Summary
在这里，我们描述CD133的表达肝干细胞和整体的小鼠肝，一个过程，需要组织消化，细胞富集和流式细胞仪分离肿瘤干细胞的分离。包括先进的单细胞的分离和克隆扩增的方法。
Abstract
肝脏干细胞，或椭圆形细胞，增殖在慢性肝损伤，并提出分化成肝细胞和胆管。此外，肝脏干细胞性肝癌，肝癌的一个子集的前体。任何实质器官，如肝脏干细胞工作的主要挑战之一，是一个罕见的人口进行详细的分析细胞的分离。例如，绝大多数是在肝细胞内的肝细胞（实质分数），这是明显比非实质细胞。通过丰富的肝（即实质和非实质部分）的特异性细胞车厢，CD45阴性细胞的选择，我们能够到超过600 fold.The丰富的干细胞开始人口在本报告proceduresdetailed允许一个比较少见了坚实的器官细胞的人口，有效地进行排序。这个过程可以利用干细胞从正常小鼠肝isolateliver以及慢性肝损伤模型，这表明增加肝脏干细胞的增殖。此方法具有明显的优势超过标准的冻结或福尔马林固定肝免疫组织化学，利用活细胞的功能研究，可以初步合作定位实验后执行。为了实现在本报告所述的程序，与工作关系的研究为基础的流式细胞仪检测的核心是大力鼓励流式细胞仪隔离的细节是高度依赖专门的仪器和一个强有力的工作基本流式细胞仪检测程序的知识。这一过程的具体目标是分离肝脏干细胞可以克隆在体外培养扩增的人口。
Protocol
所有的解决方案，媒体，仪器仪表，过滤器，和管应无菌和无菌技术，以减少污染的风险处理。提前和存储缓冲区和媒体24小时准备在4 ° C。
1。从全肝实质和非实质的分离
- 准备于10 ml无菌PBS含5毫克胶原酶，5毫克链霉蛋白酶，和1毫克DNA酶螺丝顶部使用了15毫升管的消化酶液。
- 安乐死鼠标使用机构的批准（机构动物护理和使用委员会）的方法， 如 CO 2窒息。用70％的乙醇溶液安乐死动物的腹部。使用消毒，打开腹腔和外植体肝块EN -。取出explanted肝的胆囊。整个肝脏转移到封闭的无菌培养皿中的层流罩。
- 此过程完成后，在层流罩。用消毒的刀片，直言不讳地削减1分钟，在无菌盘的多个横向和纵向相结合的肝脏。地点¼ 15毫升10 CC PBS用胶原酶，链霉蛋白酶和DNase管从上面的步骤1.1肉末肝纸浆。每个¼肉末肝重复。
- 广场管¼肉末肝纸浆和酶进入水浴37 ° C为45分钟用振动筛，在1-2次/秒。请用70％乙醇去除水浴前转移到层流罩后管。
- 此过程完成后，在层流罩。应变通过70微米筛网过滤消化肝脏浆收集到无菌培养皿。使用无菌DMEM培养液2毫升分装：10％热灭活胎牛血清的F12媒体，冲洗过滤器，并通过过滤器使用注射器的柱塞橡胶捣碎消化纸浆。重复5次，滤液约20毫升的总量。分成2等于15 mL管滤液。
- 完成所有转让应当在层流罩，并在4 ° C如果有使用冷冻离心机。离心为1分钟50 XG。保存上清＃1和丢弃实质颗粒。离心上清为1分钟50 XG＃1。保存上清＃2和丢弃沉淀。离心上清为1分钟50 XG＃2。保存上清＃3和丢弃沉淀。离心机最终上清＃3到8分钟取得非实质的分数为180 XG。
2。红细胞溶解
在层流罩，保持细胞的冷和使用的解决方案，冷却至4 ° C。
- 在手术前的夜晚，准备用1:10稀释用无菌蒸馏水稀释10倍浓度的股票屋宇署医药裂解缓冲的红细胞裂解液。 1X solutionshould存储30天，在4 ° C
- 在手术前的夜晚，准备Miltenyi缓冲区使用无菌PBS，0.5％牛血清白蛋白和2mm EDTA 。使用0.45微米的过滤器真空过滤机的过滤器解决方案。与原来的塑料盖盖翻车机单元的顶部，并用保鲜膜安全。 Storeentire过滤装置在4 ° C时12小时，德加EDTA的。过滤装置可以取代标准在12小时后的无菌帽。
- 此过程完成后，在层流罩。使用5毫升的无菌试管，再暂停上述步骤1.6到1毫升1X稀释的红血细胞裂解液从2.1以上非实质颗粒。第传输层流罩管。
- 轻轻为涡5秒和15分钟的孵育4 ° C避光。
- 在200 XG离心5分钟。
- 此过程完成后，在层流罩。丢弃上清液中裂解红细胞，并重新悬浮颗粒在1毫升的冰冷和无菌Miltenyi缓冲区。
- 在200 XG离心5分钟。
- 此过程完成后，在层流罩。弃上清，重新悬浮颗粒在1毫升的冰冷和无菌Miltenyi缓冲区。
