Summary
Lensless bir çip üzerinde floresan mikroskobu platformu göstermiştir floresan nesneler, örneğin bir ultra-geniş alanda-görünüm görüntü> <4μm çözünürlük çözme algoritması tabanlı bir basınç örnekleme yöntemiyle 0,6-8 cm2. Böyle bir kompakt ve geniş alan floresan çip üzerinde görüntüleme yöntemidir yüksek verimli sitometri, nadir hücre araştırmaları ve mikroarray-analiz için değerli olabilir.
Abstract
Genel olarak on-chip lensless görüntüleme, özellikle yüksek verimli tarama uygulamaları için, daha basit ve daha kompakt tasarımları ile hantal lense bağlı optik mikroskoplar değiştirmeyi hedefliyor. Bu gelişmekte olan teknoloji platformu, yeni teoriler ve dijital rekonstrüksiyon algoritmalar yardımı ile, hantal ve / veya pahalı optik bileşenleri için gereksinimini ortadan kaldırmak için bir potansiyele sahiptir. Aynı doğrultuda, burada, herhangi bir lenslerin kullanımı olmadan 0,6-8 cm 2 <4μm mekansal çözünürlükte ultra geniş bir alan-view (FOV) üzerinden>, örneğin elde edebilirsiniz çip üzerinde floresan mikroskopi yöntemi göstermektedir mekanik tarama veya ince film tabanlı girişim filtreleri. Bu teknikte, floresan uyarılma, tutarsız bir kaynağı tarafından aydınlatılmış bir prizma veya hemisferik cam arayüz üzerinden elde edilir. Tüm nesne hacmi ile etkileşim sonra, bu uyarma ışık toplam iç yansıma (TIR) örnek akışkan mikro-çip alt kısmında meydana gelen işlem reddedilir. Heyecanlı nesnelerden floresan emisyon sonra bir fiber-optik kaplamasını veya konik tarafından toplanan ve şarj-çiftli-device (CCD) gibi bir optoelektronik sensör dizisi teslim edilir. Bir basınç örnekleme dayalı çözme algoritması kullanarak, örnek edinilen lensfree çiğ floresan görüntüler hızla örneğin verim işlenmiş bir FOV üzerinde 0,6-8 cm 2 <4μm çözünürlük>. Ayrıca, örneğin ayrılır mikro-kanal dikey yığılmış, 50-100 mikron de başarılı bir şekilde bu yöntemin, toplam işlem hacmini daha da artırır aynı lensfree on-chip mikroskobu platformu kullanarak görüntülü olabilir. Bu çip üzerinde kompakt floresan görüntüleme platformu, arkasında hızlı bir basınç dekoder, yüksek verimli sitometri, nadir hücre araştırmaları ve mikroarray-analiz için oldukça değerli olabilir.
Protocol
Bu bölümde, biz, bizim lensless çip üzerinde floresan mikroskobu platformu 1-4 deneysel yöntemler gözden geçirecektir . Bu tekniğin yeteneklerini göstermek için, floresan mikro parçacıklar ve etiketli beyaz kan hücreleri için yonga üzerinde görüntüleme sonuçları gösterecektir. Burada tartışılan olmasa da, aynı lensfree floresan mikroskobu platformu transgenik C gibi görüntü küçük modeli hayvanlar için kullanılır. elegans örnekleri 3.
1. On-Chip Lensless Görüntüleme Platform Tasarımı
Bizim lensless çip üzerinde görüntüleme platformu, bir dijital sensör dizisi (örneğin, bir CCD çipi), tutarsız bir ışık kaynağı, prizma, bir emilme filtresinin, fiber-optik kaplamasını veya fiber-optik konik dahil olmak üzere birçok optik bileşenleri kapsar. Şekil 1'de gösterildiği gibi, bu bileşenleri, herhangi bir lensler, mekanik tarayıcılar veya ince film tabanlı girişim filtreleri kullanmadan, bir çip üzerinde büyük bir örnek hacmi floresan görüntüleme ulaşmak için mikro-akışkan cihazlar monte edilir.
