Summary
주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 γδ T 세포를 확장하는 방법을 설명합니다. PBMC - 파생 γδ T 세포는 자극과 zoledronate과 인터루킨 - 2 (IL - 2)를 사용 확장됩니다. γδ T 세포의 대규모 확장이 암의 autologous 세포 immunotherapy에 적용할 수 있습니다.
Abstract
인간 γδ T 세포가 인식하고 스트레스 유발 항원의 다양한 반응, 따라서 본래 광범위한 안티 종양 및 안티 infective 활동을 개발하고 있습니다. 말초혈에서 γδ T 세포의 1 대부분 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 있습니다. 이러한 세포의 주요 histocompatibility 복합 독립적인 방식으로 항원을 인식하고 강한 cytolytic과 Th1과 같은 이펙터 기능을 개발할 수 있습니다. 1 따라서, γδ T 세포가 암 immunotherapy에 대한 매력적인 후보 효과기 세포 수 있습니다. Vγ9Vδ2 T 세포 같은 phosphoantigens에 대응 (E) -4 - 히드록시 -3 - 메틸 -하지만 - 2 - enyl 나트륨 (HMBPP), isoprenoid 생합성 통해 박테리아에 합성하는, 생산 2 isopentenyl 나트륨 (IPP), mevalonate 경로 3. 생리적 조건을 통해 진핵 세포에서 nontransformed 셀에 IPP의 세대 γδ T 세포의 활성화를 위해 충분하지 않습니다. 종양 세포에서 mevalonate 경로의 Dysregulation는 IPP의 축적과 γδ T 세포의 활성화로 연결됩니다. 3 aminobisphosphonates (예 : pamidronate 또는 zoledronate 등) farnesyl 나트륨의 synthase (FPPS), mevalonate 경로에서 IPP의 하류를 연기 효소의 세포내 수준을 억제하기 때문에 IPP 및 γδ T 세포 인식에 sensitibity는 therapeutically aminobisphosphonates 증가 수 있습니다. IPP 축적 aminobisphosphonates와 γδ T 세포를 활성화하여 암 우리에게 immunotherapy 수 aminobisphosphonates의 pharmacologically 관련 농도와 종양 세포보다 nontransfomred 세포에 덜 효율적이다. PBMC는 aminobisphosphonates로 치료하는 경우 4 흥미롭게도, IPP 때문에 효율의 monocytes에 쌓입니다 이러한 세포로 약물 이해. IPP 항원 제시 세포되고 주변 혈액에 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극 축적 5 Monocytes가 6. 이러한 메커니즘을 바탕으로, 우리는 zoledronate와 인터루킨를 사용하여 γδ T 세포 문화의 대규모 확장을위한 기술을 개발 -2 (IL - 2). γδ T 세포의 확장 7 다른 방법은 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 8 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)를 활용 9. 이러한 방법 중 모든 전 수 입양 immunotherapy에 사용하기 위해 γδ T 세포의 다수의 결과로 생체내 확장. 단, zoledronate은 FDA의 승인을 상용 시약입니다. CD45RA - - Zoledronate - 확장 γδ T 세포는 CD27 표시 효과기 메모리 표현형과 그들의 기능은 IFN - γ 생산 분석 7 평가할 수 있습니다.
Protocol
1. PBMC의 분리
- BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과에 혈액 (7.5-8.0 ML)를 그립니다. 튜브는 나트륨 헤파린의 항응고제와 Ficoll - Hypaque 밀도 유체, 더하기 두 액체를 분리 폴리에스터 겔 장벽을 포함하고 있습니다. 1,800 X g에서 20 분 수평 로터 (스윙 아웃 헤드)에 실온 (18 ° C 25 ° C)에서 튜브 / 혈액 샘플을 원심 분리기. 브레이크를 원심 분리기 전환합니다.
- 원심 분리 후, 레이어의 순서 (위에서 아래에서 본) 다음과 같이 발생합니다 :) 플라즈마 - B) 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)과 혈소판 - C) 밀도 솔루션 - D) 폴리에스터 겔 - E) granulocytes - F) 적혈구 (그림 1).
- 셀 계층을 방해하지 않고 계면 위의 플라즈마의 5~10mm를 떠나, 플라즈마 층의 일부를 수집합니다. 플라즈마는 문화 (섹션 2.5)을 위해 사용될 수 있습니다.
- 15 ML 원뿔 관에 피펫 및 이전과 계면에서 농축 분율 (PBMC)를 수확.