- 取出10μLPBS细胞悬液，加入10μLtryan蓝色。使用血球计数remainingnon实质细胞。
3。 CD45的非实质的部分造血干细胞耗竭
在层流罩，保持细胞的冷和使用的解决方案，冷却至4 ° C。
- 暂停100μLMiltenyi每107个细胞的缓冲到108个细胞的细胞。
- 申请每107个细胞的20微升Miltenyi CD45微珠抗体，4℃孵育15分钟。
- 添加额外的2毫升Miltenyi缓冲区在200 5分钟XG，离心。去除上清液。重悬细胞沉淀1毫升Miltenyi缓冲液（细胞总数高达108）。
- 在层流罩，过滤器细胞使用Miltenyi劳工处磁列。通过放置在磁持有人（Miltenyi MidiMACS或QuadroMACS）列开始。将无菌5毫升管下面的过滤器捕捉滤液。准备列装载2毫升MilteNYI缓冲区。
- 预过滤器洗完成后，加载到ld列细胞。一旦列内的细胞悬液，加入1 ml Miltenyi缓冲区和重复1毫升Miltenyi缓冲液洗2次。不要使用列提供的柱塞，以提高过滤速度。只收集滤液在过滤器时，放置在磁座。
- 离心收集约5毫升滤液CD45 -枯竭的非实质细胞在5分钟的200 XG（列持有余下的1毫升）。放弃与保留CD45阳性细胞列。
4。流动CD133阳性细胞的流式细胞仪隔离
- 准备卵圆细胞媒体。使用1:1的DMEM：F12培养液，10％热灭活胎牛血清为基础，并添加胰岛素（1微克/毫升），HEPES（5 mol / L的），和青霉素/链霉素（1％体积/体积）。使用0.45微米的过滤器真空过滤机的过滤器解决方案。
- 暂停Miltenyi缓冲液100μL，每10 7细胞的细胞。加入2μLCD133 - PE标记的抗体。使用第二组的细胞，与孵化的IgG - PE标记的抗体作为对照。作为一个未染色的流式细胞仪控制染色无保留的细胞的第三组。
- 在4 ° C为15分钟，在黑暗中孵育。重新暂停在2毫升染色缓冲。在200 XG离心5分钟。弃上清，重新悬浮颗粒在1毫升Miltenyi缓冲区。
- 这一步是使用标准的流式细胞仪检测细胞分选程序，这可能是机构具体进行。使用未染色的细胞和IgG PE染色细胞，调整优化浇注的CD133 +细胞群的排序参数。 PE（R - Phytoerythrin），一般都可以用任何的流式细胞仪，激光发出波长为488。 PE峰值发射575纳米，在FL - 2通道检测。
注意：使用细胞与数据收集任务方案的一个BD流式细胞仪刀魂或BD FACS Vantage的机器，我们使用着散射和侧日志规模的分散，以期查明侧散射的细胞群，设置为250。 FL1和FL2日志规模，并设置为550。这些参数提供一个初始的地方查看肝脏非实质细胞，调整需要根据染色强度的正面和负面的人口。 - 分离的CD133 +细胞群中使用的CD133 +门，收集细胞，在无菌过滤的细胞介质。
5。细胞培养方法
- 在5分钟的200 XG离心机流式细胞仪收集细胞。重悬细胞卵圆细胞介质中的颗粒细胞每毫升约5000。与高浓度的五月开始，多达50,000个细胞/毫升最初的实验，并减少技术的提高和整体细胞活力和产量提高。
- 到BD Biocoat层粘连蛋白细胞涂层板96孔板，使用1000个细胞 /厘米2。加湿细胞培养孵化器在37 ° C，5％的CO 2 。 24小时后，加入肝细胞生长因子（50毫微克/ NL）和表皮生长因子（20毫微克/毫升）。
- 对于单个细胞，分离到50μL卵圆细胞介质的细胞直接在每孔96层粘连蛋白涂层板。使用严格的选择只有一个阳性细胞的单细胞流式细胞仪设置。 24小时后，加入50μL的卵圆细胞与肝细胞生长因子和表皮生长因子媒体，在上面的步骤5.2。更改后5-7天，充分的媒体。
- 一旦扩大殖民地大于50％的融合，这通常会出现2周后，根据细胞总数镀细胞活力，细胞可能会被分割为1:3以下。
- 拆分单元格，使用胰蛋白酶0.05％的EDTA的。就足以覆盖井底，50〜100μL/孔96孔板申请。在孵化器在37 ° C时3-5分钟。
- 每孔100μL媒体和所有的液体转移至5 ml管。加入1 mL每管和离心5分钟，在200 XG媒体。
- 重新暂停在媒体层粘连蛋白涂层盘板的细胞，用细胞以及从1到3口新井（1:3）板。
6。用RT - PCR双向潜在状态的确认