- Dijital Sensör Array: lensless görüntüleme yapılandırma hedef mikro-nesneleri floresan emisyon kaydetmek için bir optoelektronik sensör dizisi kullanır. Ve tamamlayıcı metal oksit: Bu platform, floresan sinyal tespiti için, sensör dizileri CCD (KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, KODAK tüm örneğin, Modelleri) gibi farklı türleri, kullanılan olabilir -yarıiletken görüntüleyiciler (CMOS, örneğin, Model: MT9T031C12STCD, Micron Technologies). Piksel boyutu (örneğin, 5.4 mm, 9 mm, KAF-8300 için 6.8 mikron ve 3.2 mikron, KAI-11002, sırasıyla KAF-39000 ve MT9T031C12STCD) ve aktif görüntü alanı (bu sensör dizileri ilgi Temel parametreler örneğin, 2.4 cm 2, 8 cm 2, 18 cm 2 ve KAF-8300 için 32 mm 2, KAI-11002, sırasıyla KAF-39000 ve MT9T031C12STCD). CMOS sensörler (örneğin, arazi kullanımı için), nispeten daha ucuz ve hafif tasarımlar için tercih edilebilir iken lensfree için görüntüleme-çip, CCD sensörler genel olarak, yüksek performansı (geniş aktif alan) ve daha iyi bir hassasiyet elde etmek için tercih edilebilir.
- Işık Kaynakları: bizim platformu, tutarsız bir ışık kaynağı, örneğin, basit bir ışık yayan diyot (LED, örneğin, Thorlabs, M455L2-C2 ve LEDD1B), floresans uyarma için kullanılabilir. Deneysel set-up Şekil. 1, 1 mm çekirdek boyutu ile bir multi-mode fiber optik kablo (Thorlabs, BFH37-1000) bir LED kaynağı (herhangi bir lens veya kaplin optik kullanımı olmadan) ve ikaz ışığı popo çiftli sonra teslim edilir Bu fiber çıkış delikten örnek hacmi. Bu sistemde, floresans uyarma gerekli güç seviyesi, aydınlatma fiber çıkışında> 2-8 cm 2 FOV ~ 0.2-5 mW civarında olmalıdır, ancak, LED'ler çıkış ~ 5mW-1W gerekir Butt-kaplin bir yaklaşım olarak güç seviyeleri önemli ölçüde kayıplı fiber çıkış uyarma gücü azalır. Çeşitli boyalar uyarma elde etmek için, farklı renkli LED fiber optik bağlantı elemanı kullanarak çoğullanır olabilir.
Çip üzerinde floresan görüntüleme ek olarak, aynı örnek lensfree holografik görüntü iletim de Şekil gösterildiği gibi dikey bir ışık kaynağı kullanılarak bu platform ile elde edilebilir. 2. Floresans uyarma fiber aksine, holografik görüntü elde etmek için, küçük bir çekirdek boyutu (örneğin, ~ 50-400 mm) ile farklı bir fiber optik kablo, başka bir LED kaynağı (Mightex, FCS-0625-000) ile birleştiğinde popo. Örnek doğru yayılmaktadır Bu dikey aydınlatma ışığı, fiber sonuna çıktıktan sonra, kısmi mekansal tutarlılık elde etmeye başlar. Mekansal tutarlı olan bu bölgenin çapı ışık seyahatler ve fiber çıkış diyafram büyüklüğü ile ters orantılı olduğunu mesafe ile doğru orantılıdır. Sürece, örnek düzlemde bu mekansal tutarlılığı çapı, sensör düzlemde her numunenin kırınım boyutu daha büyük olduğu gibi, sadakatle, her nesne gelen dağınık ışık-line hologram lensfree örnek oluşturarak, arka plan ışığı ile karışabilir. Bu kazanılmış lensfree hologramlar sonra 5-7 numune hacmi bir iletim alanında parlak görüntü yeniden faz kurtarma yaklaşımları iteratif kullanarak hızlı bir şekilde işlenebilir. Bu holografik aydınlatma sonu için, daha uzun bir dalga boyu LED ikaz ışığı engellemek için kullanılan emme filtreleri, örneğin tipik bir cut-off dalga boylarında yüksek geçiren filtreler olduğundan (yani ~ 625-700 nm), 500-600Nm seçilir hangi bir sorun olmadan hat örnekleri, hologramlar iletim edinimi izin verir. - Diğer optik bileşenleri: Bu çip üzerinde floresan mikroskobu platformu, iki farklı uyarım filtreleme yöntemleri Şekil 2'de gösterildiği gibi paralel olarak gerekli karanlık alan bir arka plan oluşturmak için kullanılır. İlk olarak, bir cam prizma (örneğin, EdmundOptik, rhomboid veya güvercin prizmalar) ya da bir bardak yarımkürede ilgi örnekler barındıran mikro-akışkan çip alt yüzeyinde toplam iç yansıma (ikaz ışığı) oluşturmak için kullanılır. Buna paralel olarak, ucuz bir emme filtresi (örneğin, Roscolux) TIR işleminin uymayanlar zayıf dağınık uyarma ışık kaldırmak kullanılır. Bu iki mekanizma kullanarak ikaz başarılı reddedilmesi üzerine, numuneler sadece floresan emisyon dedektör uçağı satın alındı. Yayılan floresan sinyal belirli bir bölümünü de aynı arayüzü TIR deneyimleri olduğunu unutmayın. Ancak, bu sınırlar, bu lensfree algılama sayısal açıklık ~ 1.0, görüntüleme yaklaşım çip floresan ışınları geri kalanı hala sadece eğik ışınları gibi yüksek bir algılama sayısal diyafram üzerinde mikro-çip içinde kapana kısılmış olduğunu aktif alan piksel numune alınacak sensör dizi çarptı.
