Summary
La tecnica di dissezione illustra enucleazione dell'occhio mouse per il fissaggio del tessuto per eseguire fenotipizzazione in alto throughput schermi.
Abstract
L'occhio del mouse è un importante modello genetico per lo studio traslazionale di malattia oftalmica umana. Blinding malattie negli esseri umani, come la degenerazione maculare, degenerazione dei fotorecettori, cataratta, glaucoma, retinoblastoma, e la retinopatia diabetica sono stati ricapitolati in topi transgenici. 1-5 topi transgenici e knockout La maggior parte sono stati generati da laboratori per studiare non oftalmiche malattie, ma conservazione genetica tra sistemi di organi suggerisce che molti degli stessi geni possono giocare un ruolo nello sviluppo oculare e malattia. Quindi, questi topi rappresentano una risorsa importante per la scoperta di nuove correlazioni genotipo-fenotipo negli occhi. Poiché questi topi sono sparsi in tutto il mondo, è difficile da acquisire, mantenere e fenotipo in un efficiente e conveniente modo. Così, la maggior parte delle high-throughput schermi fenotipizzazione oftalmiche sono limitate a poche sedi che richiedono in loco, esperienza oftalmico per esaminare gli occhi in topi vivi. 6-9 Un approccio alternativo sviluppato dal nostro laboratorio è un metodo per l'acquisizione remota tessuto che può essere utilizzato nelle indagini grandi o piccole dimensioni di occhi di topi transgenici. Procedure standardizzate per il video a base di trasferimento di competenze chirurgiche, fissaggio del tessuto, e la spedizione di consentire il laboratorio di raccogliere gli occhi interi di animali mutanti e li inviano per fenotipizzazione molecolare e morfologico. In questo articolo video, vi presentiamo le tecniche per enucleare e trasferire sia non fissata e la perfusione del mouse occhi fissi per le analisi fenotipizzazione remoti.
Protocol
1. Scollamento: enucleazione dell'occhio mouse in campioni non fissati
- Separare le palpebre per migliorare l'esposizione e l'accesso al mondo posteriore (bulbo oculare) di superficie.
- Posizionare una pinza curva medicazione dietro (sotto) il globo in orbita (cavità oculare). Il Mahajan Sharptip medicazione pinza è uno strumento personalizzato con punte appuntite per rendere questo passaggio più facile (vedi materiali e reagenti tabella).
- Chiudere la pinza e afferrare il tessuto connettivo orbitale e del nervo ottico dietro il globo facendo attenzione a evitare di comprimere il mondo.
- Estrarre delicatamente la pinza verso l'alto e cogliere il bulbo oculare dall'orbita. Il bianco filiforme tessuto è il nervo ottico.
- Posizionare l'occhio in PBS. Utilizzando un ago da 30 gauge, effettuare una singola puntura ferita immediatamente posteriormente al limbus, inserendo l'ago di 1-2 mm nel bulbo oculare. Questo permette fissativi, come glutaraldeide, che sono comunque in grado di penetrare il tessuto oculare, direttamente a enter l'occhio. Creazione di questo puntura può non essere necessario se un fissativo, come paraformaldeide o alcool, è in grado di diffondere nei tessuti oculari di interesse.
- Posizionare l'intero occhio immediatamente in fissativo per la fissazione immersione.
2. Sharp Dissection: enucleazione della fissazione del mouse perfusione degli occhi seguenti
- Utilizzare una curva colibri pinza per tenere la palpebra lontano dal mondo.
- Orient curve Westcott forbici dissezione parallele al mondo, mentre volti verso la parte posteriore dell'orbita.
- Tagliare il tessuto fissato connettivo che circonda il globo dagli inferiori, mediale, i lati superiore e laterale.
- Posizionare la pinza curva dietro il globo, afferrare il tessuto connettivo senza premere sul globo, e tirare avanti per enucleare l'occhio. Poiché il tessuto connettivo orbitale è rigida da fissazione perfusione, taglio aggiuntivo di tessuti orbitali può essere necessario rilasciare completamente la globe.