此过程的详细的RNeasy协议手册，该手册提供的RNeasy试剂盒。
- 使用96孔板殖民地的RNeasy微型列。从每孔吸文化传媒。直接向每孔加入75μL缓冲的RLT的RNeasy试剂盒。无菌橡胶警察刮盘底。 Pipettelysate到微量离心管和旋涡混合1分钟。裂解液中添加70％的乙醇混合吹打。
- 传输解决方案的RNeasy列放置在一个2 ml收集管中（如提供的RNeasy试剂盒），在微型离心机以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱滤液。
- 再利用收集管。添加350μL缓冲液RW1（的RNeasy试剂盒）以10,000 rpm的RNeasy列和15秒的离心洗列膜。丢弃洗脱洗。
- 加入10μL的DNA酶我70μL的缓冲区的RDD（包括提供的RNeasy试剂盒）股票的解决方案。脱氧核糖核酸酶80μL我缓冲区的RDD孵化混合添加的RNeasy列膜在室温下15分钟的孵育。
- 添加350μL缓冲RW1的RNeasy试剂盒的RNeasy列和洗膜以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱清洗和收集管。
- 放置在一个新的2 ml收集管中的RNeasy试剂盒中提供的RNeasy列。加入500μL的缓冲视网膜色素上皮的RNeasy试剂盒的RNeasy列和洗膜以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱洗。
- 准备80％的乙醇，使用无RNase水的RNeasy试剂盒。加入500μL80％乙醇的RNeasy columnand离心机以10,000 rpm 2分钟。丢弃洗脱洗。
- 将全速5分钟的RNeasy列在一个新的2ml收集管（的RNeasy试剂盒）和离心机。丢弃任何洗脱清洗和收集管。
- 将在一个新的1.5 ml收集管中的RNeasy的列（的RNeasy试剂盒）。加入14μL无RNase水的RNeasy试剂盒列膜和离心1分钟全速中心。收集滤液与纯化的RNA转移到冰，如果创建的cDNA立即或存放在零下80℃，以供将来使用。
- 反转录使用Omniscript.Dilute核糖核酸酶抑制剂的终浓度为10单位/μL，在冰冷的1X缓冲液RT。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。根据Omniscript协议第13页，准备上冰的一个新的主组合。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。推荐给准备了mastermix量10％以上为所有反应所需的总要求。
- 包含主结构的个别管加入模板RNA。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。 60分钟在37 ° C。
- 使用HotStarTaq DNA聚合酶的肝细胞（白蛋白）和胆管的特定基因的PCR扩增。准备反应HotStarTaq协议的书，每页15混合。引物浓度为20分/μL稀释股票推荐，并正向和反向引物1μL/反应管。根据最初用于RNA提取的细胞数，我们建议分3个反应管（装载控制的β-肌动蛋白 ，白蛋白，和KRT19）最终的cDNA开始。
- PCR引物设计是列于表1。
- 放入热循环反应管。推荐下列程序进行初步的实验：95℃保温15分钟× 1周期，95 ° C为30秒，55 ° C，持续30秒，72 ° C 30秒× 35次，72℃10分钟。
- 使用溴化乙锭浸渍琼脂糖凝胶电泳PCR产物分析。
7。确认的CD133 +干细胞肿瘤的潜力
- 此过程可以用新鲜分离的细胞从第4步或使用已经从第5步培养细胞。我们建议执行最初的实验中培养的细胞，如新鲜分离的细胞会减少的生存能力和降低产量。
- 从上面的步骤5.5使用胰蛋白酶0.05％的EDTA的Trypsinize细胞。经过3-5分钟的潜伏期在37 ° C，添加100μL的媒体，每孔和转移所有的液体，个别5毫升的管（1 = 1管）从每口井。添加1毫升媒体，每管和离心5分钟，在200 XG。
- 在1 mL冰冷的PBS重悬细胞。取出10μLPBS细胞悬液，加入10μL台盼蓝。利用台盼蓝拒，确定活细胞的数量。如果使用流式细胞仪分离出的细胞，细胞数量将由流式细胞仪隔离计数。