Floresan emisyon yönlü ve bu nedenle hızla uzaklaşmakta olmadığı gibi büyük bir algılama sayısal diyafram rağmen, sensör-array çiğ floresan noktalar (örneğin, 150-200 mikron) oldukça geniş. Mühendis ve daha iyi kontrol bizim lensless platformda bu floresan sinyal mekansal yayılması için, nesne ve arasına yerleştirilen düzlemsel bir optik bileşeni, yani, bir fiber-optik kaplamasını (örneğin, Edmund Optik, NT55-142), kullanılan sensörü uçaklar. Diğer bir tarafı cihazın optik yoğunluk bilgilerini taşıyan fiber optik kablolar fiber optik kaplamasını bir 2D dizi oluşur. Bizim lensfree ana fonksiyonu, on-chip mikroskopi set-up lensfree floresan nokta kısmen daraltmak her bir lif, içinde mekansal yayılmasını olmadan seyahat güdümlü optik dalgaların içine çift numune hacmi floresan emisyon serbest alan modlarında nesne ve dedektör uçakları arasında yayılma fonksiyonu (PSF). Bu da bizim için sinyal-gürültü oranı (SNR) yanı sıra bizim lensless platformu kullanılarak elde edilebilir uzaysal çözünürlük artar.
Düzenli bir kaplamasını alternatif olarak, biz de on-chip görüntüleme platformu alt üst faset fiber-optik kabloların önemli ölçüde daha büyük bir yoğunluğa sahip bir "konik" fiber-optik kaplamasını yararlanabilirler. Böyle bir konik kaplamasını sadece bize daha iyi bir PSF elde yardımcı vermez, aynı zamanda bize, örneğin, <4 mikron bizim lensless çözünürlüğünü artırmak için yardımcı olan daha platformda (örneğin,> 2-3X) büyütme tanıtabilirsiniz. Biz de dikkat etmelisiniz alan görüş, böyle bir konik tasarım, örneğin bir azalma anlamına düzenli bir kaplamasını tabanlı görüntüleme sistemi ile karşılaştırıldığında tanıtıldı büyütme faktörü en az kare azalır ~ 8 cm. konik <2 cm 2: başlangıçta 2 FOV (KAI-11002 CCD).
Nihayet, biz de bir fiber-optik kaplamasını veya konik örnek nedeniyle çeşitli optik fiber-optik bir dizi 3 modları lensfree hologramlar bozan dikkat etmelisiniz . Dedektör dizi bu çarpık lensfree desen hala iletim görüntüler, fiber-optik bir dizi (örneğin, kaplamasını veya konik) holografik yeniden inşası için, belirli sitometri ilişkiler uygulamaları için faydalı olabilir. Çip üzerinde montaj kaldırılması gerekiyor floresan modu 3 biraz azaltılmış uzaysal çözünürlük pahasına. - Mikro-akışkan Chips: platformda kullanılan mikro-akışkan cips çip üzerinde görüntüleme için gerekli olan mikro-kanal oluşturmak cam slaytlar yerleştirilen PDMS (polidimetilsiloksan) duvarları kullanılarak imal edilir. Bu mikro-akışkan kanalları imal etmek için şu tarifi takip:
- PDMS A ve B elastomerler düzgün karıştırılır ve 01:10 hacim oranı ile karıştırılır.
- Bu heterojen bir çözüm Petri çanak dökülür sonra, 65 ° C'de 2 saat süreyle tedavi.
- X-Acto bıçak kullanarak, mikro-akışkan kanal duvarının gerekli boyutu ve şekli, Petri kabı elde edilir.
- Cihaz yapıştırma sonra yüksek frekanslı bir kapak cam slaytlar ve PDMS yapıştırma alanı ortaya çıkarmak için gereken plazma jeneratörü (Elektro-Teknik Ürünler A.Ş., BD-10AS) kullanılarak elde edilir.
- Bu plazma tedaviden sonra, cihaz ~ 40-50 dakika boyunca 70 ° C yapıştırma güçlendirmek için bir fırın içerisine yerleştirilir.
