धि की मात्रा. खंगाला lensfree फ्लोरोसेंट छवियों तो (यदि वांछित) pseudocolored जा सकता है सूक्ष्म वस्तुओं की प्राकृतिक रंग है, जो निश्चित रूप से फ्लोरोसेंट संकेत तरंग दैर्ध्य के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता पर प्रकाश डाला, जब तक एक रंग (जैसे, एक RGB सीसीडी लाल हरे नीले / CMOS) सेंसर चिप का इस्तेमाल किया है. इन डिजिटल प्रसंस्करण विधियों के लिए, कस्टम विकसित एल्गोरिदम का उपयोग किया जाता है कि केवल एक CPU की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, एक 3.2 GHz प्रोसेसर, इंटेल कोर). संभावित, अगली पीढ़ी के ग्राफिक्स प्रसंस्करण इकाइयों (GPUs) भी तेजी से प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इमेजिंग के अलावा, अगर जरूरत है, डीकोड फ्लोरोसेंट वस्तुओं भी स्वतः पर चिप cytometry अनुप्रयोगों के लिए एक कस्टम विकसित इंटरफेस (चित्र देखें 8.) का उपयोग कर सकते हैं गिना जा.
- फंक्शन प्वाइंट - फैलाओ प्रणाली (PSF) के मापन:
संकल्प सुधार (जैसे deconvolution या compressive decoding) के लिए किसी भी डिजिटल प्रसंस्करण के लिए पहले, सिस्टम पर चिप बेतुका समारोह अनुमान लगाया जा बिंदु प्रसार की जरूरत है, जो कई मापा lensfree फ्लोरोसेंट पृथक छोटे फ्लोरोसेंट द्वारा बनाई गई पैटर्न के औसत से हासिल किया जा सकता है है सेंसर चिप से एक निश्चित ऊंचाई पर स्थित मोती. येव्यक्तिगत फ्लोरोसेंट पैटर्न तो जन निर्देशांक के अपने केंद्र के लिए सम्मान के लिए उचित तीव्रता सामान्य 1,2 के बाद औसत के साथ गठबंधन कर रहे हैं. यह औसतन lensfree पैटर्न तो हमारे पर चिप माइक्रोस्कोप के फ्लोरोसेंट बिंदु फैल समारोह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. - लुसी रिचर्डसन deconvolution 1: डिजिटल हमारे मंच के स्थानिक संकल्प में सुधार, हम एक त्वरित लुसी रिचर्डसन एल्गोरिथ्म 8-10 में कच्चे अधिग्रहीत फ्लोरोसेंट छवि और मापा बेतुका बिंदु फैल समारोह फ़ीड . Bayes प्रमेय को लागू करके, लुसी - रिचर्डसन एल्गोरिथ्म मापा समारोह बिंदु प्रसार का उपयोग करता है iteratively वस्तु 8,9 विमान पर प्रतिदीप्ति स्रोत वितरण का अनुमान अधिकतम संभावना को परिष्कृत. चलना प्रक्रिया आम तौर पर शोर प्रवर्धन के उद्भव से पहले कुछ सौ चक्र के बाद समाप्त होता है अनुमान और मापा lensfree फ्लोरोसेंट पैटर्न के बीच कम से कम वर्ग त्रुटि सुनिश्चित करने के लिए. इस deconvolution एल्गोरिथ्म के अभिसरण भी एक सदिश एक्सट्रपलेशन करने के लिए अभिकलन समय कम 10 विधि द्वारा त्वरित किया गया था. एक विचार दे करने के लिए: इस एल्गोरिथ्म ~ 20 सुक्ष्ममापी (जैसे, 9μm ~ के एक पिक्सेल आकार के साथ एक / सीसीडी CMOS चिप का उपयोग) का एक प्रभावी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है और पर एक मिनट के कुछ दसियों के भीतर ~ 8 2 सेमी की एक FOV deconvolve कर सकते हैं एक नियमित पीसी Matlab कि 1 चल रहा है. ध्यान दें कि जैसे एक ही गणना समय के लिए सिर्फ एक कुछ सेकंड के लिए चला जाता है, ~ 1mm 2 FOV जो एक ठेठ 10X उद्देश्य लेंस के FOV तुलनीय है.