- 离心机在200 XG细胞5分钟，重新悬浮在PBS浓度在1 × 10 6活cells/100μL。添加100μL基质胶。六周龄免疫缺陷的裸鼠皮下注射使用28 gague针。在每个站点200μL注入1 × 10 6细胞。
- 小鼠每日监测肿瘤生长。一旦肿瘤形成，通常3-4周的潜伏期后，，肿瘤体积测量用游标卡尺（高x长x宽）。
8。代表性的成果：
从正常，健康的小鼠肝，预期的CD133 +肝脏干细胞的细胞产量是1000到5000每肝。这些细胞是静态肝脏中比较少见的，并不会扩大在文化。我们不建议使用单细胞分析正常肝和可行的细胞，将扩大产量极低。
对于肝脏慢性损伤显著，如饮食6周1或基因改造，造成慢性损伤，如在MAT1a DDC的0.1％， - / -或肝具体PTEN - / -小鼠，2-4 CEL预计数LS孤立的增加，与隔离高达10万细胞/肝（图2）。如果使用遗传模型，自发肿瘤率的知识是至关重要的，因为肝脏干细胞的分离这些程序应进行无瘤动物。例如，如果MAT1a - / -模型的形式在18个月的自发肿瘤，我们推荐使用动物不迟于15-16个月之前，任何报道的自发肿瘤。
从单细胞慢性损伤模型的分离，将产生几个（3-9 colonies/96孔板）殖民地，扩大了从单细胞的过程是掌握了一次，是保证细胞活力。图3从单一的CD133 +细胞扩大后7天的菌落目前代表相衬图像。
使用白蛋白和Krt19 RT - PCR技术进行双向潜在状态的确认。扩大单细胞克隆将展示既表达肝细胞标记（ 白蛋白 ）和胆管（Krt19）。图4演示了由三个独立的殖民地的双向潜在的表达，与大约25个细胞/ 7天的殖民地。
CD133 +干细胞从正常肝和化学性肝损伤（如DDC 0.1％，连续6周的饮食）不会在裸鼠体内形成肿瘤。 CD133 +从特定的遗传模型（MAT1a - / -或肝具体PTEN - / -小鼠）的干细胞在裸鼠 体内形成肿瘤中晚期肿瘤的慢性损伤的阶段，如果孤立后期。这种肿瘤形成的表型是目前确定为一个癌症干细胞，例如2-4，MAT1a - / -小鼠的形式在18周龄自发性肝肿瘤。 CD133 +孤立于15-16周期间晚期肝病的慢性损伤的阶段，肝脏干细胞，将在裸鼠体内形成肿瘤。图5展示了代表双边注射1 × 10 6从单一的CD133 +肝脏干细胞的体外扩增细胞肿瘤。
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| β-肌动蛋白 | 5' - TGTTACCAACTGGGACGACA - 3' | 5' - GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA - 3' |
| 白蛋白 | 5' - CATGCCAAATTAGTGCAGGA - 3' | 5' - GCTGGGGTTGTCATCTTTGT - 3' |
| 角蛋白19 | 5' - TGCTGGATGAGCTGACTCTG - 3' | 5' - AATCCACCTCCACACTGACC - 3' |
表1：用于RT - PCR引物设计
图1：整体方法的原理图。
图2：CD133 +高度富集CD45的枯竭非实质部分肝脏干细胞确定的控制未受伤的野生型小鼠肝演示了0.4％的CD133 +细胞内的高度富集CD45的枯竭非实质部分。在基因敲除MAT1a - / - ，这是一种慢性肝损伤模型，CD133的人口扩大了10倍或高浓缩铀的相同比例。
图3：扩大从单一的CD133 +克隆的克隆阶段对比度的图像，从单一的CD133 +细胞层粘连蛋白包被96孔板扩大的四个殖民地。
图4：双向潜在基因表达的CD133 +肝干细胞克隆扩大殖民地 ，第7天，菌落约25细胞。基因表达，表明肝细胞标记白蛋白和胆管标记 Krt19的表达，证实BI - CD133 +细胞的潜在状态。
图5：CD133 +，肝脏干细胞在裸鼠 体内形成肿瘤的箭头指示肿瘤增长4个星期后，1 × 10 6的CD133 +细胞注入从MAT1a - / -模型。。 CD133 +细胞毒素引起的慢性肝损伤，如四氯化碳或0.1％DDC的饮食，不形成肿瘤。肿瘤的形成是用来识别恶性潜能，或在癌症干细胞表型的干细胞群。