- Montaj ve on-chip lensless mikroskobu platformu uyum:
Lensfree çip üzerinde görüntüleme platformu için montaj prosedürleri gibi ayrıntılı olabilir:- Opto-elektronik sensör dizi Cover cam kaldırılır.
- Bir vakum kalem kullanarak (Edmund Optik, NT57-636), ince bir emme filtresi dedektörü aktif alanın üstüne hafifçe yerleştirilir.
- Bir fiber optik kaplamasını veya konik bu emme f üstüne konumlandırılmışilter.
- Fabrikasyon mikro-akışkan çip sonra doğrudan fiber-optik dizinin üstüne yerleştirilir.
- Bir cam prizma veya yarımkürede arayüzü kırılma endeksi cam kırılma indisi uygun böyle bir dizin eşleştirme yağı (Cargille, Immersion Yağı 300 Serisi) kullanarak akışkan mikro-çip üzerine monte edilir.
- Yan aydınlatma fiber yakın prizma (ya da yarı küre) taşınır ve açısı olduğu toplam iç yansıma mikro-akışkan çip alt yüzeye karşılık gelen cam-hava arayüzü oluşur sağlamak için ayarlanır. Dikey aydınlatma (lensfree transmisyon görüntüleme) dedektör dizi dik hizalanmış ve istenen bir alan görüş ortalanır.
- Side ve dikey ışık kaynakları floresan görüntüleme ve aynı yonga üzerinde platformunu kullanarak parlak alan iletim görüntüleme hem sırayla elde etmek için açık / kapalı.
- Lensfree ham görüntüleri daha sonra bir PC (örneğin, 3,2 GHz işlemci, Intel ® Core ™) ile geliştirilmiş özel bir Labview arabirimini kullanarak elde edilir.
2. Numune Hazırlama
Biz lensfree sistemi noktası yayma fonksiyonu (PSF) ölçerek, görüntüleme platformu kalibre etmek için kullanılan floresan mikro-boncuk (örneğin, Invitrogen, Fluospheres). Bu ilk PSF ölçüm yapıldıktan sonra, çeşitli hücreler veya küçük model hayvanlar (örneğin, transgenik C. elegans örnekleri) aynı yonga üzerinde bir platform kullanılarak görüntülenebilir .
Sonraki alt bölümde başlayarak, numune hazırlama adımları ayrıntılı bilgi sağlayacaktır.
- Floresan mikro-boncuk:
- Ham floresan boncuk çözümler örneklerin konsantrasyonu optimize etmek için DI su ile birleştirilir.
- ~ 10 mcL floresan boncuk çözüm için 40 mcL 10 mm, 4 mm ve 2 mikron çapında boncuk, sırasıyla, 5 ml ve 20 ml DI su ile karıştırılır. Çeşitli boncuk (örneğin, non-floresan ve floresan) heterojen çözümler farklı boncuk çözümler birbirleri ile karıştırılarak gerekli hazırlanmıştır.
- Son örnek çözümü, sonra keskin bir şırınga iğnesi (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide İğneler, 14-826 Serisi) kullanarak, yan PDMS duvarlarından akışkan mikro-çip enjekte edilir
- Beyaz kan hücresi etiketleme:
- ~ 100 mcL tam kan hacmi yaklaşık 1 ml kırmızı kan hücrelerinin parçalanması tamponu (eBioscience) ile karıştırılır.
- Yaklaşık 3 dakika inkübasyondan sonra, parçalanan kan çözümü santrifüj ve pelet kat ~ 200 mcL PBS yeniden süspanse (fosfat tamponlu tuz).
- Floresan boya ile hücrelerin nükleik asit etiketlemek için 1mm SYTO (16), 5 mcL örnek, ~ 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübe sonra, tabanda, 200 mcL eklenir.
- İkinci santrifüj süpernatantı bağlanmamış boyalar floresan emisyon nedeniyle arka plan gürültüsünü azaltmak için kaldırılır, bu etiketli örnek uygulanır.
- Beyaz kan hücresi pelet katman sonra lensfree on-chip floresan görüntüleme için bir mikro-akışkan çip transfer edilebilir (örneğin, bkz. Şekil 7) PBS içinde yeniden süspanse.