- 10 ML과 PBMC을 씻 는다 인산염 버퍼 반전 튜브에 의해 생리 (PBS), 5 번, 그리고 400 X g에서 5 분 원심 분리기.
- 두 번 세척 단계를 반복한 다음 PBS 5 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. 휴대폰 번호를 확인합니다. 보통 1.3 X10 6 셀은 전체 혈액의 1 ML에서 회복됩니다.
- 주파수 및 유동세포계측법 (섹션 3) (그림 2)에 의해 PBMC에서 γδ T 세포의 표현형를 결정합니다.
2. γδ T 세포의 확장
- 상온에서 400 X g에서 5 분 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 원심 분리기 suspensions하고 supernatants 폐기하십시오.
- 각각 1000 IU / ML 5 μm의 최종 농도에 인간 IL - 2 (IL - 2)와 zoledronate (Zometa)를 추가하여 문화 매체 (CM)를 준비합니다. ALyS203 (셀 과학 기술 연구소) 또는 OpTmizer (Invitrogen) 미디어 γδ T 세포 (참조 6 9 자세한 정보)의 좋은 확장을 지원합니다. Zometa는 액체 형태 (4 mg/5-ml의 약병)에 제공됩니다. 5 μm의 솔루션을 준비하려면, 문화 매체의 30 ML에 Zometa 50 μl를 추가합니다.
- Resuspend 문화 매체 세포 펠릿 및 1x10 6 세포 / ML을 조절할 수 있습니다.
- 24 - 잘 플레이트의 각 우물에 1x10 6 세포를 포함하는 CM의 Pipet 1 ML. 대규모 문화, 전지 판 우물, 요리,이나 플라스크의 표면 영역에 따라이 0.5 X 10 6 세포 / cm에서 씨앗을하실 수 있습니다.
- 그것은 문화의 볼륨 (24 잘 플레이트의 각 물론 100 μl)의 약 10 % 있도록 autologous 플라즈마 (섹션 1.3), 풀링 인간 AB 세라, 또는 FCS를 추가합니다. humidified 37 접시를 놓고 ° C 5 % 24-48 시간에 대한 CO 2 배양기.
- 0.5-2 X 10 6 세포 / ML의 세포 밀도의 문화를 유지합니다. 신선한 매체마다 2-3일 인간 IL - 2 (1000 IU / ML) 전용 (Zometa없이)이 포함된 추가하고, 세포 증식의 정도 (그림 3)에 의하면, 새로운 우물하거나 필요한만큼 flasks으로 교양 세포를 전송합니다. 공급 플라즈마 또는 혈청 농도가 적어도 1% 유지 수 있도록 매체 혈청.
- 일 12-14과 주파수, 표현형 및 유동세포계측법에 의해 γδ T 세포 (아래 참조)의 기능을 결정에 수확 세포.
3. 유동세포계측법에 의해 Phenotypic 분석
- 형광 - 활성화된 셀 정렬 (외과) 튜브 2 X 10 5 세포를 포함하는 200 μl 샘플을 전송합니다.
- 차가운 PBS 2 ML 추가 400 X g에서 5 분 원심 분리기. 그런 다음, 50 μl 외과 버퍼 (PBS + 1% FCS + 0.1 %의 나트륨 azide)에 알약을 resuspend. 샘플 (단클론 항체가 표 1에 나와 있습니다) 각 항체의 5 μl를 추가합니다.
- 20 분 동안 짙은 어둠 속에서 얼음 품어.
- 각 샘플 2 ML의 외과 버퍼를 추가한 다음 소용돌이. 4 400 X g ° C.에서 5 분 원심 분리기 샘플 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다.
- 300 μl 외과 버퍼와 와동에있는 세포를 Resuspend. 흐름 cytometer (그림 2)에서 샘플을 분석할 수 있습니다.
4. IFN - γ 생산 분석 10
- 분석 전날, RPMI 1640 미디어 플러스 Zometa (5 μm의) (이하 Z - Daudi 지정)과 하룻밤 10% FCS (RPMI - 10)에 culturing 3-5 X10 5 Daudi 세포 / ML로 자극기 전지를 준비합니다.
- 2x10 6 셀 / ML에서 RPMI - 10 Z - Daudi 및 resuspend를 수집합니다. 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트의 각 잘하는 Z - Daudi (2x10 5) 100 μl를 추가합니다.