Discussion
与造血系统，造血干细胞是负责维持细胞分化系统replacesnormal生理回合以上的白细胞，红细胞，血小板，肝干细胞，或成人肝脏祖细胞，不参与正常肝的动态平衡。急性肝损伤或肝部分切除术，肝，后5,6分化肝上皮，经过几轮的扩散，以取代失去的肝质量。5,6在慢性损伤，只有肝脏干细胞中观察到的增殖 。1,5建议-11，这些成人，器官特异性干细胞分化成肝细胞和胆管。1,5-8有趣的是，绝大多数肝癌的发展背景上的慢性损伤，从而也假设是肝脏干细胞肝癌的一个子集的前兆。2-4,12-17
肝脏干细胞工作的重大挑战之一，是罕见的细胞种群隔离功能分析。例如，在肝细胞内的绝大多数，这是明显高于胆管和其他较小的非实质细胞的肝细胞。打破全肝细胞间（大肝 - 实质的一小部分，更小的单元 - 非实质分数），并进一步为阴性细胞CD45（非造血细胞）的选择，我们能够以丰富的干细胞开始人口超过600倍。注1,18-21，我们表明的CD133 +人口是100％纯干细胞的人口，但显然是一个异质性的细胞人口与不同的血统和复育潜力，没有手段。该领域的主要限制之一是干细胞和祖细胞的定义。在这项工作中我们更广泛地使用“干细胞”一词，但在严格的定义，CD133 +非实质细胞代表一个双向系祖人口。鉴于目前在肝脏中的干细胞和祖细胞的研究状况，本报告提供了在这一领域有兴趣的调查开始的地方。由于出现新的标志物，如EpCAM的，22,23或转录因子，如Sox9的，24，它们可以被纳入。例如，我们已经找到了EpCAM的+细胞和CD133 +细胞之间的重叠率相当高。
在这份报告中，我们从正常小鼠肝以及慢性肝损伤模型，这表明增加肝脏干细胞增殖的干细胞的分离过程。这种方法具有明显的优势超过标准的冻结或福尔马林固定肝免疫组织化学使用活细胞的功能研究后才能进行隔离。1,3,4这一过程的具体目标是孤立的肝脏干细胞，它可以的相对纯净的人口在体外克隆扩大。
此过程的主要限制因素是，大多数分离的细胞不会被可行后，流式细胞仪（见故障排除部分）。这是准备细胞所需的时间，并隔离前需要完善的人口众多的程序。如果肝脏立即流式细胞仪分析单细胞悬液，消化，肝细胞和其他非实质细胞之间的大小差异不可能有效的流式细胞仪门创造。如果利用没有消除造血细胞，肝非实质细胞，是有风险的，CD133 +细胞的显著的数量可能造血起源可能污染的分数。此外，通过Miltenyi过滤器处理的细胞，只有单个细胞和细胞非常小的集群收集。这将确保样本不会阻塞流式细胞仪摄入针。
此过程的替代品包括任何其他的细胞表面标志，如CD49f，EpCAM的修改，或标记，如CD133 + EpCAM的组合+第二次公布的报告采用了密度梯度分离肝脏干细胞，从非实质部分。这个过程需要一个超离心机（8000 XG），增加了大量的时间的程序，并在我们的经验，显着降低预流式细胞仪细胞产量和后流式细胞仪的可行性8。
未来的实验包括基因表达分析的范围更广，包括如HNF3，HNF4α，αfp.In此外，胎肝基因表达蛋白的免疫细胞化学，免疫印迹分析和可利用RT - PCR结果证实细胞培养。
要注意的一个问题是最近的工作，确定对肝星状细胞CD133的表达。，我们现在常规屏幕星状细胞的标记我们的样本（见故障排除部分），并没有ID在我们的分数entified显著污染。这可能与肝的消化和细胞分离的不同的技术。 2,3,26
的事实，大多数的细胞不会被流式细胞仪隔离后立即可行的基础上，我们建议，这些细胞被镀，无论是作为散装CD133 +细胞或单细胞，在使用前在动物身上。在体外培养5-7天，将显着提高肿瘤的分析结果。此外，由于单细胞分离的考验，这应该只进行一次殖民地可以从散装的CD133 +分离的细胞扩大。一个更深入的讨论，各种文化条件和骨架蛋白，可利用文化肝脏干细胞和祖细胞得到了很好的特点萝拉里德。 27,28博士这项工作提供了替代的条件和修改，纳入到他们的研究计划，调查人员可能一次都掌握了基本的隔离技术。里德的工作，还提供了一个宗族生物学和肝脏的干细胞，并承诺祖细胞的成熟之间更详细的分析。