3. Dijital işleme edinilen lensless floresan görüntüleri
Bu lensless görüntüleme platformu olarak, iki farklı algoritmalar, dijital sistemin çözünürlük, yani Lucy-Richardson deconvolution ve Basınç örnekleme dayalı çözme artırmak için kullanılır . Bu dijital işleme yöntemleri kullanımı sayesinde, sayısal (Şekil görmek 5-6) yakından paketlenmiş boncuk-çiftleri çözümünde her yaklaşım ile elde edilebilir çözünürlük geliştirme. Daha sonra yeniden inşa lensfree floresan görüntüler, floresan sinyal dalga boyu mutlaka önceden bilgi gerektirir mikro-nesnelerin doğal renklerini vurgulamak için (arzu edilirse) yalancı olabilir sürece bir renk (örneğin, bir RGB: kırmızı-yeşil-mavi CCD / CMOS) sensör çip kullanılır. Bu dijital işleme yöntemleri için, özel olarak geliştirilmiş algoritmaları, sadece (örneğin, 3,2 GHz işlemci, Intel ® Core) işlemci gerektiren kullanılır. Potansiyel olarak, yeni nesil grafik işlem birimleri (GPU) de daha hızlı işleme için kullanılan olabilir. Görüntülemeye ek olarak, gerekirse, çözümlenmiş floresan nesneler de otomatik olarak on-chip sitometri uygulamaları için geliştirilmiş özel bir arayüz (bkz. Şekil 8) kullanarak sayılır olabilir.
- Noktadan Spread Fonksiyonu (PSF) ölçümü:
Önce çözünürlük iyileştirme (örneğin deconvolution veya basınç çözme gibi) herhangi bir dijital işleme için çip üzerinde sistem tutarsız nokta yaygın fonksiyonu, tahmini ortalama izole küçük floresan tarafından oluşturulan birkaç ölçülen lensfree floresan desenler elde edilebilir olması gerekir sensörü çip belirli bir yükseklikte bulunan boncuk. Bubireysel floresan desenler sonra uygun şiddeti normalleştirme 1,2 sonra ortalama kitle koordinatları merkezi saygı ile hizalanır. Bu ortalama lensfree desen sonra, bizim on-chip mikroskop floresan nokta-dağılım fonksiyonu olarak kullanılabilir. - Lucy-Richardson deconvolution 1: mekansal çözünürlükte dijital platform geliştirmek için, biz hızlandırılmış bir Lucy-Richardson algoritması 8-10 elde edilen çiğ floresan görüntü ve ölçülen tutarsız nokta-dağılım fonksiyonu beslemek. Bayes teoremi uygulayarak, Lucy-Richardson algoritması yinelemeli nesne düzlemi 8,9 floresan kaynak dağılımı maksimum olabilirlik tahmini rafine ölçülen nokta-dağılım fonksiyonu kullanır. Iterasyon süreci yansıtılan ve ölçülen lensfree floresan kalıpları arasında en az bir kare hata sağlamak için gürültü amplifikasyon ortaya çıkmadan önce bir kaç yüz döngüsünden sonra genellikle sona erer. Bu deconvolution algoritmanın yakınsama hesaplama süresi 10 kısaltmak için bir vektör ekstrapolasyon yöntemi ile hızlandırıldı. Bir fikir vermek için: Bu algoritma (~ 9μm örneğin, bir pikselin boyutu ile bir CCD / CMOS çipi kullanarak) ~ 20 mikron etkili bir uzaysal çözünürlüğü sağlar ve birkaç on dakika içinde ~ 8 cm 2 FOV deconvolve Matlab 1 çalıştıran bir düzenli PC. Aynı hesaplama süresi için, örneğin, sadece bir kaç saniye için damla olduğunu, tipik bir 10X objektif lens FOV karşılaştırılabilir ~ 1mm 2 FOV .
- Basınç örnekleme / algılama tabanlı seyrek sinyal çözme 2: Daha fazla çözünürlük iyileştirme (<4 mm kadar), 4 / Basınç Algılama tabanlı kod çözme algoritmaları Örnekleme 11,12 elde edilebilir. Basınç Örnekleme / Algılama örnekleme teoremine göre gerekli olandan çok daha az sayıda örnekleri seyrek sinyal kurtarmak için amaçlayan kısa bir süre önce ortaya çıkan kuramsal çerçeve 13-15 sağlar . Genel iken altında örneklenmiş ölçümleri, sinyal kurtarma işlevleri belirli bir sınıf (yani seyrek fonksiyonları için), iyi bilinen örnekleme teoremi ve onun temsil esasına son zamanlarda açısından oldukça verimsiz olduğu gösterilmiştir, kötü yarattığı bir sorun. aynı seyrek sinyal, yani gerekli ölçümlerin sayısı, genel olarak benzersiz klasik örnekleme teorisine göre çok az örneklerinden kurtarıldı olabilir.