3. Fissazione e imballaggio
Spedizione dei tessuti fissi deve seguire le vostre esigenze di servizio istituzionali e postali, tra cui etichette e imballaggi appropriati. Il protocollo seguito è un esempio di spedizione di un non infettiva campione biologico a temperatura ambiente. Ciò richiede 3 strati di imballaggi, ma non di classe Una sostanza / B biologica o etichette di azoto liquido.
- Posizionare l'occhio in un 5 ml flaconcino di vetro scintillazione con almeno 3 ml di fissativo, o post-fissativo buffer se la fissazione è breve. Scrivere il numero di inseguimento sul coperchio del flaconcino e sigillarla con Parafilm.
- Inserire fiale di scintillazione in un campione biologico approvato container. Nel nostro istituto, per esempio, contenitori approvati richiedono tre strati: un contenitore chiuso in cui è posto il campione, uno strato intermedio assorbente e uno strato protettivo esterno.
- Mettere il recipiente in una bolla-wrap pacchetto e poi in un appvagava container laboratorio con documentazione appropriata.
4. Risultati rappresentativi
Esame istologico degli occhi può essere eseguita da una varietà di metodi compresi ematossilina ed eosina colorazione, rilevamento espressione enzimatica, microscopia elettronica a trasmissione, e immunoistochimica. Seguendo fissazione immersione in paraformaldeide al 4%, il tessuto è stato incorporato in paraffina e sezionati con un microtomo. In high-throughput fenotipizzazione, analizziamo pupilla ottica sezioni nervose che tutti i tipi di campioni dei tessuti oculari (Figura 1). Sezioni di tessuto sono stati esaminati per l'espressione lacZ (Figura 2), microscopia elettronica a trasmissione di organelli cellulari (Figura 3), e l'espressione di molecole con anticorpi specifici (Figura 4).
Nel nostro metodo di screening fenotipo, non era importante mantenere l'orientamento dell'occhio rispetto al nasale (canto mediale) e temporale (Lateral canto) lati. Ci sono almeno due opzioni se orientamento occhio è necessaria. Dopo enucleazione, abbiamo applicato cauterizzazione luce alla cornea temporale nella posizione 03:00 con un dispositivo portatile cauterio. La lesione è evidente all'esame istologico e non perdersi durante la lavorazione come gli inchiostri istologici. Il rovescio della medaglia è che i danni cauterio la cornea, che può essere un tessuto fondamentale per l'esame. L'altra opzione richiede un anatomista esperto in grado di identificare le inserzioni muscolari extraoculari. Allo stereomicroscopio, identificazione di inserimento inferiore e superiore muscolo obliquo segna l'aspetto inferiore e superiore e del globo. 3 Con entrambi i metodi di orientamento, è importante monitorare il campione come un occhio destro o sinistro. Insieme, questo permetterà l'orientamento esatto mondo prima del sezionamento.
Figura 1. Immagini dell'occhio mouse istologici afte r acquisizione remota. occhi del mouse sono stati enucleati dalla dissezione netta seguendo fissazione perfusione con paraformaldeide al 4%. A. alunni-sezione del nervo ottico colorato con ematossilina e eosina mostra la conservazione di tutte le sottostrutture dei tessuti. ON, nervo ottico. (Barra della scala verde = 500 micron) B. Un punto di vista più alto ingrandimento della retina normale mostra la sua struttura laminare: RGC, cellule gangliari della retina, IPL, strato interno plessiforme, INL, strato nucleare interno, OPL, strato esterno plessiforme; ONL, esterno strato nucleare (cellule fotorecettrici) (freccia), IS, segmenti interni dei fotorecettori (punta di freccia), sistema operativo, segmenti esterni dei fotorecettori, RPE, epitelio pigmentato retinico, C, coroide. (Barra della scala verde = 50 micron) C. Rispetto alla retina normale, questo modello è più sottile a causa della degenerazione dei fotorecettori. Il ONL, IS e OS sono completamente assenti (freccia). (Scala bar verde = 50 micron)
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Figura 2. Espressione lacZ in topi transgenici. Occhi sono stati enucleati per via smussa e immerso in 1 mg / ml di X-gal soluzione (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 , e sodio desossicolato 0,1%) per una notte a 37 ° C. Occhi sono stati fissati in glutaraldeide al 2% formaldehyde/0.2% per 30 minuti e sezionato con un microtomo. X-gal prodotto (blu) etichette: A. epitelio ciliare, epitelio corneale B., C. e la cellule gangliari della retina (RGC) strato nella retina. INL, strato nucleare interno; ONL, strato nucleare esterno.