在体内肿瘤分析方面，我们已经成功地使用新鲜分离的细胞和细胞克隆扩大的CD133 +细胞在体外 ，主要是用1 × 10 6细胞。我们一直专注ontwo慢性肝损伤的遗传株，MAT1a - / -和肝脏具体PTEN - / -小鼠，我们已经利用裸小鼠和野生型小鼠的肿瘤生长的主机。在我们的经验，CD133 +肝脏干细胞的唯一形式，如果他们是从显著，是癌前病变的肝损伤模型中分离肿瘤。请注意，从CD133的形成肿瘤一般有肝癌，胆管癌的特点，这表明干细胞或祖细胞来源的肿瘤细胞。2-4,29
记录肿瘤后的后续工作，包括标准的肿瘤组织（H＆E染色）和免疫组织化学染色病理分析。此外，肿瘤可肉末和消化FACS分析或重新培养。2-4,30
总之，我们有详细的隔离，扩建和CD133 +肝脏干细胞和CD133 +肿瘤干细胞的基本特性的程序。
故障排除：
CD45的污染：
第3步，如果污染的CD45 +细胞，它可以被加入一个CD45 - FITC标记抗体流式细胞仪分析和隔离前评估，检查，在CD45微珠抗体是不会过期和滤液是只有在收集的过滤器是在磁座。任何滤液收集，而过滤器是没有磁性的持有人将含有CD45 +细胞。
低细胞数量：
对于未受伤的肝，CD133总数+非实质隔离可能小于10,000。这些细胞是在静态的肝脏罕见。 DDC的0.1％的饮食，如对于慢性损伤模型，这一数字将大大增加，到10万细胞。如果总细胞数显著低于这些数字，要考虑的一个问题是流式细胞仪抗体染色。检查以确保CD133的抗体是没有过期，染色差将导致在一个贫穷的产量。另外，我们建议进行肝脏非实质细胞的流式细胞仪分析，以确定人口相对前试图流式细胞仪隔离。
低格后，流式细胞仪的可行性：
可行性的问题之一，可能与细胞是如何处理和在什么时候。理想的情况下，整个细胞的分离过程，步骤1-4，应该进行的步骤之间没有任何拖延，并在同一天完成。步骤1-4之间的任何显著的延迟将大大降低细胞活力。第二个问题，涉及到细胞的活力，可能与用于流式细胞仪隔离鞘压力。我们建议使用一个较低的鞘压力。最后，一旦细胞是孤立的，他们应该立即镀，任何对排序后的冰显著存储也将减少的可行性。
CD133 +非实质的异质性：
最近的报告表明，肝星状细胞也可能有CD133的表达，并有一定的可塑性。25因此，除了验证双向药性基因与白蛋白和Krt19，额外的验证可以包括与星状细胞，如神经胶质纤维酸性蛋白，相关的基因静态星状细胞和激活的星状细胞α-平滑肌肌动蛋白和结蛋白。3,4,26此外，CD133 +人口代表了更广泛的祖人口。第二个标志，如EpCAM的，除了可能有助于进一步完善人口和限制的异质性。
Disclosures
朗特里博士收到来自拜耳制药研究的支持。博士。丁和骗子和党女士和女士VanKirk没有披露报告。
Acknowledgments
朗特里博士承认，国立卫生研究院儿童奇迹网络，K08DK080928和R03DK088013，和美国癌症协会的研究学者奖，镁11651当前的支持。朗特里博士承认此过程最初是开发和完善，同时由儿科科学家发展计划（NICHD的补助金K12 - HD00850）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma-Aldrich | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche Group | 1088874 | |
| Pronase | Roche Group | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher Scientific | 352350 | |
| Omniscript RT | Qiagen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Qiagen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD Biosciences | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 50 columns for 5x105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | 10X concentration |
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