On-chip mikroskop tarafından kaydedilen Lensless floresan görüntüler doğal Basınç Decoding önemli bir gereksinimi karşılamak gibi geniş alan, floresan sitometri, nadir hücre analizi ve yüksek verimlilik mikro-array görüntüleme gibi bu çalışmaya ilgi uygulamalar için, ilgi floresan nesneler zaten seyrek olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, bizim lensless floresan mikroskop, nesne düzlemi florasan vericilerin dağılımı ve göreceli güçlü, çözme, büyük ölçekli l 1-regularized örneğin kullanarak çözülebilir en küçük kareler problemi olarak modellenmiş olabilir bir iç- nokta yöntemi 2,12. Bu optimizasyon problemi matematiksel olarak ifade edilebilir:
| | u | | k = (Σ i n | u | k) (1 / k) ve | | u | | ∞ = max i | u i |. Bu nedenle, biz l 1-regularized l 2-norm kaydedilen / ölçülen (y) ve x ve çözümlenmiş olması, kaynak dağıtım temsil ve ölçüm matrisi kullanılarak oluşturulur tahmini (Ax) lensfree görüntüleri arasındaki farkı en aza indirmek sırasıyla sistemin deneysel PSF. Ayrıca nesne düzlemi kaynak dağılımı negatif olmayan zorlayarak bir sınırlama fonksiyonu kullanın. Bu iteratif basınç çözme süreci, maliyet fonksiyonunun değeri, önceden belirlenen bir tolerans değeri ulaştığında sona erer. Düzenlileyici (β) ve hoşgörü parametreleri nesne seyreklik ve ölçüm gürültü seviyesi genel işlevlerini ve βmax/10 ~ ve ~ 0.01 sistemi, sırasıyla optimize edilmiştir.
Dayanarak, yukarıda özetlenen sayısal şeması, çiğ floresan görüntülerin basınç çözme seyrek nesneler ve sergiler Lucy-Richardson deconvolution 2 karşılaştırılabilir bir işlem hızı büyük ölçüde çözmek için bizim platformumuz yeteneğini geliştirir. Tek bir katman görüntüleme için ek olarak, farklı derinliklerde bulunan floresan nesneleri de çözümlenmiş olabilir ve aynı anda 2 farklı derinlik katmanları ilgili tüm PSFs aynı algoritmayı kullanarak çalışan birbirinden ayrılmış. - Pseudocoloring: opto-elektronik, temel bir sınırlama değil, sunulan iken çip üzerinde görüntüleme platformu çoğunlukla monokrom istihdam segenel olarak biyolojik örnek görüntüleme için daha iyi sinyal-gürültü oranı sağlamak nsor diziler. Bu nedenle, çiğ floresan görüntü formatı, gerçek renk örneklerinin bilgi içermez gri tonlama elde edilir. Bu 3 renk kanalı (kırmızı, yeşil ve mavi) her lensfree floresan ölçümünde elde edilen bu tür lensfree görüntüleme mimarisi renkli CCD / CMOS yongaları kullanılarak hafifletilebilir. Öte yandan, etiketleme boya emisyon özellikleri zaten bilinen, ham formatında bir sensör çip tek renkli ve onların çözümlenmiş / deconvoled sürümleri de yapay renkli görüntüler, örneğin MATLAB uygulanan bir pseudocoloring algoritması kullanılarak dönüştürülebilir floresan gri tonlamalı görüntüler. Bu amaçla, gri tonlama elde edilen görüntüler ilgi herhangi bir renk, her sözde kanal veri küpü Uygun tartım faktörleri kullanılarak sentezlenebilir 3-boyutlu veri küpleri, içine genişletilebilir. Bu işleme sonucunda, siyah-beyaz lensfree floresan görüntüler, belirli bir floresan nesnenin bilinen renk bilgisi sağlayan çok kanallı görüntü (istenirse) dönüştürülmüş olabilir.
- Otomatik floresan hücre sayımı: sitometri uygulamaları için otomatik olarak on-chip mikroskobu platformu ile edindikleri lensfree görüntüleri dayalı floresan nesne / hücreleri saymak, özel tasarlanmış kullanıcı arayüzü (bkz. Şekil 8), biz de geliştirdik . Bu görevi doğru, başlangıçta yumuşak bir eşik floresan nesnelerin potansiyel yerleri daraltmak için, ham lensfree görüntülere uygulanır. Sonra, (özellikle regionprops) fonksiyonları bir dizi konumu, alanı, şekli ve yoğunluğu gibi ilgi her alt bölge görüntü özellikleri ölçmek için kullanılır. Bu nesne verilerini kullanarak, ikili nesneler gibi hücreleri, ölü piksel, toz veya arka planda otomatik floresan yanı sıra alt gruba sınıflandırılır. Bir kez regionprops nihai sonucu fonksiyon, sadece ilgi hücreleri göstermek için filtre edilir, ortaya çıkan yapı dizinin uzunluğu lensfree on-chip görüntüleyici tüm FOV üzerinde hücre sayımı için kullanılabilir .