Figura 3. Microscopia elettronica a trasmissione di epitelio pigmentato retinico (RPE). Dopo scollamento e la creazione di una puntura, gli occhi fissi ad immersione nel 2,5% paraformaldeide / 2,5% glutaraldeide in tampone fosfato di sodio 0.1M. Gli occhi erano di secondadarily fissato textroxide osmio 1%, a poco a poco disidratati, ed inclusi in resina di Spurr. Tessuto era sezionati a 90 nm e posto su griglie di rame rivestite in scanalatura formvar e ripreso con un microscopio elettronico a trasmissione. La micrografia mostra, segmenti esterni dei fotorecettori della retina neurosensoriale, melanosomi (M) all'interno dell'epitelio pigmentato retinico e della membrana di Bruch.
Figura 4. Etichettatura immunoistochimica di superossido dismutasi-3 (verde) nel vitreo mouse. Gli occhi sono stati enucleati per via smussa ed ha subito la fissazione immersione in paraformaldeide al 4%. Sono stati inclusi in paraffina e sezionati con un microtomo. Le sezioni di tessuto sono state incubate con un anticorpo policlonale di coniglio SOD3 antisiero diluito 1:50. SOD3 espressione è stata rilevata usando un anti-rabbit IgG di capra (H + L)-Alexa Fluor 488 anticorpo secondario coniugato. Etichettatura di SOD3 è mostrato in green.
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Discussion
La maggior parte dei topi transgenici esistono in laboratori che non esaminano gli occhi. La nostra tecnica video illustra un metodo semplice e standardizzato per il trasferimento remoto abilità chirurgica per ottimizzare l'acquisizione tessuti da laboratori con poca esperienza con gli occhi. Questa tecnica video aiuta superare un trabocchetto importante in high throughput fenotipizzazione, che è l'uso di un numero limitato di siti esperti dovuti a non standardizzato di raccolta dei tessuti e fissazione metodi che impediscono significativi studi comparativi fenotipici e molecolari. Per stabilire e mantenere il controllo di qualità con qualsiasi nuovo laboratorio remoto e tecnico, è importante comprendere wild-type occhi all'inizio e periodicamente durante lo studio. Abbiamo anche trovato che un sistema di monitoraggio è importante quando gli occhi multipli da genotipi multipli sono state trasferite, come ad esempio un sistema web-based per assegnare un numero di identificazione unico per ogni occhio. Sebbene fissazione qualità superiore e successive sezioni di tessuto sono ottenuti conperfusione-fissi animali, troviamo che i campioni enucleate da animali non fissate sono sufficienti per la maggior parte degli studi morfologici e molecolari. Inoltre, l'acquisizione di occhi di animali non fissati possono essere molto più facile da elaborare in high-throughput studi provenienti da fonti diverse. I topi transgenici sono uno strumento importante per lo studio delle malattie umane oftalmica, 10, 11 e acquisizione dei tessuti a distanza per fenotipizzazione locale fa la maggior parte di questa preziosa risorsa. L'applicazione di una strategia simile per la dissezione dei tessuti e la condivisione possono avere un impatto importante sul high-throughput fenotipizzazione di non-tessuti oftalmici.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca per prevenire la cecità; Bartly J. Mondino MD, direttore del Jules Stein Eye Institute, UCLA, e Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui bianco, e Jeanne Estabel presso l'Istituto Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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