- RPMI - 10은 20 μg / ML에서 Brefeldin를 포함에 2x10 6 셀 / ML에서 γδ T 세포를 준비합니다. 각 잘 포함 Z - Daudi 전지에 γδ T 세포 현탁액 (2x10 5) 100 μl를 전송하거나 우물 (100 단 RPMI - 10 μl, 또는 phorbol 20 NG / ML 12 - myristate 13 - 아세테이트와 RPMI - 10 제어[PMA] 플러스 2 μg / ionomycin의 ML).
- 몇 시간을 아래와 pipetting하여 섞는다. 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 4 시간을위한 부화.
- 4 ° C에서 400 X g에서 5 분 접시를 원심 차가운 PBS 200 μl의 알약을 resuspend.
- 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 차가운 PBS 4 ML을 추가하고 4 400 X g에서 5 분 튜브를 원심 ° C.
- FITC - 복합 백신 TCRVγ9 (5 μl)와 PE/Cy5-conjugated 안티 인 경우에는 3 번 CD mAb (2.5 μl)와 외과 버퍼의 50 μl의 알약을 Resuspend. 부화는 실온에서 15 분 빛으로부터 보호.
- IntraPrep 시약 1 100 μl를 추가하고 실온에서 15 분 알을 품다. 상온에서 400 X g에서 5 분 각 튜브와 원심 분리기에 PBS 4 ML을 추가합니다.
- 흡인에 의해 표면에 뜨는를 제거하고 IntraPrep 시약 2 100 μl를 추가합니다. 떨지 않고 상온에서 5 분 알을 품다.
- 테스트 튜브에 PE - 복합 백신 IFN - γ mAb 5 μl를 추가합니다. 부화는 실온에서 15 분 빛으로부터 보호.
- 상온에서 400 X g에서 5 분 각 튜브와 원심 분리기에 PBS 4 ML을 추가합니다. 흡인에 의해 표면에 뜨는를 제거하고 외과 버퍼의 0.5 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 흐름 cytometer에 의한 세포를 분석할 수 있습니다. 인 경우에는 3 번 CD + TCRVγ9 + 세포에서 IFN 게이트 - γ (그림 4)의 표현을 확인합니다.
5. 대표 결과 :
문화의 개시에 PBMC에서 γδ T 세포의 비율을 결정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2 A, 인 경우에는 3 번 CD + TCRVγ9의 비율은 + PBMC에서 γδ T 세포는 하루에 0에 1.6 %되었습니다. 중앙 메모리 phenotypes - 지배 집단은 CD27 + CD45RA + 순진한 또는 CD27 + CD45RA했다. γδ T 세포가 효율적으로 자극되었을 때, 그들은 (그림 3 A와 B) 일 3-5에 클러스터를 형성. 클러스터 형성이 지연되었을 때, 같은 다른 세포 유형의 성장 CD4 + 또는 CD8 + αβ T 세포 또는 NK 세포가 γδ T 세포 (그림 3 C 및 D)의 성장을 지배 수 있습니다. 문화 날로부터 14 일 후, γδ T 세포의 빈도가 성공적으로 γδ T 세포 배양 (그림 2 E)에서 교양 세포의 이상이 93.8 %로 증가했다. 교양 γδ T 세포 upregulated NKG2D 및 CD69 표현 (그림 2 G 및 H). 그들은 CD27 표시 - CD45RA - 효과기 메모리 표현형 (그림 2 F). γδ T 세포의 기능이 시토킨 생산 및 세포 독성에 관한 평가했다. 세포내 IFN - γ 얼룩 γδ T 세포는 PMA / ionomycin 치료 또는 Z - Daudi 세포에 대한 응답으로 IFN - γ를 생산 것을 입증되는 zoledronate 치료 후 누적된 IPP (그림 4). 이러한 결과는 zoledronate 효율적으로 자극하고 기능 γδ T 세포를 확장할 수 있음을 나타냅니다.
| 튜브 | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | 인 경우에는 3 번 CD에 들어 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | 인 경우에는 3 번 CD에 들어 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | 인 경우에는 3 번 CD에 들어 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | 인 경우에는 3 번 CD에 들어 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | 마우스 IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | 마우스 IgG1 | 마우스 IgG1 |
표 1. γδ T 세포의 여러 가지 빛깔의의 얼룩에 사용되는 단클론 항체. 우리 연구실에서 수행 γδ T 세포의 phenotypic 분석 예제는 그림에 표시됩니다. 2.