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Set-up bir bakış, kendi montajında kullanılan birçok optik bileşenleri, Şekil 1'de gösterilmiştir . Anahtar özellikler on-chip mikroskobu platformu floresan algılama ve uyarma, toplam iç yansıma yanı sıra aynı platform üzerinde holografik iletim görüntüleme kısmen tutarlı aydınlatma da dahil olmak üzere, Şekil 2'de açıklanmıştır. 3-4 Rakamlarla çeşitli mikro-partiküller (4 mm yeşil ve kırmızı / yeşil 10 mikron) içeren heterojen bir karışım Lensless floresan çip üzerinde görüntüleme sonuçları gösterilmiştir. Lucy-Richardson deconvolution ve Basınç Örnekleme / Algılama temelli çözme Karşılaştırma dijital ham lensless floresan görüntü çözünürlüğü artırmak için Şekil 5 sağlanmaktadır. Basınç çözme uzaysal çözünürlüğü (<4 mm) Şekil 6 sayısal sağladı. Şekil 7, aynı zamanda geleneksel bir floresan mikroskop ile çekilen görüntüleri karşılaştırma sağlar floresan etiketli beyaz kan hücrelerinin Lensless çip mikroskopi gösterilmiştir . Son olarak, bizim otomatik floresan nesne sayma arayüzü Şekil 8'de gösterilmiştir.
Şekil 1 Genel Bakış bizim lensless çip üzerinde görüntüleme set-up ve montajında kullanılan birkaç optik bileşenleri ile gösterilir.
Şekil 2 on-chip lensfree floresan görüntüleme platformu şematik diyagramı (soldaki resim) gösterilir. Floresan uyarma, tutarsız bir kaynak kullanarak rhomboid prizma yan faset ile elde edilir. Set-up on-chip floresan görüntüleme platformu deneysel (sağdaki resim) gösterilir. Prizma arayüzü aracılığıyla indeksi eşleşen yağ çip ve prizma monte etmek için kullanılan bir mikroakışkan yonga (boyutlar: 2.5 x 3.5 x 0.3 cm) içinde tam kan örneği heyecanlıydı. TIR ikaz ışığı ve renk filtresi tarafından reddedilmesi üzerine, etiketli kan hücreleri sadece floresan emisyon ~ 2.5 x 3.5 cm FOV üzerinde CCD sensör çipi (KODAK 11002) tarafından kaydedildi.
Şekil 3, 4 mm ve 10 mm yeşil floresan parçacıklar içeren bir karışım Geniş alan lensless floresan çip üzerinde görüntüleme gösterilmiştir . Karşılaştırma amaçları için, 10X mikroskop objektif görüntüleri de bizim lensless floresan görüntüleri ile de uyuşmaktadır sağlanmaktadır.
Şekil 4.
Şekil 5 Lucy-Richardson (LR) deconvolution ve çözme algoritmaları tabanlı basınç örneklemesi (CS) Performans karşılaştırma değişik 10 mikron boncuk çiftleri görüntüleme sağlanır. Üst satırındaki lensless çiğ floresan görüntüleri göstermektedir. Üst satırı içerlek görüntüleri aynı parçacıkların 10X objektif lens kullanarak elde edilen mikroskop karşılaştırmalar göstermektedir. Alt satırda ise orta sıra Lucy-Richardson deconvolution sonuçları göstermektedir bizim basınç çözme sonuçları göstermektedir. d d CS, ve d LR mikroskop görüntüleri merkezi merkezi mesafelere bakın, CS lensless görüntüleri çözümlenmiş ve LR sırasıyla, lensless görüntüleri deconvolved.
Şekil 6 lensless floresan ham görüntüleri dijital işleme gösterilmiştir. Basınç Örnekleme algoritması yakından paketlenmiş 2 mikron çapında boncuk çiftleri çözmek <4 mikron uzaysal çözünürlük elde etmek için kullanılır. Parçalar da çözümlenmiş floresan görüntüler ile çok iyi kabul ediyorum 40X mikroskop objektif karşılaştırmalar göstermektedir. D CS CS çözümlenmiş lensless floresan görüntüleri merkezi merkezi mesafelere işaret ederken Burada d, mikroskop görüntüleri merkez merkeze uzaklıkları gösterir.
Şekil 7 floresan (SYTO 16) etiketli beyaz kan hücreleri Lensless görüntüleme gösterilmiştir. Ham lensfree görüntüleri hızla 10X objektif lens ile elde edilir aynı örnek geleneksel bir mikroskop görüntüsü ile çok iyi kabul eder CS tabanlı dekoder kullanılarak çözülür.