- Compressive / नमूने आधारित विरल संकेत decoding 2 संवेदन: 4 compressive सेंसिंग का उपयोग / आधारित decoding एल्गोरिदम 11,12 नमूनाकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है इसके अलावा संकल्प (<4 सुक्ष्ममापी नीचे) सुधार . Compressive नमूनाकरण / सेंसिंग एक हाल ही में उभरते सैद्धांतिक 13-15 रूपरेखा है कि बहुत कम नमूनों से अधिक है कि नमूने प्रमेय के अनुसार करने के लिए आवश्यक है से एक विरल संकेत ठीक करना है प्रदान करता है. जबकि सामान्य में, कम नमूना माप से संकेत वसूली एक बीमार समस्या के समक्ष रखी है, कार्यों के एक विशिष्ट वर्ग (अर्थात् विरल कार्यों के लिए), नमूने प्रसिद्ध प्रमेय और अपने प्रतिनिधित्व के आधार के लिए हाल ही में काफी मामले में अक्षम होना दिखाया माप है कि आवश्यक हैं, यानी की संख्या के, एक ही विरल संकेत सामान्य रूप में विशिष्ट शास्त्रीय नमूना सिद्धांत की तुलना कर सकते हैं बहुत कुछ नमूनों से बरामद किया.
जैसे व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट cytometry, दुर्लभ सेल विश्लेषण और उच्च throughput इमेजिंग सूक्ष्म सरणी है कि इस काम करने के लिए ब्याज की हैं अनुप्रयोगों के लिए,,: Lensless फ्लोरोसेंट हमारे पर चिप माइक्रोस्कोप के द्वारा दर्ज की छवियों स्वाभाविक compressive Decoding का एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को संतुष्ट ब्याज की फ्लोरोसेंट वस्तुओं के पहले से ही विरल माना जा सकता है. इसलिए, हमारे lensless फ्लोरोसेंट खुर्दबीन में, वितरण और फ्लोरोसेंट वस्तु विमान पर स्थित emitters के रिश्तेदार ताकत के decoding एक बड़े पैमाने पर एक नियमित मैं कम से कम चौकों समस्या जो उदा का उपयोग कर हल किया जा सकता है के रूप में modeled किया जा सकता है, एक इंटीरियर बिंदु विधि 2,12. यह अनुकूलन समस्या गणितीय के रूप में व्यक्त किया जा सकता है:
जहां | यू | | कश्मीर = (Σ मैं पता | यू मैं | कश्मीर) | (1 / कश्मीर) और | | यू | | ∞ = अधिकतम मैं | यू मैं |. इसलिए, हम एक नियमित एल एल के बीच दर्ज / मापा (y) और अनुमानित (कुल्हाड़ी) lensfree छवियों, जहाँ x और एक स्रोत वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं डीकोड किया और माप मैट्रिक्स का उपयोग का गठन फर्क 2 - आदर्श कम से कम सिस्टम की प्रयोगात्मक क्रमशः पीएसएफ,. हम यह भी एक बाधा वस्तु विमान में स्रोत वितरण अऋणात्मक होने के लिए मजबूर समारोह का उपयोग करें. यह पुनरावृत्त compressive decoding प्रक्रिया समाप्त होता है जब लागत समारोह के मूल्य को एक पूर्व निर्धारित सहिष्णुता मूल्य के लिए पहुंचता है. (Β) नियमितीकरण और सहिष्णुता पैरामीटर वस्तु sparsity और माप शोर के स्तर के सामान्य कार्यों में कर रहे हैं, और हमारे βmax/10 ~ और ~ 0.01 प्रणाली, क्रमशः में अनुकूलित कर रहे हैं.