그림 1. PBMC의 분리. 블러드 (7.5-8.0 ML)은 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 헤파린과에 직접 그려 1,800 X g에서 20 분 centrifuged입니다. 원심 분리 후, 같은 결과 레이어는 처음부터 보로 볼 수ttom :) 플라즈마 - B) PBMC 및 혈소판 - C) 밀도 솔루션 - D) 폴리에스터 겔 - E) Granulocytes - F) 적혈구.
그림 2. γδ T 세포의 일반적인 표면 표현형. PBMC는 14 일 동안 zoledronate 및 IL - 2와 함께 자극했다. 세포와 스테인드되었습니다 FITC - 라벨 안티 TCR γδ T Vγ9 및 세포 (A와 E)의 확장을 모니터하는 안티 - 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE/Cy5-labeled. γδ T 세포는 TCRVγ9 자신의 표현으로 식별되었고, CD27 및 CD45RA (B와 F), NKG2D (C와 G), 또는 CD69 (D 및 H) 자신의 표현을 조사했다.
그림 3. 대표 γδ T 세포 문화. PBMC는 IL - 2 (1000 IU / ML) 및 zoledronate (5 μm의)와 자극했다. 대표 필드 (IX71 거꾸로 현미경 [올림푸스] X 200) 표시됩니다. γδ T 세포의 클러스터 및 집계는 γδ T 세포가 성공적으로 확장되었습니다 3 일 (A)과 5 일 (B)에 볼 수 있습니다. γδ T 세포 성장 (C 및 D) 충분하지 때 대조적으로, 어떤 클러스터 또는 집계는 관찰되지 않았습니다.
그림 4. IFN - γ 생산. γδ T 세포는 RPMI - 10 (A) 또는 PMA / ionomycin (B) 또는 4 시간에 대한 Z - Daudi (C)와 incubated했다. 첫째, TCRVγ9의 표면 표현은 스테인드했습니다 그리고 IFN - γ 생산 세포내 IFN - γ 염색법에 의해 조사되었다.
그림 5. γδ T 세포 문화의 속도론. 교양 세포 (A) 절대 번호, (B) γδ T 세포, 그리고 지정된 시간 지점에서 γδ T 세포 (C) 절대 번호의 비율입니다.
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Discussion
여기서 제시하는 방법은 PBMC에서 γδ T 세포의 효율적인 확장이 가능합니다. γδ T 세포가 활성화되고 확대 zoledronate로와 IL - 2는 시토킨 생산 및 세포 독성에 의해 반사 완료 효과기 기능을 개발할 수 있습니다. 그것은보고되었음을 합성 phosphoantigens의 bromohydrin 나트륨 (BrHPP) 및 2 - 메틸 - 3 - butenyl - 1 - 나트륨 (2M3B1PP)는 또한 γδ T 세포를 확장하고 있지만, 그들은 상업적으로 사용할 수 없습니다. 대조적으로, zoledronate 이미 Zometa으로 임상 응용에 대한 라이센스입니다. 따라서 신뢰할 수있는 시약을 쉽게 사용할 수 있습니다.
문화 미디어 및 혈청의 선택은 중요합니다. 이러한 ALyS203 (셀 과학 기술 연구소) 또는 성공 γδ T 세포 확장을위한 OpTmizer (Invitrogen)와 같은 적절한 문화 미디어를 사용합니다. 11 그 autologous 플라즈마를 확인 풀링된 인간 AB 세라이나 FCS는 γδ T 세포 배양을 지원할 수 있습니다. 일부 기증자에 관계없이 다른 문화 시약의 zoledronate의 자극에 대응하지에서 또한 PBMC 기억. 그렇게되면, 유일한 옵션은 기증자를 변경하는 것입니다.
우리가 보여주는 것처럼, γδ T 세포의 농축은 상대적으로 조기 달성되었다; 교양 세포의 거의 80 %가 일 7 γδ T 세포했다. γδ T 세포는 12-14일 (그림 5) 최대 분아 따위에 의해 번식을 계속했다. 약 2.2 X 10 8 γδ T 세포는 1 × 10 6 얻을 수있다
PBMC는 1.6 X 10 4 γδ T 세포를 포함하는. 이 문화 메서드는 단계에서 사용되었습니다 제가 여러 골수종이나 폐암 환자의 안전과 Zoledronate - 확장 γδ T 세포 전송 치료의 가능성을 평가 임상 실험. 12,13
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
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