Şekil 8 özel tasarlanmış otomatik flüoresan nesnenin sayma arayüzü (MATLAB) gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz, örneğin elde edebilirsiniz çip üzerinde floresan mikroskobu platformu gösterdi <örneğin üzerinde 4μm mekansal çözünürlükte,> 0,6-8 cm 2 lensler, mekanik tarama veya ince film parazit filtreleri kullanmadan alan görüş. Bu teknikte, bir fiber-optik kaplamasını veya konik kullanımı ile, floresan emisyon nesnelerden bir CCD gibi bir opto-elektronik sensör dizisi teslim edilmeden önce, fiber-optik kablolar bir 2D-dizisi ile toplanır / CMOS çipi. Bu kazanılmış lensfree görüntüler daha sonra hızla tabanlı çözme algoritması algılama basınç örneklemesi / kullanarak 0,6-8 cm 2 alan-görünümü <üzerinde 4μm çözünürlüğü> verim işlenir. Böyle bir kompakt ve geniş alan floresan görüntüleme platformu, yüksek verimlilik sitometri, nadir hücre araştırmaları gibi mikroarray-analiz için için oldukça yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
A. Özcan NSF KARİYER Ödülü, ONR Genç Araştırmacı Ödülü Direktörü, NIH Office 2009 ve NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü DP2OD006427 destek minnetle kabul eder. Yazarlar ayrıca, Bill & Melinda Gates Vakfı, Vodafone Amerika Vakfı, ve NSF bish programı (# 0.754.880 ve 0.930.501 Ödülleri altında) desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-8300 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-11002 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9T031C12STCD | |
| High power LED light source | Thorlabs Inc. | M455L2-C2 | |
| High power LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B | |
| Fiber coupled LED light source | Mightex | FCS-0625-000 | |
| Vacuum Pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 2, 4, 10 μm Fluospheres | Invitrogen | F-8826, F-8859, F-8836 | |
| RBS lysis buffer 1X | eBioscience | 00-4333 | |
| SYTO 16 labeling reagent | Invitrogen | S7578 | |
| Fiber-optic faceplate | Edmund Scientific | NT55-142 | |
| Fiber-optic taper | Edmund Scientific | NT55-134 | |
| Prisms | Edmund Scientific | NT47-626, NT45-403 | |
| Filters | Edmund Scientific | NT39-417 | |
| PDMS Elastomers | Dow Corning | Slygard 184 |
References
- Coskun, A. F., Su, T., Ozcan, A. Wide field-of-view lens-free fluorescent imaging on a chip. Lab Chip. 10, 824-824 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensless wide-field fluorescent imaging on a chip using compressive decoding of sparse objects. Opt. Express. 18, 10510-10523 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensfree Fluorescent On-Chip Imaging of Transgenic Caenorhabditis elegans Over an Ultra-Wide Field-of-View. PLoS ONE. 6, e15955-e15955 (2011).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Wide-field lensless fluorescent microscopy using a tapered fiber-optic faceplate on a chip. Analyst. , (2011).
- Seo, S. High-Throughput Lens-Free Blood Analysis on a Chip. Analytical Chemistry. 82, 4621-4627 (2010).
- Mudanyali, O. Compact, light-weight and cost-effective microscope based on lensless incoherent holography for telemedicine applications. Lab Chip. 10, 1417-1417 (2010).
- Tseng, D. Lensfree microscopy on a cellphone. Lab Chip. 10, 1787-1787 (2010).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-745 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. J. Opt. Soc. Am. 62, 55-59 (1972).
- Biggs, D. S. C., Andrews, M. Acceleration of iterative image restoration algorithms. Appl. Opt. 36, 1766-1775 (1997).
- Candes, E., Wakin, M. An Introduction To Compressive Sampling. Signal Processing Magazine, IEEE. 25, 21-30 (2008).
- Kim, S., Koh, K., Lustig, M., Boyd, S., Gorinevsky, D. An Interior-Point Method for Large-Scale L1-Regularized Least Squares. Selected Topics in Signal Processing, IEEE. 1, 606-617 (2007).
- Candes, E. The restricted isometry property and its implications for compressed sensing. Comptes Rendus Mathematique. 346, 589-592 (2008).
- Baraniuk, R. Compressive Sensing [Lecture Notes]. Signal Processing Magazine, IEEE. 24, 118-121 (2007).
- Romberg, J. Imaging via Compressive Sampling. Signal Processing Magazine, IEEE. 25, 14-20 (2008).