ऊपर उल्लिखित संख्यात्मक योजना, कच्चे फ्लोरोसेंट छवियों के compressive decoding के आधार पर बहुत हमारे मंच विरल वस्तुओं और प्रदर्शन के एक प्रसंस्करण लुसी - रिचर्डसन 2 deconvolution बराबर गति को हल करने की क्षमता में सुधार. एक परत इमेजिंग के अलावा, फ्लोरोसेंट अलग गहराई में स्थित वस्तुओं भी हो सकता है और डीकोड कर सकते हैं एक साथ एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग कर सभी विभिन्न गहराई परतों को इसी 2 PSFs चलाकर एक दूसरे से अलग. - Pseudocoloring: जबकि मौलिक सीमा नहीं है, पर चिप इमेजिंग मंच प्रस्तुत ज्यादातर मोनोक्रोम रोजगार ऑप्टो इलेक्ट्रॉनिक सेnsor सरणियों जो सामान्य में नमूना जैविक इमेजिंग के लिए बेहतर संकेत से शोर अनुपात प्रदान. इसलिए, कच्चे फ्लोरोसेंट छवियों स्वरूप है, जो नमूने के असली रंग जानकारी शामिल नहीं करता है ग्रेस्केल में अर्जित कर रहे हैं. यह हमारे lensfree इमेजिंग जैसे कि 3 रंग चैनल (लाल, हरे और नीले रंग) प्रत्येक lensfree फ्लोरोसेंट माप में अर्जित कर रहे हैं वास्तुकला में रंग सीसीडी / CMOS चिप्स का उपयोग करके कम किया जा सकता है. दूसरी ओर, अगर लेबलिंग डाई उत्सर्जन विशेषताओं पहले से ही जाना जाता है, कच्चा प्रारूप एक सेंसर चिप मोनोक्रोम और उनके डीकोड / deconvoled संस्करणों को भी कृत्रिम रंग छवियों का उपयोग कर एक pseudocoloring उदाहरण के लिए, MATLAB में कार्यान्वित एल्गोरिथ्म के लिए परिवर्तित किया जा सकता है फ्लोरोसेंट छवियों ग्रेस्केल. इस प्रयोजन के लिए, ग्रेस्केल अधिग्रहीत छवियों 3 आयामी डेटा cubes, जहां ब्याज की किसी भी रंग डेटा घन के प्रत्येक छद्म चैनल पर उचित वजन कारकों का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है में विस्तारित किया जा सकता है. इस प्रसंस्करण का एक परिणाम के के रूप में, मोनोक्रोम lensfree फ्लोरोसेंट छवियों मल्टी चैनल छवियों है कि ज्ञात एक दिया फ्लोरोसेंट वस्तु के रंग जानकारी प्रदान करने के लिए हो सकता है (यदि वांछित) परिवर्तित कर सकते हैं.
- स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल गिनती: cytometry अनुप्रयोगों के लिए, हम भी कस्टम डिजाइन एक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (चित्र देखें 8) स्वचालित रूप से उनके lensfree हमारे माइक्रोस्कोपी मंच पर चिप के साथ अधिग्रहीत छवियों पर आधारित फ्लोरोसेंट वस्तुओं / कोशिकाओं गिनती कर सकते हैं विकसित किया है. इस कार्य की ओर है, शुरू में एक नरम दहलीज कच्चे lensfree छवियों के लिए लागू किया जाता है फ्लोरोसेंट वस्तुओं की संभावित स्थानों के लिए नीचे संकीर्ण. फिर, कार्यों की एक श्रृंखला (विशेषकर regionprops) के लिए स्थिति, क्षेत्र, आकार और तीव्रता जैसे ब्याज की प्रत्येक उप - क्षेत्र की छवि गुण को मापने के लिए उपयोग किया जाता है. इन ऑब्जेक्ट डेटा का उपयोग करना, द्विआधारी वस्तुओं कोशिकाओं, मृत पिक्सल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से धूल या पृष्ठभूमि ऑटो प्रतिदीप्ति जैसे उपसमूहों में वर्गीकृत कर रहे हैं. एक बार regionprops समारोह के अंतिम परिणाम के लिए केवल ब्याज की कोशिकाओं को दिखाने के लिए फ़िल्टर किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप संरचना सरणी की लंबाई हमारे lensfree imager पर चिप के पूरे FOV पर कोशिका गिनती प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
हमारे सेट अप का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है, कई ऑप्टिकल घटकों है कि अपने विधानसभा में उपयोग किया जाता है के साथ. हमारे माइक्रोस्कोपी पर चिप मंच की मुख्य विशेषताएं चित्रा 2 में समझाया जाता है फ्लोरोसेंट और उत्तेजना का पता लगाने, कुल आंतरिक प्रतिबिंब के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक ही मंच पर holographic संचरण इमेजिंग के लिए आंशिक रूप से सुसंगत रोशनी सहित. Lensless फ्लोरोसेंट पर चिप एक विषम मिश्रण युक्त विभिन्न सूक्ष्म कणों (4 सुक्ष्ममापी हरी और 10 सुक्ष्ममापी हरी / लाल) के इमेजिंग परिणाम 3-4 आंकड़े में दिखाया गया है. लुसी रिचर्डसन deconvolution और नमूनाकरण / सेंसिंग आधारित decoding के compressive की तुलना चित्रा 5 में डिजिटल कच्चे lensless फ्लोरोसेंट छवियों के संकल्प को बढ़ाने के लिए प्रदान की जाती है . Compressive decoding सक्षम स्थानिक संकल्प (<4 सुक्ष्ममापी) चित्रा 6 में मात्रा निर्धारित है. Fluorescently लेबल सफेद रक्त कोशिकाओं की Lensless पर चिप माइक्रोस्कोपी 7 चित्रा, जो भी तुलना एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ लिया छवियों को प्रदान करता है में सचित्र है. अंत में, हमारी स्वचालित फ्लोरोसेंट वस्तु गिनती इंटरफ़ेस 8 चित्रा में दिखाया गया है.
हमारे lensless इमेजिंग पर चिप सेट अप के चित्रा 1. अवलोकन कई ऑप्टिकल घटकों है कि अपने विधानसभा में उपयोग किया जाता है के साथ दिखाया गया है.
चित्रा 2 पर चिप lensfree फ्लोरोसेंट इमेजिंग मंच के योजनाबद्ध आरेख (बाएं छवि) दिखाया गया है. प्रतिदीप्ति उत्तेजना एक विषमकोण एक बेतुका स्रोत का उपयोग कर चश्मे के पक्ष पहलू के माध्यम से हासिल की है. सेट अप हमारे पर चिप फ्लोरोसेंट इमेजिंग मंच के प्रयोगात्मक भी दिखाया गया है (सही छवि). एक microfluidic चिप (आयाम: 2.5 x 3.5 x 0.3 सेमी) के भीतर पूरे रक्त के नमूने चश्मे इंटरफेस है, जहां सूचकांक मिलान के तेल के लिए चिप और चश्मे को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के माध्यम से उत्साहित किया गया था. TIR द्वारा उत्तेजना प्रकाश और रंग फिल्टर की अस्वीकृति होने पर, केवल लेबल रक्त कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन ~ x 3.5 सेमी 2.5 के एक FOV पर हमारे सीसीडी सेंसर चिप (11,002 कोडक) द्वारा दर्ज किया गया था.
चित्रा 3 वाइड क्षेत्र lensless 4 सुक्ष्ममापी और 10 सुक्ष्ममापी हरी फ्लोरोसेंट कणों से युक्त मिश्रण का फ्लोरोसेंट इमेजिंग चिप पर सचित्र है . तुलना प्रयोजनों के लिए, 10X खुर्दबीन उद्देश्य छवियों भी प्रदान की जाती हैं जो हमारे lensless फ्लोरोसेंट छवियों के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं.
चित्रा 4.
चित्रा 5 लुसी रिचर्डसन (एलआर) deconvolution और decoding एल्गोरिदम आधारित compressive (सीएस) नमूने के प्रदर्शन की तुलना, विभिन्न 10 सुक्ष्ममापी मनका जोड़े की इमेजिंग के लिए प्रदान की जाती है. शीर्ष पंक्ति lensless कच्चे फ्लोरोसेंट छवियों को दिखाता है. शीर्ष पंक्ति में छवियों बैठाना ही कणों कि एक 10X उद्देश्य लेंस का उपयोग करने के लिए अर्जित कर रहे हैं की खुर्दबीन तुलना दिखाते हैं. मध्य पंक्ति हमारे compressive decoding के परिणाम को दर्शाता है, जबकि नीचे पंक्ति लुसी - रिचर्डसन deconvolution परिणाम दिखाता है. घ, घ, सीएस, और घ LR माइक्रोस्कोप छवियों के केंद्र में केंद्र की दूरी को देखें, सीएस lensless छवियों डीकोड, और LR lensless छवियों deconvolved , क्रमशः.
चित्रा 6 lensless फ्लोरोसेंट कच्चे छवियों के डिजिटल प्रसंस्करण सचित्र है. एक compressive नमूनाकरण आधारित एल्गोरिथ्म निकट पैक 2 सुक्ष्ममापी व्यास मनका जोड़े को हल करने के द्वारा <4 सुक्ष्ममापी स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. insets भी 40x खुर्दबीन उद्देश्य तुलना, जो डीकोड फ्लोरोसेंट छवियों के साथ बहुत अच्छी तरह से सहमत दिखा. यहाँ माइक्रोस्कोप छवियों में केंद्र के लिए केंद्र की दूरी के लिए संदर्भित करता है, जबकि घ सीएस सीएस डीकोड lensless फ्लोरोसेंट छवियों के केंद्र में केंद्र की दूरी को संदर्भित करता है है.
7 चित्रा fluorescently (16 SYTO) लेबल सफेद रक्त कोशिकाओं की Lensless इमेजिंग सचित्र है. कच्चे lensfree छवियों को तेजी से एक सीएस आधारित विकोडक, जो एक ही नमूना है कि एक 10X उद्देश्य लेंस के साथ अधिग्रहण कर लिया है की एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप छवि के साथ बहुत अच्छी तरह से सहमत हैं का उपयोग डीकोड कर रहे हैं.
8 चित्रा एक कस्टम डिजाइन स्वचालित फ्लोरोसेंट वस्तु गिनती इंटरफ़ेस (MATLAB में) सचित्र है.
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Discussion
हम एक चिप पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी मंच प्रदर्शन है कि, उदाहरण के लिए, प्राप्त कर सकते हैं <जैसे अधिक 4μm स्थानिक संकल्प> 0.6-8 2 सेमी किसी भी लेंस, यांत्रिक स्कैनिंग या पतली फिल्म हस्तक्षेप से फिल्टर के उपयोग के बिना क्षेत्र का दृश्य. इस तकनीक में, faceplate फाइबर ऑप्टिक या एक शंकु के उपयोग के साथ, वस्तुओं से फ्लोरोसेंट उत्सर्जन फाइबर ऑप्टिक केबल का एक 2d सरणी के साथ एक ऑप्टो इलेक्ट्रॉनिक जैसे एक सीसीडी सेंसर सरणी के लिए दिया जा रहा से पहले एकत्र की है / CMOS चिप. इन अधिग्रहीत lensfree छवियों तो तेजी से कर रहे हैं 0.6-8 सेमी 2 एक compressive नमूने / संवेदन आधारित decoding एल्गोरिथ्म का उपयोग क्षेत्र के दृश्य <पर 4μm संकल्प> उपज संसाधित. इस तरह के एक कॉम्पैक्ट और व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट इमेजिंग मंच उच्च throughput cytometry, दुर्लभ सेल अनुसंधान माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह के लिए काफी उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
ए Ozcan आभार NSF कैरियर पुरस्कार, ONR युवा अन्वेषक निदेशक, एनआईएच के कार्यालय से 2009 और NIH निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार DP2OD006427 पुरस्कार के समर्थन मानता है. लेखकों को भी बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, वोडाफोन अमेरिका फाउंडेशन, और NSF BISH प्रोग्राम (# ०७,५४,८८० और 0930501 पुरस्कार के तहत) के समर्थन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-8300 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-11002 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9T031C12STCD | |
| High power LED light source | Thorlabs Inc. | M455L2-C2 | |
| High power LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B | |
| Fiber coupled LED light source | Mightex | FCS-0625-000 | |
| Vacuum Pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 2, 4, 10 μm Fluospheres | Invitrogen | F-8826, F-8859, F-8836 | |
| RBS lysis buffer 1X | eBioscience | 00-4333 | |
| SYTO 16 labeling reagent | Invitrogen | S7578 | |
| Fiber-optic faceplate | Edmund Scientific | NT55-142 | |
| Fiber-optic taper | Edmund Scientific | NT55-134 | |
| Prisms | Edmund Scientific | NT47-626, NT45-403 | |
| Filters | Edmund Scientific | NT39-417 | |
| PDMS Elastomers | Dow Corning | Slygard 184 |
References
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